hVEGF165/pcDNA3.1在小鼠心肌细胞中的表达

目的观察重组质粒人血管内皮生长因子165基因与质粒载体pcDNA3．1的重组体（hVEGF165／pcDNA3．1）在心肌细胞中的表达，为冠心病的基因治疗和细胞移植治疗研究奠定基础。方法体外培养小鼠心肌细胞，脂质体介导hVEGF165／pcDNA3．1转染心肌细胞，用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、细胞免疫化学方法和免疫印迹法（Western blotting）检测其在心肌细胞中的瞬时表达。结果RT—PCR扩增得到与hVEGF165大小一致的目的条带，细胞免疫化学法检测到心肌细胞胞质中hVEGF蛋白，Western blotting在培养的细胞上清液中检测到hVEGF蛋白。结论构建的重组质粒hVEGF165／pcDNA3．1能在体外培养的小鼠心肌细胞中表达，可用于冠心病的基因和细胞移植治疗研究。     

phVEGF165原位转染缺血肌肉后hVEGF基因及其蛋白表达

目的 :探索慢性下肢动脉缺血的基因治疗。方法 :选用VEGF作为治疗基因 ,通过建立实验兔慢性下肢动脉缺血模型 ,将构建的人VEGF165cDNA真核表达载体 phVEGF165注入缺血肌肉内 ,采用RT PCR和原位杂交法测定肌肉内hVEGF165表达 ,采用免疫组化和Western印迹法测定其蛋白产物表达。结果 :骨骼肌细胞外源性hVEGF165基因表达量于注射后 1周达到高峰 ,能持续 2～ 3周。蛋白表达于注射后 2周达到高峰 ,能维持至注射后 4周。结论 :骨骼肌细胞能摄取并表达外源性hVEGF165基因 ,并能进一步合成分泌hVEGF165蛋白。phVEGF165肌肉直接注射的作用时间有限、范围局限 ,使用安全性较高。     

hVEGF165单克隆工程细胞的筛选和鉴定

目的：用基因工程方法改造成纤维细胞，筛选出能够持续分泌人血管内皮细胞生长因子（hVEGF165）的细胞株，为难于愈合创面（如糖尿病性慢性溃疡）的治疗提供有效方法。方法：将含有hVEGF165的穿梭质粒pCDNA3-hVEGF165导入NIH3T3细胞，使用G-418根据有限稀释法筛选出7个单克隆细胞株。挑选出整合有hVEGF165基因且表达最高的一个细胞克隆在DNA、mRNA和蛋白质水平进行鉴定，同时使用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）、鸡胚实验检测表达产物的生物学活性。结果：PCR和Southern印迹证明hVEGF165基因已整合人NIH-3T3细胞基因组，RT-PCR和Northern印迹则表明该细胞株能够表达hVEGF165-mRNA。用hVEGF165-ELISA法证实在蛋白质水平该细胞株能够持续表达hVEGF165 3个月以上，并始终保持非常高的水平。MTT实验显示其具备较强的促进内皮细胞增殖的功能，而鸡胚实验则表明该工程细胞有很强的促进胚胎血管生成的作用。结论：成功地制备了hVEGF165单克隆工程细胞，为创伤愈合的基因治疗提供实验准备。     

