恶性疟原虫非编码RNA的研究进展

疟疾依然是世界上严重危害人类健康的3大传染病之一。在5种导致人类疟疾的疟原虫中,恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)毒力最强、致死率最高。研究表明,红内期恶性疟原虫能够逃避宿主免疫系统,与其抗原编码基因的互斥性表达密不可分,这依赖于其发育过程具有精密的基因表达调控机制。目前对其基因表达调控机制研究尚不够深入。已有研究发现,恶性疟原虫中具有丰富的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),其中一部分ncRNA已被证实在恶性疟原虫生长发育和致病过程相关的基因表达调控中发挥着重要作用。本文就近年恶性疟原虫相关ncRNA的功能研究进展进行综述,以加深对疟原虫基因表达调控机制的理解,从而为疟原虫致病的分子机制研究提供理论基础。     

激光捕获显微解剖富集肝内期恶性疟原虫供mRNA分析

肝内期恶性疟原虫是疫苗诱导保护性免疫反应和疟疾治疗的重要靶位。目前,对疟原虫肝内期发育的基因表达谱几乎一无所知。运用近年发展的DNA微阵列技术,进行基因表达分析,再结合恶性疟原虫基因数据库,可测定疟原虫期特异基因表达谱。经这种分析现已鉴定了有性和无性血液期的不同基因的表达。然而,类似的肝内期基因表达的测定,因肝细胞内感染低,仅能抽提到非常低的虫体RNA而受阻。为解决这一问题,在抽提RNA前受感染肝细胞必须密集。激光捕获显微解剖法(LCM )在病理学打开了一个新的前景,可从不同组织中精确、可靠地取单个细胞作遗传学或…     

恶性疟原虫FCC1/HN株3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的序列测定

3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)是疟原虫糖酵解过程中重要的酶 ,其基因最近被发现 [1 ]。本文报告恶性疟原虫 FCC1/HN株 GAPDH基因序列测定结果。1　材料与方法1.1　虫株恶性疟原虫 FCC1/ HN株在本室长期保种 ,体外培养参照Trager等 [2 ]方法并略作改进 [3]。1.2　基因组 DNA的提取取 5 0 μl培养物 ,按文献 [4 ]方法用 5 %磷酸钠盐溶液提取 ,最后溶于 5 0 μl DEPC- H2 O中。1.3　提取总 RNA收获培养物中的环状体期疟原虫 (1× 10 9以上 ) ,用 RNA提取试剂盒 (采用 TRIZOL试剂盒 ,Gibco,BRL )抽提总RNA,紫外分光光度计测…     

RNA干扰抑制恶性疟原虫的生长

RNA干扰 ( RNAi)是一种干扰基因表达和进行功能性基因组筛选的方法。RNAi借助转录后的加工特异性抑制靶 m RNA生成 ,并导致特异性蛋白合成的减少。本实验中 ,RNAi的靶点是编码二氢乳清酸脱氢酶( DHODH)的基因片段 ,用编码 DHODH的ds RNA进行干扰。DHODH是嘧啶生物合成中的一种酶 ,对疟原虫生长非常重要 ,抑制DHODH的表达预计可干扰疟原虫的生长。本实验选用恶性疟原虫单链 RNA,编码恶性疟原虫环子孢子蛋白 ( Pf CSP)的和编码刚地弓形虫二氢叶酸还原酶胸苷酸合成酶( Tg DHFR)的 ds RNA作阴性对照 ,并且对编码恶性疟原…     

利用sgRNA串联表达框架编辑恶性疟原虫K13和NUP116基因的研究

目的利用单链引导RNA(sg RNA)串联表达框架编辑恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)K13和NUP116基因。方法根据恶性疟原虫K13和NUP116基因序列设计引物,PCR扩增K13和NUP116基因的同源臂,并引入突变位点。PCR串联基因K13和NUP116的sg RNA,将同源臂和串联的sg RNA与载体p L6cs连接,构建用于电击转染实验的载体p L6-K13-NUP116,将其与表达Cas9蛋白的质粒一同通过电击转染法,转入恶性疟原虫体内,利用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统对基因进行编辑修饰,通过筛选药物二氢叶酸还原酶抑制剂(WR)和杀稻瘟菌素(BSD)筛选转基因疟原虫,提取转基因疟原虫的基因组,对其进行PCR检测,最终通过测序鉴定K13和NUP116基因是否成功被突变修饰。结果 PCR扩增出K13和NUP116串联的同源臂(K13全长557 bp,NUP116全长569 bp)以及串联的sg RNA,与载体p L6cs连接后成功获得用于电击转染实验的表达载体p L6-K13-NUP116。电击转染后通过药物筛选转基因疟原虫,培养至第28天涂片镜检发现疟原虫。PCR检测结果显示,转基因疟原虫K13和NUP116基因突变修饰成功。测序表明,K13和NUP116基因的目标位点被成功突变。结论基于CRISPR/Cas9编辑技术的串联sg RNA表达载体可同时对恶性疟原虫K13和NUP116基因进行编辑。     

