具有抗氧化活性的含硒短肽的研制

【立论依据】 硒蛋白是微量元素硒发挥生物学功能的主要形式。人体中硒蛋白在抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等方面都具有显著的作用,其中抗氧化活性是多种硒蛋白最核心的生物学功能。研制一种具有潜在应用价值的、类似于硒蛋白的抗氧化活性的含硒短肽具有重要意义。 【设计思路】 选取抗氧化活性最强的硒蛋白如硒蛋白P、谷胱甘肽过氧化物酶等,设计出3~5种含硒代半胱氨酸活性中心的硒蛋白截短型的短肽,根据硒蛋白基因表达的特殊性构建其表达载体及其哺乳动物细胞表达体系,实现此类含硒短肽的准确、高效的翻译,再通过抗氧化检测筛选出具有应用开发价值的短肽。 【实验内容】 (1)用于硒蛋白基因工程表达的哺乳动物细胞株的建立:选择在人类硒蛋白翻译过程中将编码硒代半胱氨酸密码子TGA正确解码时起着重要作用的3个反式作用因子,即SECIS 结合蛋白2(SBP2)、Sec特异延伸因子(EFSec)和核糖体蛋白L30(RPL30),将它们的编码基因分别克隆并构建为1个三基因表达载体pcDNA3.1-SBP2/Efsec/RPL30,稳定转染HepG2细胞系获得目的基因高表达的单克隆细胞株;(2)利用生物信息学的方法,筛选和设计硒蛋白截短型的短肽,并将其编码基因插入真核表达载体pcDNA4HisMaxB获得相应的重组载体;(3)利用各重组载体分别对已建立的转基因细胞株进行稳定转染,使目的基因表达并纯化获得含硒短肽;(4)利用常规的抗氧化检测方法,考察各种含硒短肽体外抗氧化活性,并筛选出最佳者用于后续研究。 【材料】 人肝癌细胞系HepG2;质粒pcDNA3.1、pcDNA4HisMaxB;各种基因工程工具酶及常规试剂;细胞培养及转染试剂;抗氧化检测试剂盒等。 【可行性】 硒蛋白复杂的翻译机制已经逐渐阐明,在原核生物细胞中利用反式作用因子提高硒蛋白表达已取得成功,为真核表达提供重要的启示,我们的设计在理论上是可行的;实验室相关技术方法及条件成熟,完全可满足本研究的要求。 【创新性】 具有抗氧化活性的硒蛋白分子量大限制了其药用价值,我们研究中将获得截短型的含硒短肽从而使其具有应用开发价值。此外,应用3个反式作用因子构建硒蛋白基因工程表达体系也是本研究的一个创新。     

硒蛋白P在结肠癌组织中的表达及其意义

目的:研究结肠癌组织中硒蛋白P的表达及其意义. 方法:选用手术切除结肠癌组织30例,同时另取30例正常结肠组织作为对照,用免疫组化的方法观察硒蛋白P在结肠癌组织中的表达. 结果:硒蛋白P在结肠癌组织中的阳性表达率(60.0%)低于其在正常结肠组织中的表达率(80.0%),二者相差有统计学意义(P＜0.05);硒蛋白P在高、中分化病例中表达率(86.7%)高于低分化例病例中表达率(33.3%),二者相差有统计学意义(P＜0.05);硒蛋白P在Ⅰ～Ⅱ期病例中表达率为58.8%,Ⅲ期病例中表达率为61.5%,二者相差无统计学意义(P＞0.05). 结论:硒蛋白P在结肠癌组织中为低表达,与肿瘤的分化程度有关,与肿瘤的TNM分期无关.     

分泌型单链双功能抗体分子间接头的设计及软件分析

目的:利用生物信息学软件分析分泌型抗骨肉瘤单链双功能抗体融合蛋白的二级结构及其理化性质.方法:构建融合蛋白时,先进行连接肽的设计,选用通用酶切位点序列,运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析预测融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果:在编码ScFv与TNF的碱基之间引入连接肽,通过酶切位点获得的DNA序列,运用DNAssist核酸序列软件获得了融合蛋白的二级结构,并运用蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)预测了融合蛋白的理化性质.结论:应该充分利用生物信息学软件分析生物学信息,并不断对软件本身进行改进,生物信息学软件可提高药物开发进程,可利用生物信息学和遗传学信息来寻找和开发以基因为基础的药物.     