血管内皮生长因子和Fas配体共表达质粒的构建及其在细胞中的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF)和Fas配体(FasL)共表达质粒，并鉴定其在细胞中的表达情况。方法 根据入VEGFl65和FasL的cDNA序列分别设计、合成引物，经扩增、连接、酶切、插入等得到重组表达质粒pCI-VEGFl65和pCI-FasL。再以此为基础构建得到编码FasL和VEGFl65的共表达质粒pCI-FasL-IRES-VEGFl65(简称pCI-FIV)。用脂质体将各表达质粒(2μg)转染NIH3T3细胞，用流式细胞术、ELISA和Western-blot检测其FasL和VEGFl65表达情况。结果 细胞裂解液的Western-blot检测表明，重组质粒pCI-VEGFl65和pCI-FIV能表达VEGFl65。分子量与预期kD一致。细胞培养上清的ELISA检测表明，pCl-VEGFl65和pCI-FIV均能分泌性表达vEGFl65。流式细胞仪检测表明，质粒pCI-FasL、pCI-FIV稳定转染的NIH3T3细胞表面的绿色荧光阳性率分别为98．0％和96．5％，而空载体转染细胞的阳性率为3．2％。ELISA检测结果显示，pCI-FasL、pCI-FIV转染NIH3T3细胞培养上清中均存在可溶性FasL。结论 成功构建的FasL和VEGFl65共表达质粒可成功转染细胞并能分泌性表达VEGFl65，同时可表达膜结合形式的FasL和可溶性FasL，为将来血管内膜增生的基因治疗奠定了基础。     

血管内皮生长因子在海绵状血管瘤的表达及其临床意义

海绵状血管瘤具有肿瘤和畸形的双重特性 ,为了探讨血管内皮生长因子 (ＶＥＧＦ)在其表达及临床意义 ,我们对 17例海绵状血管瘤的血管内皮生长因子蛋白表达进行了分析。1　对象及方法1.1　对象　海绵状血管瘤 17例 ,2～ 5 1岁 ,15岁以下 11例 ,15岁以上 6例 ,男 7例 ,女 10例。发病部位在四肢、颈面部及胸背部等 ,皮下海绵状血管瘤 14例 ,肌肉海绵状血管瘤3例 ,均为手术后病理证实。另取正常动脉、静脉组织 6例为对照组。1.2　方法　采用免疫组化法测定 ,用鼠抗人ＶＥＧＦ试剂盒 ,按说明书操作。ＶＥＧＦ以内皮细胞胞浆出现特异性棕黄色着色…     

Livin、VEGF在甲状腺癌中的表达及其临床意义

目的:探讨Livin、血管内皮生长因子(VEGF)在甲状腺癌中的表达与临床病理因素的关系。方法:采用免疫组织化学EnVison两步法检测70例甲状腺癌、18例甲状腺瘤及18例正常甲状腺组织中Livin、VEGF的表达,并对其与性别、年龄、肿瘤大小、病理学分型、临床分期及淋巴结转移的关系进行分析。结果:70例甲状腺癌中Livin、VEGF的阳性率分别为65.7%、61.4%,与甲状腺瘤、正常甲状腺组织相比较差异有统计学意义(P<0.05)。甲状腺癌中Livin、VEGF的表达在不同病理类型、临床分期、淋巴结转移相比较差异有统计学意义(P<0.05)。经Spearman等级相关性分析表明,Livin与VEGF的表达呈正相关(r=0.484,P<0.001)。结论:Livin和VEGF的异常表达与甲状腺癌的发生发展有关,可作为甲状腺癌预后的参考指标。     

VEGF在膀胱癌细胞中的表达

探讨血管内皮生长因子在膀胱肿瘤发生发展中的作用。方法采用逆转录聚合酶链反应方法检测三种人膀胱癌细胞系和正常膀胱组织中ＶＥＧＦｍＲＮＡ的表达,同时用免疫化学方法检测三种人膀胱癌细胞系ＶＥＧＦ蛋白表达。结果三种膀胱纱均有ＶＥＧＦｍＲＮＡ的表达,正常膀组织无表达;     

血管内皮生长因子在乳腺癌组织中表达的特点

血管内皮生长因子 (ＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ)是主要的肿瘤血管形成调节因子。ＶＥＧＦｍＲＮＡ含 4种异构体 (ＶＥＧＦ12 1、ＶＥＧＦ165、ＶＥＧＦ189、ＶＥＧＦ2 0 6) ,蛋白质为 46Ｋｄａ ,ＶＥＧＦ诱导血管生成后肿瘤易发生转移 ,患者预后不良 ,较少注意ＶＥＧＦ与肿瘤病理特征的联系。本研究以乳腺癌为模型 ,探讨ＶＥＧＦ表达与肿瘤生物学行为的关系。资料和方法1.标本来源 :连续收集我院普外科 1996年 12月至 1997年 6月的Ⅰ～Ⅳ期乳腺导管癌手术标本 30例 ,切取癌组织和癌旁组织各 …     

