用全染色体涂抹探针进行卵母细胞第一极体荧光原位杂交

 【目的】建立用全染色体涂抹探针（WCP）对卵子第一极体进行荧光原位杂交（FISH）检测染色体的方法。【方法】收集单精子卵胞浆内注射（ICSI）中不成熟卵母细胞经体外培养成熟和常规试管婴儿（IVF）中未能成功受精的成熟卵母细胞，活检第一极体，固定后行13、14号染色体的全染色体涂抹探针荧光原位杂交。活检后，一部分卵母细胞固定行FISH以分析卵子自身的13、14号染色体，其余行ICSI受精，观察受精和卵裂情况。【结果】共获得成熟母细胞93个，成功活检85个，成功固定78个，共29个第一极体处于分裂中期，均有FISH结果。卵母细胞体外培养成熟后立即取极体进行固定，90．5％（19／21）的极体处于分裂中期，而取卵后30-48h和72h后活检的第一极体处于分裂中期的比例分别为27．3％（6／22）和11．4％（4／35），3组相比有统计学差异（P〈0．01）。11个卵母细胞同时获得了极体和相对应卵细胞的FISH结果，其中10个极体和相对应的卵细胞分别有1条13，14号染色体，剩余1个卵母细胞的极体有2条14号染色体和1条13号染色体，相对应的卵细胞仅有1条13号染色体，二者互补。活检后行ICSI受精的卵母细胞受精率为78．6％（11／14），优质胚胎率45．5％（5／11）。【结论】全染色体涂抹探针对卵子第一极体进行遗传分析可以有效、准确地推测相对应卵母细胞的染色体构成，从而应用于女性染色体易位患者的植入前遗传诊断。     

玻璃化冷冻人卵母细胞体外受精－胚胎移植9例临床分析

目的：探讨人卵母细胞玻璃化冷冻在体外受精－胚胎移植（ IVF-ET）中的应用效果。方法行IVF-ET 治疗、因取卵日男方因素无法进行受精的患者9例,对其成熟卵子进行玻璃化冷冻保存,解冻后进行卵胞浆内显微授精（ICSI）,记录卵子复苏、受精、卵裂及移植后妊娠情况。结果9例患者共解冻复苏58枚卵子,复苏率68．2％（58／85）;复苏后进行ICSI的成熟卵子中,受精40枚,形成胚胎34枚,受精率69．0％,卵裂率85．0％。7个移植周期共移植胚胎15枚,临床妊娠3例,临床妊娠率42．9％。结论人卵母细胞玻璃化冷冻可以获得一定的临床妊娠率,在IVF-ET中可作为临床治疗的选择之一。     

人卵母细胞玻璃化冷冻的临床应用及成功分娩

目的探讨人卵母细胞玻璃化冷冻保存的方法及临床应用价值。方法将从促排卵周期获得的人的卵母细胞用冷冻环进行玻璃化冷冻保存,复苏后行卵细胞浆内单精子注射-胚胎移植,观察复苏后卵母细胞形成胚胎的发育能力。结果冷冻后融解235个卵母细胞,存活169个（71．9％,169／235）,受精122个（72．2％,122／169）。移植11例,获得临床妊娠2例。第1例于2005年12月15日妊娠35^＋2周行剖宫产,为双胎女婴,均发育正常。第2例为单胎妊娠,现妊娠16周,目前胎儿及孕妇健康。结论卵母细胞玻璃化冷冻是一种较理想的保存女性生育力的方法,但是其技术应用于临床有待进一步研究和实践。     

人卵子玻璃化冷冻原因及其技术在辅助生殖中的应用

目的探讨人卵子玻璃化冷冻的原因及其技术在辅助生殖中的可行性和临床应用价值。方法回顾性研究2008年1月~ 2018年10月在南方医科大学南方医院生殖医学中心行卵子玻璃化冷冻的26例患者共27个取卵周期,分析卵子玻璃化冷冻原 因、卵子解冻后受精情况及临床妊娠结局。结果26例患者27个取卵周期共冷冻卵子274枚,卵子冷冻原因主要包括取卵日男 方精子数量及质量差无可用精子、男方处于各种疾病急性期不适宜取精及男方因各种原因未能到场取精等。共19个周期行卵 子解冻,该19个周期共冻存卵子217枚,解冻后存活176枚,卵子解冻存活率81.11%,其中131枚卵子解冻后行卵胞浆内单精子 注射,正常受精98枚,正常受精率74.81%;卵裂88枚,卵裂率89.80%（88/98）;共形成可移植胚胎53枚,其中优质胚胎36枚,优 质胚胎率36.73%（36/98）。15个移植周期共移植胚胎27枚,临床妊娠率为53.33%（8/15）,活产率为33.33%（5/15）。随患者年龄 增加,与<35岁组相比,≥35岁组患者卵子复苏率（82.76% vs 74.42%,P=0.211）、临床妊娠率（77.78% vs 16.67%,P=0.041）及活 产率（55.56% vs 0,P=0.044）均呈下降的趋势。结论卵子玻璃化冷冻可作为不孕夫妻取卵当日因男方因素不能提供精子患者 的临床补救措施;卵子玻璃化冻融后的受精率、临床妊娠率结局良好,卵子复苏率与年龄存在相关性,女性≤35岁者冻卵能够获 得满意的临床妊娠结局。     