脑胶质瘤中P16、P15蛋白表达的研究

目的 :研究脑胶质瘤发生、演化及预后与P16、P15蛋白表达的关系。方法 :采用免疫组织化学技术对 45例石蜡标本中P16、P15蛋白进行了检测。结果 :Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中P16、P15蛋白表达阴性率 (6 0 %、6 5 % )高于Ⅰ～Ⅱ级 (2 8%、2 0 % ) ,P <0 .0 5、P <0 .0 1。 结论 :胶质瘤发生、演化及恶性程度可能与P16、P15蛋白阴性表达有关 ;P16、P15蛋白阴性表达在一定程度上反映了胶质瘤细胞的恶性生物学行为。     

硒蛋白对小鼠抗辐射损伤作用的研究

研究硒蛋白(Se-protein)对小鼠抗辐射损伤作用,并与无机硒作了对比.结果表明,硒蛋白和无机硒均可显著抑制辐射所诱导的小鼠染色体畸变(P＜0.01),二者相比,硒蛋白的效应更为突出(P＜0.01).两种硒还可有效抑制辐射对小鼠血液谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及血液脂质过氧化物(LPO)含量带来的影响,仍然是硒蛋白效应更为显著(P＜0.01).Se-蛋白质+60Co组小鼠GSH-Px活性(49.3±2.7)kU/L与空白组(30.7±2.1)kU/L相比P＞0.05,LPO浓度(13.6±3.8)μmol/L与空白组(11.7±2.7)μmol/L相比P＞0.05.硒蛋白还可有效抑制小鼠血液LPO的产生,并且表现出剂量与抑制作用呈正相关.     

重组人源胰岛素原C肽在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化

目的：构建一种新型表达载体（pEDCC），表达并纯化得到人源胰岛素原C肽。方法：将编码截短的门冬酰胺酶突变体（ansB-C），天然C肽，人IgG1铰链区（hinge），额外的酸敏感二肽（DP）以及富含碱性氨基酸的8肽（KRKRKKSR）的核苷酸序列依次分别插入pET28a载体中，构建表达载体pEDCC。在乳糖的诱导下，融合蛋白ansB-C—hinge-DPKRKRKKSRNGSGR-C-peptide以包涵体形式高效表达。融合蛋白经洗涤和乙醇分级沉淀纯化后，通过酸水解将PKRKRKKSRNGSGR-C-peptide释放出来。C肽N端14肽用胰蛋白酶切割，通过DE52柱与C—peptide分离。结果：构建的表达载体pEDCC序列正确，融合蛋白经分离纯化得到了高纯度的重组人源胰岛素原C肽。结论：以截短的门冬酰胺酶作为融合伙伴，并以富含碱性氨基酸的8肽调节等电点是一种生产重组人源胰岛素原C肽的有效方法。     

人肽抗生素hPAB-β分子的同源模建及其突变体设计

目的 :获得肽抗生素hPAB β的分子结构 ,设计其突变体。　 方法 :在序列比较的基础上 ,利用同源分子对hPAB β进行同源模建 ,并以此为基础设计其突变体 ,通过PCR引入突变法获得突变体基因序列 ,将其克隆到原核融合蛋白表达质粒 pQE CP4中 ,转化JM 10 9大肠杆菌进行表达。　 结果 :模建结果表明 ,hPAB β由一个α螺旋和3个 β片层构成 ,二级结构保守 ,具有两亲性结构 ;其α螺旋推测与活性寡聚体形成有关 ;Asp4带负电 ,可能通过削弱寡聚体中央微孔口处阳电荷富集区而降低目的分子的生物学活性。利用PCR成功克隆了所设计的突变体基因 ,通过构建融合蛋白表达质粒 ,实现了突变体融合蛋白在大肠杆菌中的表达。　结论 :基于分子同源模建的肽抗生素hPAB β突变体的设计、克隆和成功表达 ,为筛选肽链更短、抗菌活性保持不变或更强的新分子创造了前提     

重组人骨形成蛋白-7成熟肽的表达、纯化及活性的研究

目的:研究重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7m)羧基端140个氨基酸成熟肽的大肠杆菌表达、纯化及活性,为其实际应用打下基础.方法:将编码此成熟肽的cDNA亚克隆入含PL启动子的表达质粒pDH2中,构建表达质粒pDH2-B7m,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达;通过包涵体洗涤、离子交换层析纯化目的蛋白;用Western blot验证透析复性后表达蛋白的抗原性,用含荧光素酶报告基因专门用于检测BMP活性的细胞株C2C12-K4检测其活性.结果:成功构建了PL启动子控制的原核表达载体pDH2-B7m;42℃诱导5 h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白40.3%,表达产物以包涵体形式存在.包涵体经洗涤、离子交换层析纯化,目的蛋白纯度至少在96.0%以上.Western blot实验证实其抗原性,细胞株C2C12-K4反应的检测表明透析复性后的rhBMP-7m有较强的活性.结论:成功地在E.coli中表达了hBMP-7m重组蛋白并证明其有较强的生物活性.     

猪带绦虫CDC37基因及其蛋白结构特征的生物信息学分析

目的:分析和预测猪带绦虫细胞分裂周期蛋白37( Ts CDC37)基因及其编码蛋白的结构和特性,用于指导其生物学功能的实验研究.方法:利用生物信息学网站所提供的有关基因和蛋白序列和结构功能分析工具,以及专业的生物信息学软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别CDC37基因,对猪带绦虫CDC37基因编码的蛋白质进行生物信息学分析.结果:该基因全长1 203 bp,编码400个氨基酸,为全长基因.Genebank中与日本血吸虫的cell division side 37 homolog蛋白的一致性最高,达60％.相对分子量理论预测值为46802.5 ku,预测其有6个主要的B细胞抗原表位,无亚细胞定位序列.结论:应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了猪带绦虫CDC37基因全长序列并预测得到其结构与功能方面信息.     