血管内皮生长因子-C及其受体在肾细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨肾细胞癌组织中血管内皮生长因子-C(VEGF-C)及其受体(VEGFR-3)的表达水平及其与肿瘤临床、病理因素间的关系。方法采用免疫组织化学方法测定54例肾细胞癌和20例正常肾脏组织中VEGF-C和VEGFR-3蛋白表达水平,观察VEGF-C和VEGFR-3的表达与肿瘤分级、肿瘤分期、淋巴管浸润或淋巴结转移间的相关性。结果肾细胞癌组织中VEGF-C和VEGFR-3蛋白表达水平显著高于正常肾脏组织,两者间差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤分级、肿瘤分期与VEGF-C和VEGFR-3蛋白的表达强度存在相关性(RR=0.83;0.78)。在伴有淋巴管转移浸润或淋巴结转移的病例中,其VEGF-C和VEGFR-3蛋白的表达明显升高(P<0.05)。结论通过检测肿瘤组织VEGF-C/VEGFR-3的表达情况,有助于了解肾细胞癌的淋巴管浸润和淋巴结转移的倾向,可能对临床治疗术式选择以及术后辅助治疗选择具有指导意义。     

乙酰肝素酶和血管内皮生长因子在肝癌中的表达及其与血管生成的关系

乙酰肝素酶（Hpa）是一种内切糖苷酶，可降解细胞外基质和基底膜中的硫酸乙酰肝素，破坏其完整性，同时释放在细胞外基质中储存的血管内皮生长因子（VEGF），促进肿瘤血管的生成，从而有利于肿瘤细胞的侵袭和转移。本研究旨在探讨Hpa、VEGF与肝癌的临床病理特征及肿瘤血管新生之间的关系。     

VEGF-C基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C表达的影响

目的探讨将真核表达载体pcDNA3．1-VEGF—C重组质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞后VEGF-C表达的变化。方法通过脂质体介导方法，将构建好含有VEGF—C的重组质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞中，新霉素（G418）筛选得到稳定转染细胞系，RT—PCR和Western blot方法检测稳定转染后细胞中VEGF—C mRNA和蛋白的表达。结果成功转染并获得稳定高表达VEGF—C的乳腺癌MCF-7细胞系，其转染组VEGF—C mRNA相对吸光度值（12．382&#177;2．183）较空载组（6．039&#177;1．950）显著上调（P〈0．01）。Western blot检测转染组VEGF-C蛋白相对灰度值（0．971&#177;0．186）较空载组（0．594&#177;0．196）明显上调（P〈0．05）。结论脂质体介导重组质粒pcDNA3．1-VEGF-C转染入人乳腺癌MCF7细胞中可显著增加VEGF—C表达水平。     

血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建及转染内皮祖细胞的实验研究

目的：利用细菌内同源重组法构建含血管内皮生长因子（VEGF）165基因的重组腺病毒，并观察其在内皮祖细胞（EPCs）中的表达，为进一步研究其在慢性肾脏病中的作用奠定基础。方法：用限制性内切酶XbaⅠ＋HindⅢ从质粒载体中切出VEGFl65基因片段，与KpnⅠ＋HindⅢ双酶切的pAdTrack-CMV形成转移质粒pAdTrack-CMV-VEGFl65，PmeI酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，由人胚肾293细胞包装成Ad-VEGFl65，PCR和westem blot法鉴定其表达。贴壁法体外培养获得大鼠骨髓来源的EPCs，Ad-VEGFl65基因体外转染EPCs，检测转染后目的基因的表达情况。结果：利用CSCI，法由pAdTrack-VEGFl65和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态茵，可获得阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因，病毒滴度1．4×10^10pfu／ml。Ad-VEGFl65转染培养第6天的EPCs后24h开始，培养上清中VEGF蛋白表达较对照组和转染前增加。结论：成功制备的重组体腺病毒Ad-VEGFl65转染体外培养的EPCs后，在体外能有效高表达目的基因产物，为今后VEGF在肾脏病中的深入研究奠定了基础。     