小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究

目的　对小鼠卵母细胞玻璃化的方法和冷冻液进行研究。方法　用两种玻璃化冷冻液EFS4 0 (高钠 )、DEFS4 0 (低钠 )对ICR、C57BL 6J小鼠卵母细胞进行冷冻 ,0 5mol L蔗糖液解冻 ,体外授精前对部分解冻后的C57BL 6J小鼠卵母细胞进行透明带切割。结果　DEFS4 0冷冻液冷冻效果明显高于EFS4 0冷冻液 ,ICR小鼠卵母细胞解冻后成活率达 75 2 %、体外授精率 (2 4 6 % )与对照组相比差异无显著性 ,C57BL 6J小鼠卵母细胞解冻后成活率为 87 1%、卵母细胞切割后体外受精率 (36 0 % )与对照组相比差异也无显著性。结论　冷冻液中钠离子浓度影响小鼠卵母细胞冷冻效果 ,用DEFS4 0 (低钠 )冷冻液进行玻璃化冷冻可以取得理想的冷冻效果。     

A live birth of activated one-day-old unfertilized oocyte for a patient who experienced repeatedly near-total fertilization failure after intracytoplasmic sperm injection

Total or near-total fertilization failure after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a rare event, but it occurs repeatedly because of sperm defects in activating oocyte. The case presents a successful pregnancy and live birth after calcium ionophore A23187 (A23187) activation on one-day-old unfertilized oocytes in a patient whose husband suffered oligoasthenoteratozoospermia, and who had experienced repeated near-total fertilization failure after ICSI. In the second ICSI cycle, only one oocyte was fertilized while nine were unfertilized. Oocyte activation with A23187 were performed on the one-day-old unfertilized oocytes after ICSI and resulted in fertilization and embryo transfer. A clinical pregnancy was achieved and a healthy baby was born. To our knowledge, this is the first reported case of a healthy birth after oocyte activation on the one-day-old unfertilized oocyte. This indicates that “rescue oocyte activation” on one-day-old unfertilized oocytes after ICSI may be helpful for preventing total or near-total fertilization failure after ICSI.

     

Immunofluorescent Study of Human MⅡ Oocytes Failed to Fertilize after IVF and ICSI

Objective To discuss the reason why human M Ⅱ oocytes failed to fertilize after IVF and ICSI. Methods The unfertilized human MⅡ oocytes were collected 24-48 h after IVF and ICSI and stained for immunoflurescence and PI counterstain. The types of fertilization failure were identified under the fluorescence microscopy. Results About 55.8% oocytes in IVF were found no sperm in them, which were more than that in ICSI （9.7%） （P〈0.01）. About 14.9% oocytes in IVF and 58.1% in ICSI displayed oocyte activation failure. The difference was significant （P〈0.01）. Defects in pronuclear formation and or migration was found in a similar proportion of oocytes both after IVF （25.3%） and ICSI （32.3%）（P〉0.05）. There were 3.9% oocytes with other abnormalities were observed in IVF but none in ICSI. Conclusion The main reason of fertilization failure after IVF was no sperm penetration. However fertilization failure after ICSI was mainly associated with incomplete oocyte activation.     

精子卵细胞内注射治疗严重少弱精子症和受精障碍

目的 :应用精子卵细胞内注射 (ICSI)解决因严重少、弱精子症和受精障碍不育夫妇的受孕问题。方法 :应用 ICSI和体外受精 /胚胎移植 (IVF-ET)技术。结果 :对 1 5对严重少、弱精子症和受精障碍不育夫妇进行了共 1 6个周期的 ICSI。共取卵 1 3 6个 (生殖泡期 1 4个 ,M11 7个 ,M2 1 0 5个。) ,平均取卵 8.5个 /周期 ,成熟卵率 77.2。ICSI 1 0 3个卵 ,受精 67个 ,受精率 65 .0。产生胚胎 5 9个 ,卵裂率 88.1。每周期获得胚胎 3 .7个。临床妊娠 6例 (双胎 2例 )。胚胎种植率为 1 3 .6。但是 ,2例妊娠于早期发生流产。现已经诞生 2例正常新生儿 ,另 2例于正常妊娠中。结论 :在常规 IVF-ET中出现受精异常和严重精液异常 ,经一般治疗无效的不育夫妇 ,ICSI应作为治疗的首选方法。     