激光捕获显微解剖富集肝内期恶性疟原虫供mRNA分析

肝内期恶性疟原虫是疫苗诱导保护性免疫反应和疟疾治疗的重要靶位。目前，对疟原虫肝内期发育的基因表达谱几乎一无所知。运用近年发展的DNA微阵列技术，进行基因表达分析，再结合恶性疟原虫基因数据库，可测定疟原虫期特异基因表达谱。经这种分析现已鉴定了有性和无性血液期的不     

恶性疟原虫红内期不同发育阶段PfRON4基因转录水平分析

目的 分析恶性疟原虫棒状体颈部蛋白4基因（PfRON4）在红内期不同发育阶段的转录水平。 方法 用山梨醇结合等渗细胞分离液（Percoll）对实验室体外培养的恶性疟原虫进行均一化处理, 收集间隔为6 h不同发育阶段的疟原虫, 提取RNA。根据PfRON4基因及相关基因(PfAMA1和PfRhopH2)的序列设计特异性引物, 构建标准质粒并制作标准曲线, 对PfRON4及相关基因的mRNA进行定量检测分析。 结果 纯化并同步后的疟原虫生长发育较为同步均一, 用于定量分析的标准曲线相关性较好, PfRON4、PfAMA1和PfRhopH2的相关系数（r值）分别为-1.00、-0.98和-0.98。产物熔解曲线分析结果均显示为单一波峰。定量分析结果显示, 在恶性疟原虫红内期发育过程中, PfRON4基因的转录水平在裂殖子入侵红细胞后36～40 h（即成熟裂殖体阶段）达到高峰。 结论 恶性疟原虫PfRON4基因在成熟裂殖体阶段高表达。     

供体内研究用的恶性疟原虫和间日疟原虫红内期的冰冻保存法

曾经报道不用保护剂或用甘油或二甲基亚砜作保护剂冰冻保存恶性疟原虫红内期。本文报道用含7.5%甘油的Alsevers溶液低温保存恶性疟原虫和间日疟原虫红内期的结果。这种新的保护剂含有9份Alsevers液和1份甘油。以1.5ml分装于一种特制的小管内,高压消毒后,贮存5℃备用。冰冻时每管加入0.5ml抗凝含虫猴血,混匀,先置于含酒精的干冰中速冻,而后将小管贮存于-70℃冷冻箱,以供体内研究用。复苏时,用自来水冲洗解冻。用这种方法冰冻保存5株恶性疟原虫和2株间日疟原虫红内期均获成功。其中恶性疟原虫越南Oak Knoll株和间日疟原虫溪桑     

恶性疟原虫同步配子体及无配子体产生株中早期配子体抗原Pfg27和Pfs16的表达

疟原虫有性期某些抗原诱导产生的抗体能阻断疟疾的传播。在恶性疟原虫,这些抗原包括配子体合成的Pfs230、Pfs48/45、Pfg27及配子形成和受精后产生的Pfs25。 本文作者对恶性疟原虫I—V期同步配子体及配子成熟过程中Pfg27和Pfg16的表达及其在体外不能产生配子体的“无性”株中的表达进行了研究。高度同步的恶性疟原虫     

恶性疟原虫红内期裂殖子疫苗候选抗原PF83的变异分析

本文分别在基因水平和氨基酸水平对四株恶性疟原虫红内期裂殖子抗原PF83的变异进行了分析,以确定PF83是否有可能作为恶性疟原虫红内期裂殖子疫苗的抗原成分。     

Chelex法从恶性疟原虫薄血涂片提取DNA的基因诊断

目的 建立从恶性疟原虫薄血涂片中提取DNA进行恶性疟原虫18S RNA基因套式PCR检测方法 ,并探讨其可行性.方法 利用螯合型的离子交换树脂Chelex-100作为介质,一步法分别提取患者染色和未染色薄血涂片恶性疟原虫DNA,行套式PCR扩增.以培养的不同浓度恶性疟原虫制备的染色和未染色薄血涂片提取恶性疟原虫DNA为模板进行PCR扩增,检测该方法的灵敏度.结果 用Chelex-100法提取恶性疟原虫患者染色与未染色薄血膜DNA,PCR扩增均出现205 bp特异扩增片段.染色及未染色薄血膜恶性疟原虫PCR扩增的最低虫体浓度分别为1.5×101/μL血和1.5×10-1/μL血.结论 Chelex-100法薄血涂片中提取微量DNA的套式PCR检测方法,可在基因水平检测存档的薄血涂片标本.为恶性疟疾的临床实验室诊断和分子流行病学研究提供了新方法.     