人脑膜瘤血管内皮细胞生长因子表达的临床意义

目的　探讨脑膜瘤血管内皮生长因子 (VEGF)基因表达与血管生成和脑水肿的关系。方法　应用免疫组织化学方法检测 3 5例脑膜瘤组织中VEGF基因表达 ;Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体组织化学染色显示微血管 ,用微血管记数 (MVC)测定血管生成 ;从脑水肿与肿瘤本身的体积之比估计脑水肿程度。结果　 3 5例脑膜瘤VEGF表达率 77% (2 7/3 5 ) ,4例可疑染色 ,其中恶性脑膜瘤和血管母细胞型脑膜瘤呈现高表达 (10 0 % ) ;VEGF表达与脑膜瘤血管生成 ,瘤周脑水肿呈显著正相关 (r =0 .682 3 ,P <0 .0 1;r =0 .765 3 ,P <0 .0 1)。结论　VEGF存在于脑膜瘤组织中 ,在脑膜瘤血管生成和瘤周水肿中发挥重要作用。     

低氧反应元件对缺血心肌转染人血管内皮生长因子165基因表达的调控作用

目的 观察低氧反应元件(HRE)对低氧、复氧心肌细胞及缺血心肌转染人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因表达的调控作用.方法 分离新生SD大鼠心肌细胞,采用不同氧条件进行培养;建立猪心肌缺血一复灌动物模型,将在HEK293T细胞包装后获得的rAW-9HRE.hVEGF165病毒分别转染心肌细胞及动物缺血心肌.取培养心肌细胞及培养液,另取缺血区心肌组织,采用细胞免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blot方法 分别测定hVEGF165蛋白表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定hVEGF165 mRNA表达;Ⅷ因子染色,计数缺血心肌新生血管变化.结果 病毒转染率为87%;心肌细胞A、B及E组培养液中hVEGF165蛋白含量显著升高(P＜0.01),细胞免疫荧光hVEGF165蛋白染色呈阳性;RT-PCR检测显示,心肌细胞A、B及E组可见484 bp目的 条带;在动物整体水平,与转基因缺血组比较,转基因复灌组hVEGF165 mRNA及蛋白表达显著减弱(P＜0.01),心肌毛细血管密度亦减少.结论 HRE作为氧敏感基因调控开关能有效地调控缺血心肌转染hVEGF165基因的表达.     

血管内皮生长因子C在人乳腺癌细胞株MCF-7及MCF-7/Adr中的表达

目的：检测血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)mRNA和蛋白在人乳腺癌细胞株MCF－7及其耐药株MCF－7／Adr中的定位，定性表达。方法：根据VEGF－C基因序列，设计合成地高辛标记的特异性寡核苷酸探针，运用原位杂交方法检测培养的细胞株MCF－7和MCF－7／Adr中VEGF－C mRNA的表达；并运用免疫组织化学方法检测了两种细胞中VEGF－C蛋白的表达。结果：原位杂交检测到MCF－7和MCF－7／Adr细胞的胞浆中有阳性蓝色颗粒，免疫组化检测发现两种细胞的胞浆中均有阳性棕黄色颗粒，而阴性对照细胞的胞浆中则均无阳性颗粒。结论：人乳腺癌细胞株MCF－7及其耐药株MCF－7／Adr细胞能够转录VEGF－C mRNA并在其细胞浆中翻译合成相应的蛋白。     