Rescue ICSI: Choose the Optimal Rescue Window before Oocyte Aging

Objective To evaluate the application value of rescue ICSI in fertilization failure after conventional IVF and choose the best rescue window before oocyte aging according to the results of rescue ICSI performed in different time. Methods The data of 93 IVF cycles were analyzed retrospectively. Rescue ICSI was performed in these cycles after conventional IVF failure. Because of the different rescue time, these cycles were divided into two groups: early rescue group (group A, 77 cycles, rescue ICSI performed 4-8 h after conventional IVF) and late rescue group (group B, 16 cycles, rescue ICSI performed 20-22 h after conventional IVF). Results There were no statistically significant differences in age of female, duration of infertility, number of oocytes retrieved every cycle. The normal fertilization rate, pregnancy rate and implantation rate were decreased in group B compared with those in group A (P<0.05). In group A, the normal fertilization rate of rescue ICSI performed 4-6 h after conventional IVF (group A1) was increased compared with that of rescue ICSI performed 6-8 h (including 6 h) after conventional IVF (group A2)(66.5% vs 55.9%)(P<0.05); while the abnormal fertilization rate in group A1 was decreased compared with group A2 (9.0% vs 14.4%)(P<0.05). Clinical pregnancy rate was slight higher in group A1 than in group A2, though this failed to be significantly different. Conclusion Rescue ICSI is effective if fertilization was failure after conventional IVF, the most important thing is to choose the reasonable rescue window before oocyte aging when ICSI is performed.     

卵子冷冻技术的临床应用

目的 探讨卵母细胞冷冻技术在临床应用.方法 将258例接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET)和单精子卵浆内注射(ICSI)治疗,取卵数≥20枚的258个周期,分为部分卵母细胞冷冻组(简称冻卵组)84个周期和胚胎冷冻组(简称冻胚组)174个周期,比较两组新鲜周期受精率和临床妊娠率.总结了23个卵母细胞冷冻复苏周期及19个移植周期(其中4个周期为捐赠周期)的复苏率,受精率,卵裂率,胚胎种植率,临床妊娠率,比较冻胚组冻胚复苏移植的临床结局.结果 冻卵组和冻胚组新鲜周期的受精率和临床妊娠率差异无统计学意义(P>0.05);19个卵母细胞冷冻复苏的移植周期与56个冷冻胚胎复苏的移植周期的胚胎种植率和临床妊娠率差异亦无统计学意义(P>0.05);卵母细胞冷冻复苏的移植周期妊娠率为47.4%(9/19),其中冻卵捐赠4个移植周期,2例临床妊娠(1例已分娩).结论 对于接受IVF/ICSI治疗的不孕妇女,由卵巢刺激产生的较多卵母细胞,无论是否选择冷冻部分卵母细胞,对其新鲜周期的受精率和妊娠率没有影响;冻卵移植周期与冻胚移植周期的妊娠率差异也无统计学意义;但是卵母细胞冷冻在生育力保存和分享捐赠方面较冻胚具有显著的优势.     

对单个卵子不同授精方式的妊娠结局分析

目的探讨常规体外受精（IVF）和单精子卵胞浆内显微注射（ICSI）两种不同授精方式对仅获得单个卵子周期的临床结局分析。方法回顾性分析接受治疗并仅获得单个卵子的525对不孕夫妇的777个周期的病例资料。根据精液质量分为3组：IVF组（563个周期）,严重男性因素SMF-ICSI组（151个周期）,非严重男性因素NSMF-ICSI组（63个周期）。比较各组间正常受精率、可利用胚胎率、优质胚胎率、每周期临床妊娠率。结果IVF组、SMF-ICSI组和NSMF-ICSI组的正常受精率分别为70.3%、81.4%和80.7%,差异有统计学意义（P<0.05）;可利用胚胎率分别为81.6%、84.8%和87.0%;优质胚胎率分别为42.2%、53.3%和34.8%;每周期临床妊娠率分别为19.8%、12.5%和11.1%;可利用胚胎率、优质胚胎率和每周期临床妊娠率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论对每周期只获得单个卵子的患者应严格根据男方精液质量及过往病因选择授精方式。     