PCR鉴别诊断间日疟及恶性疟的研究

目的 :在同一反应体系中建立能鉴别诊断间日疟与恶性疟的 PCR检测方法。方法 :根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 3个引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,在同一反应体系中 ,间日疟原虫和恶性疟原虫分别预期被扩增出 34 1bp和 4 31bp的 DNA条带。结果 :间日疟原虫和恶性疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小的 DNA片段 ,并经限制性酶切证实 ;杜氏利什曼原虫、弓形虫、健康人血及空白对照均无特异性扩增条带 ;以该检测体系至少可检出原虫血症为 2 .56× 10 ^-7间日疟原虫感染和 1.0 8× 10 ^-5恶性疟原虫感染 ;69份镜检阳性的间日疟和 2份恶性疟患者血样 PCR检测均为阳性 ,1例发热待查患者PCR诊断为间日疟 ,与镜检复查结果一致 ,所有疟疾阳性标本中未检出混合感染 ,2 0份健康人血 PCR均为阴性。结论 :该检测体系灵敏、特异 ,对于诊断间日疟和恶性疟以及鉴别间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有一定的应用价值。     

一步反转录PCR技术在检测4种人疟原虫中的初步应用

目的探讨应用一步反转录PCR(RT-PCR)技术检测4种人疟原虫的可行性和特异性。方法取恶性疟(1例)、间日疟(1例)、卵形疟(1例)和三日疟(5例)患者全血,提取疟原虫总RNA和基因组DNA。应用一步RT-PCR和一步实时荧光RT-PCR分别扩增经脱氧核糖核酸酶(DNase)消化的疟原虫RNA样品中的18S rRNA序列,应用普通PCR和一步RT-PCR技术分别扩增不同稀释浓度的疟原虫RNA(未经DNase消化和经DNase消化)和DNA样品中的疟原虫18S rRNA序列和18S r DNA序列,比较2种检测技术可检测到目标序列的样品最低稀释浓度。结果患者全血基因组DNA经一步RT-PCR分别扩增出310、394和323 bp条带,测序结果显示分别为恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、卵形疟原虫(P.ovale)和间日疟原虫(P.vivax)的18S rRNA序列特异性条带,但未扩增出三日疟原虫(P.malariare)特异条带。一步实时荧光RT-PCR结果显示,4种人疟原虫RNA样品均出现相应的荧光信号,除三日疟原虫样品外,各溶解曲线均仅有单一的扩增峰。因4种人疟原虫DNA和RNA原液样品中模板量的差异,一步RT-PCR可检测到的最低稀释浓度从1至10-4不等,但可检测到的DNA样品的最低稀释浓度与未经DNase消化的RNA样品相同或较后者低一个数量级,且两者最低稀释浓度均低于经DNase消化的RNA样品。与普通PCR的检测结果比较发现,同一样品均以一步RT-PCR可检测到的稀释浓度最低,较普通PCR的敏感性提高10~1 000倍。结论一步RT-PCR技术可检测出人血液样品中的恶性疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫DNA,但在检测三日疟原虫样品中的适用性有待进一步分析。     

基于恶性疟原虫PHIST特有基因的环介导等温扩增技术的建立与评价

目的建立基于编码恶性疟原虫PHIST蛋白特有基因的环介导等温扩增技术。方法在Plasmo DB数据库中,搜索并筛选编码PHIST、在环状体或裂殖体期高表达且恶性疟原虫特有的基因。利用在线软件Primer Explorer V4设计目的基因LAMP引物。采集恶性疟原虫滤纸血并提取基因组DNA。将提取后的恶性疟原虫DNA用超纯水进行10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)倍比稀释,用LAMP法检测其敏感性;采用间日疟原虫、约氏疟原虫、牛带绦虫和日本血吸虫基因组DNA作为对照,用LAMP法评价其特异性。结果共筛选出61个编码恶性疟原虫PHIST的基因。选取环状体期高表达的特有基因PF3D7_1372300和裂殖体期高表达的特有基因PF3D7_1401600建立LAMP技术。基于PF3D7_1372300和PF3D7_1401600基因的LAMP法检测恶性疟原虫的最低限度分别为130.5个/μl和1 305.3个/μl,所获得的恶性疟原虫扩增产物其检测管染色后呈绿色,即阳性。基于PF3D7_1372300和PF3D7_1401600基因的LAMP法扩增恶性疟原虫产物检测管染色后呈绿色,即阳性;而间日疟原虫、约氏疟原虫、牛带绦虫和日本血吸虫的LAMP扩增产物检测管染色后仍呈棕色,即阴性。结论基于PF3D7_1372300基因的LAMP法检测恶性疟原虫敏感、特异、简便、实用,可用于恶性疟流行区现场调查和临床诊断。     