hVEGF165及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体对兔激素性股骨头坏死的修复作用研究

目的探讨hVEGF165及hBMP-7双基因共表达重组腺相关病毒载体对兔激素性股骨头坏死的修复作用。方法应用细菌脂多糖联合甲基强地松龙制备兔激素性股骨头坏死模型。30只经MRI筛选造模成功动物随机分为模型组、髓芯减压组和病毒治疗组。病毒治疗组动物于髓芯减压术后将rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7病毒载体注入减压区内。选取病毒注射后12周时间点分别行核素骨扫描,股骨头大体观察、HE染色、VEGF和BMP免疫组化染色检测。结果 MRI检测、大体观察以及HE染色发现早期股骨头坏死动物模型建立成功,且病毒治疗组较髓芯减压组及模型组相比股骨头坏死表现明显减轻,VEGF及BMP表达增强,髓腔组织代谢旺盛,组间差别有统计学意义（P〈0.05）。结论重组腺相关病毒载体rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7通过增加髓腔组织的血运、增强股骨头区骨组织质量提高激素性股骨头坏死区骨修复能力。     

腺病毒载体介导人VEGF cDNA促进随意型皮瓣成活的实验研究

目的探讨以腺病毒载体局部应用血管内皮细胞生长因子基因对大鼠缺血随意型皮瓣成活的影响。方法30只SD大鼠随机分成3组,每组10只,于鼠背设计蒂在尾侧髂嵴水平的随意型皮瓣,面积为2cm×8cm,A组皮瓣远端23顺皮瓣长轴分10个点真皮下注入1012PFU的携带人血管内皮细胞生长因子基因的腺病毒(AdCMVVEGF),B组同法注入同剂量的携带β半乳糖苷酶基因的腺病毒(AdCMVGal),C组注入1ml的生理盐水,3d后掀起皮瓣并原位缝合,术后7d观察实验结果。结果每组皮瓣成活面积的百分比分别为A组(8591±254)%,B组为(5956±118)%,C组为(6148±109)%,A组成活率显著高于B组和C组,差异有非常显著性意义(P<001),B组与C组比较差异无显著性意义(P>005)。原位杂交、免疫组化显示,应用AdCMVVEGF治疗的成活皮瓣中,VEGF有表达,组织学切片显示,AdCMVVEGF治疗皮瓣中肉芽组织增生,新生血管大量形成。结论以腺病毒为载体局部应用VEGF基因能增加缺血皮瓣的成活面积,该法具有高效的特点。     

血管内皮生长因子在人脑胶质瘤的定位及表达

目的 通过检测人脑胶质瘤及瘤周组织中血管内皮生长因子(VEGF)的基因表达及定位,探讨VEGF促进肿瘤血管生成及瘤周组织水肿的作用机制。方法采用原位杂交方法检测23例人脑胶质瘤及瘤周组织中VEGF基因表达情况,并与7例正常脑组织进行对照研究。不着色者为阴性,细胞胞浆着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果VEGF在胶质瘤组织主要表达于毛细血管、血管内皮细胞及肿瘤细胞,瘤周组织表达于变异的星形胶质细胞,而正常脑组织几乎无表达。胶质瘤组织标本中血管内皮细胞及瘤细胞内VEGF的表达率分别为22.60±2.31和20.18±4.25,而瘤周组织标本中血管内皮细胞及变异的星形胶质细胞内VEGF的表达率分别为8.44±3.17和45.20±6.11,正常脑组织标本中血管内皮细胞及细胞内VEGF的表达率分别为1.76±1.20和1.84±1.51,胶质瘤组织与瘤周组织阳性细胞表达率显著高于正常脑组织(P<0.01);胶质瘤组织中血管内皮细胞VEGF的阳性表达率高于瘤周组织(P<0.01);而瘤周组织星形胶质细胞的阳性表达率高于肿瘤组织(P<0.01)。结论提示VEGF在脑胶质瘤及瘤周组织中的高表达与肿瘤血管生成及瘤周组织水肿的发生密切相关。