人冻融卵母细胞赠送的初步研究

目的为要求接受赠卵的不孕症患者提供一种人卵母细胞的保存方法。方法将供卵者体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期中自愿捐献的多余的成熟卵母细胞29个,慢冻快融后采用受者丈夫精子行单精子胞浆内注射(ICSI),观察受精、卵裂及发育过程,选择形态好的胚胎移植。结果29个成熟卵母细胞冻融后存活22个(存活率75．86％),17个正常受精(受精率77．27％),形成胚胎12枚(胚胎形成率70．59％),移植9个胚胎。4例接受赠卵者中1例获临床妊娠。结论慢速冷冻快速融冻人卵母细胞是一种可行的卵母细胞的冻融方法。并获得赠卵临床妊娠成功。     

冷冻载体对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究

目的探讨不同冷冻载体对小鼠卵母细胞快速玻璃化冷冻回收率、复苏率和解冻后胚胎发育潜能的影响。方法以小鼠卵母细胞为实验材料,以玻璃化冷冻方法冻存小鼠卵母细胞,分别以冷冻叶片（A）组、冷冻小钩（B）组、电镜铜环（C）组、自制冷冻叶片（D）组为冷冻载体冷冻小鼠卵母细胞,通过对解冻后卵子回收率、复苏率、卵子受精率及早期胚胎发育率等分析判断冻存效果。结果回收率D组明显低于其他3组,差异有统计学意义（P〈0.01）;D组与其他3组卵母细胞冷冻保存后卵子复苏率、胚胎受精率、继续发育潜能的比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 4种玻璃化冷冻载体都是小鼠卵母细胞快速玻璃化冷冻保存中可行的冷冻载体,自制叶片组的卵子回收率明显低于其他3组,需更进一步熟练叶片制作的技术和实验人员操作技能。     

卵细胞质内单精子注射治疗不孕症34例临床总结

目的总结应用单精子卵细胞质内注射（ICSI）治疗不孕症的临床效果。方法对34对男性因素、原因不明、受精障碍不孕患者采用GnRHa长周期促排卵方案,给有第一极体的卵细胞行单精子注射。结果34例34个治疗周期中,1例因反应不良取消。取卵数378个,注射卵数317（83．9％）个,正常受精卵231个（72．9％）卵裂228（98．3％）个,良好胚胎99（43．4％）个,平均移植胚胎数36个,临床妊娠12例（移植周期妊娠率为36.4％）。结论ICSI是治疗男性因素、原因不明、受精障碍等因素引起不孕症的一种切实可行的方法。     

常规体外受精后第二极体滞留的观察

目的对常规体外受精(CONV)和单精子胞浆内注射(ICSI)后三原核(3PN)的发育进行分析,估计因第二极体滞留增加3PN形成的比率。方法对11个月中147个周期的数据进行分析。对来自CONV(n=1016)和ICSI(n=760)的成熟卵子在授精后16～18h进行评估。卵巢刺激方案和体外培养条件都相同。结果CONV和ICSI的正常受精率分别为80．81％和76．26％(P=0．032),3PN形成率分别为3．16％和0．81％(P=0．002),卵子死亡率分别为0．22％和1．30％(P=0．018)。结论ICSI组3PN形成率大约是CONV组的1／4。根据两组数据推断CONV后0．81％的3PN发育是由第二极体滞留造成的,提示2．35％的CONV卵为双精受精。     

常规IVF不受精周期行补救卵母细胞单精子注射

 【目的】探讨常规体外受精胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET）不受精时,应用卵母细胞单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）技术进行补救授精的临床意义。【方法】2001年8月～2005年8月,在499个常规IVF-ET周期中有25个周期完全不受精,进行补救ICSI,并与同期实施的179个正常ICSI周期进行比较。【结果】补救ICSI组与正常ICSI组比较,HCG日平均血清雌二醇水平、每个成熟卵泡平均血清雌二醇量、每个周期的获卵数无明显差别,补救ICSI受精率为57.7%,低于正常ICSI组（67.8%）,补救ICSI组平均每个周期获得胚胎数（7.8±3.9）比正常ICSI（10.0±4.9）组少,且有统计学意义（P〈0.01）。补救ICSI组≥4细胞的胚胎占总胚胎数的54.5%,低于正常ICSI组（87.5%）,有统计学意义（P〈0.01）。正常ICSI组妊娠率为38.5%,补救ICSI组无一例妊娠。补救ICSI组中有8例在下一周期行ICSI,有2例妊娠并分娩2个健康女婴。【结论】补救ICSI虽可以避免取消IVF周期，但其受精率和妊娠率低，其临床应用价值还有待于进一步探讨。对于常规IVF不受精的患者，再次治疗时可考虑行ICSI助孕。     