单克隆抗体抑制人红细胞内恶性疟原虫的生长

本文报道了单克隆抗体抗单一的抗原决定簇及其抑制体外恶性疟原虫红内期的生长。所用的恶性疟原虫采自从塞内加尔回欧     

恶性疟原虫（海南株）cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的 :构建恶性疟原虫 c DNA表达文库。方法 :采用“一步法”提取红内期恶性疟原虫12 2 4 μg RNA,经 Oligo( d T)纤维素柱纯化得到 35.84 μg poly ( A) m RNA。取 10 μg m RNA反转录得到 1.75μg平端双链 c DNA,与含 Eco RI,Not I,Sal I酶切位点的衔接头连接后 ,经分级分离柱纯化回收到 2 0 0 ng大小主要在 50 0 bp- 7kb左右的 c DNA片段。取 50 ng c DNA与λgt11噬菌体臂连接后体外包装 ,完成建库。并采用 PCR方法初步鉴定该文库。结果 :已构建一个含 10 6个重组子的 c DNA表达文库。结论 :文库容量及插入 c DNA片段的大小适合于进一步研究。     

3种复苏方法对恶性疟原虫红内期体外培养存活的影响

目的观察3种复苏方法对恶性疟原虫红内期体外培养存活的影响。方法采用恶性疟原虫FCCSM/YN株作为虫源,使用3种复苏液,参照体外培养方法并作改进进行复苏试验,计算红细胞原虫感染率和存活率。结果 3种复苏方法中,方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ24h疟原虫存活率分别为11.32%、29.17%和40.00%;48h疟原虫存活率分别为16.39%、30.36%和46.70%;72h疟原虫存活率分别为20.59%、37.75%和57.09%;复苏方法Ⅲ恶性疟原虫存活率较高。结论复苏方法Ⅲ的复苏效果较好,适于恶性疟原虫的复苏。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白MSP2期特异性反义转录

疟原虫中功能基因的转录表现出高度期特异性 ,这与其在不同宿主环境中生长繁殖有关。稳态RNA水平通常反映期特异性蛋白表达水平 ,而期特异性启动子引发转录的时间可能对蛋白正常定位至关重要。滋养体中期和裂殖体期 ,有稳定的MSP2mRNA表达 ;在其它无性阶段存在稳定的反义转录 ,代表与MSP2尾 尾相邻的腺苷酰琥珀酸裂解酶基因 (asl)的通读。本文首次报道了恶性疟原虫中期特异性、内源性稳态MSP2反义RNA的表达。MSP2基因位于 2号染色体上 ,与MSP4、MSP5基因头尾串联排列 ,同时表达asl基因位于MSP2基因 3′端下游 70 0bp核苷酸处 ,…     

近年抗疟药研究的进展

抗疟药的作用方式和药物抗性的基础研究1967年以来,对于阐明抗疟药的作用方式及探讨疟原虫发生抗药性的状况进行了大量的研究工作。1.疟原虫的结构和功能电子显微镜的应用,进一步阐明了疟原虫红细胞内期和红细胞外期摄食的机制。除伯氏疟原虫(P.berghei)和恶性疟原虫外,对间日疟原虫和三日疟原虫也进行了一些研究。4—氨基喹啉类和阿的平可使疟原虫及其     

荧光重组酶聚合酶扩增/CRISPR-Cas12a快速检测恶性疟原虫方法的建立与初步评价

目的 建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR-Cas12a系统的荧光快速检测恶性疟原虫方法,并对其检测效能进行初步评价。方法 选择恶性疟原虫18S核糖体RNA(rRNA)基因为靶序列,设计和合成3组RAA引物及CRISPR来源RNA(crRNA),选择最佳组合并优化反应条件,建立荧光RAA/CRISPRCas12a检测方法。构建包括靶标区的恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因质粒,将质粒浓度分别稀释成1 000、100、10、1拷贝数/μL进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测敏感度;分别以间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体基因组DNA为模板,进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测特异度。分别采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法和巢式PCR法对50份疟疾临床样本进行检测,比较两种方法检测一致性。体外培养恶性疟原虫3D7株,经培养后获得的培养物...