Effect of Mitochondrial Transplantation from Cumulus Granular Cells to the Early Embryos of Aged Mice

Objective To assess the role of mitochondria in the early embryonic development of ageing mice.
Methods Mitochondria isolated from cumulus granular cells of aged mice were microinjected into oocytes or zygotes of aged mice. In the setting of oocyte injection, mitochondria were transferred via intracytoplasmic sperm injection （ICSI＋MIT）, and ICSI without mitochondrial transfer. In the setting of zygote injection, mitochondria were directly microinjected into fertilized oocytes （MIT）, and those injected with buffer alone （mock injection） or not injected （uninjected） served as controls.
Results Although the rates of oocyte cleavage between ICSI and ICSI＋MIT groups were not statistically different （P〉0.05）, the rate of blastocyst in the ICSI＋MIT group was significantly higher than that in ICSI group （P〈0.05）. Although both the cleavage and blastocyst rates of mock injection group were significantly lower than those of uninjected group （P〈0.05）, likely due to mechanical damages of the cells by microinjection, the decrease of these rates was prevented by mitochondrial transfer. After mitochondrial transfer, the rates of both cleavage and blastocyst were significantly improved over the mock-iniection group （P〈0.05）.
Conclusion Mitochondrial transplantation can improve the developmental potential of early embryos of aged mice.     

温肾养血方提高高龄雌鼠卵母细胞质量和胚胎发育潜能的研究

目的 探讨温肾养血方提高高龄雌鼠卵母细胞质量和胚胎发育潜能的作用机制。方法 按随机数字表法将8月龄ICR小鼠分为对照组、血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）组、温肾养血组、温肾组、养血组,观察用药后各组受精率和卵裂率,卵母细胞和受精卵线粒体的表达情况。结果 温肾养血组、温肾组、养血组的受精率和卵裂率明显高于对照组和PMSG组（P<0.05）,温肾养血组的受精率和卵裂率最高（P<0.05）。2细胞率、4细胞率、8细胞率、桑葚胚率和囊胚率,温肾养血组均比PMSG组高且差异有统计学意义（P<0.05）。卵母细胞和受精卵中的线粒体DNA拷贝数温肾养血组最高,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 温肾养血方可能通过调控卵母细胞线粒体DNA拷贝数提高卵母细胞质量和胚胎发育潜能。     

显微注射受精时第一极体位置和卵母细胞膜穿破类型对受精和胚胎发育的影响

回顾分析了782个经卵母细胞浆内单精子注射（ICSI）的卵母细胞，第一极体位于12点和6点时，卵母细胞膜穿破方式为显微注射针直接进入胸浆内，卵膜穿破，不形成凹痕（A）及显微注射针进入卵母细胞内，回吸少量胞浆，卵膜在细胞中部穿破，形成轻微的凹痕（B）两种类型时的卵母细胞存活率，卵母细胞受精率和卵裂胚胎的发育质量。结果显示：第一极体位于12点和6点时的卵母细胞存活率，卵母细胞受精率，卵裂胚胎发育质量差异均无显著性，卵母细胞膜穿破方式为A类型时的卵母细胞存活率，卵母细胞受精率，卵裂胚胎发育质量均显著低于B类型组，提示：显微注射受精时的第一极体位置对卵母细胞的受精和卵裂的影响不大，但不同卵母细胞膜穿破类型会影响受精和胚胎发育。     

一种非Piezo依赖的高卵子存活率小鼠显微授精技术

目的对已建立的非Piezo依赖的小鼠显微授精技术作进一步改良,以获得更高的卵子存活率。方法将卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)技术中对卵子深吸持后直接深穿刺(一步法非Piezo-ICSI组)的步骤分成两步进行(两步法非Piezo-ICSI组):先浅吸持后浅穿刺,再进一步深吸持后深穿刺;另以孤雌激活发育的卵子作为卵子质量对照组。比较两步法非Piezo-ICSI组与一步法非Piezo-ICSI组卵子的存活率、原核出现率和卵裂率。结果两步法非Piezo-ICSI组的卵子存活率(92.2%)显著高于一步法非Piezo-ICSI组(83.7%)(P<0.01);而原核出现率和卵裂率与一步法非Piezo-ICSI组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论小鼠卵子胞膜在被新型持卵管深吸持时的变形造成了部分卵子胞膜变脆,两步法吸持穿刺在深吸持前进行了穿刺,避免了脆性敏感时的穿刺,有利于卵子存活。