人TFAR19的定点突变及其重组蛋白的表达、纯化和功能分析

目的:了解凋亡相关新基因TFAR19编码蛋白分子中潜在的Ser100磷酸化位点与其促凋亡效应的关系.方法:利用重叠延伸PCR定点突变技术构建TFAR19 Ser100→Ala100突变体,用DNA测序技术验证,大肠杆菌表达,离子交换技术纯化重组突变蛋白,将其加入培养的白血病细胞株HL-60,通过PI染色,流式细胞仪分析,观察突变重组蛋白的促凋亡效应.结果:构建成TFAR19 Ala100突变体,并经DNA测序所证实,在大肠杆菌中获得了高水平表达,Western blot表明突变型重组蛋白与野生型具有相同的免疫学活性,流式细胞仪分析发现突变蛋白对撤除血清的HL-60细胞具有与野生蛋白相似的剂量依赖性促凋亡效应. 结论:TFAR19 分子中潜在的Ser100磷酸化位点对其促凋亡效应无影响,提示TFAR19发挥其生物学活性时无需cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶活化.     

基于抗原表位分析的P-糖蛋白表达研究

目的:对P-糖蛋白抗原表位进行分析和表达研究.方法:联合运用多种方法对P-糖蛋白的二级结构和表面特性进行分析,运用化学和酶法相结合的技术合成P-糖蛋白基因,再克隆入表达载体pGEX-2T进行表达、鉴定及纯化.结果:位于P-糖蛋白胞外段的抗原表位位点仅见于氨基酸残基82as～115as(Ⅰ)、741aa～760aa(Ⅳ)及800aa～816aa(Ⅴ). SDS-PAGE分析,表达出约29 kD大小的蛋白.结论:该基因片段的高效表达为进一步制备其抗体或筛选其特异性结合肽,进行靶向治疗等工作奠定了基础.     

急性传染性非典型肺炎病毒M蛋白片段抗原性鉴定及其B细胞表位分析

目的:鉴定原核表达的重组急性传染性非典型肺炎(SARS)病毒M蛋白N端1～43氨基酸(aa)的抗原性,并筛选其B细胞表位。方法:GlutathioneSepharose4B亲合层析柱纯化M融合蛋白,用SARS患者恢复期血清分别通过间接ELISA方法和Westernblot鉴定M蛋白片段的抗原性。为了定位B细胞表位,进一步将M蛋白片段截短为部分重叠的2段表达,分别表达含M蛋白N端1～28aa、16～43aa的融合蛋白,通过Westernblot检测B细胞表位所在位置。结果:获得了纯化的M融合蛋白;间接ELISA和Westernblot结果均证实,M蛋白片段有很强的抗原性;并进一步明确B细胞表位位于M蛋白N端1～15aa片段中。结论:原核表达的SARS病毒M蛋白片段N端1～15aa含有一个很强的B细胞表位,这将有助于SARS诊断试剂的研制,也可为多肽疫苗的研制提供帮助。     

截短型A组轮状病毒VP6在E.coli中的高效表达

目的：研究A组轮状病毒（RV）组特异性抗原（VP6）片段的表达，为RV免疫检测技术提供材料。方法：以pcDNA3.1 VP6为模板，通过PCR扩增得到VP6的截短突变体编码基因VP6 1，将其插入谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体pGEX 5X，在E.coli中用异丙基 β D 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。对表达产物进行SDS PAGE和Western blot分析。通过改变宿主菌、培养基、IPTG浓度和培养温度等条件，提高目的蛋白的可溶性表达水平，使用GST Sepharose 4B亲合层析进行初步纯化。结果：选定VP6 氨基酸12～143片段为目的蛋白， PCR扩增其396?bp的编码基因片段，构建出pGEX 5X VP6 1。将该重组质粒转化E.coli后，SDS PAGE和Western blotting 分析均显示，含有截短VP6蛋白的重组融合蛋白GST::VP6 1在E.coli中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％。该蛋白主要以包涵体形式存在，经条件优化，最终通过低浓度IPTG、低温诱导提高重组蛋白的可溶性表达水平，GST亲和层析可对其进行初步纯化。结论：VP6 1蛋白在E.coli中可被高效表达和纯化，为下一步制备抗VP6的特异性单克隆抗体并用于免疫检测打下基础。     

乙型肝炎病毒全-X基因的克隆及原核表达

目的:构建乙型肝炎病毒全-X基因原核表达载体并在细菌中表达、纯化. 方法:利用基因重组技术,将全-X基因定向克隆于原核表达载体pET-32a( )多克隆位点中,限制性酶切和测序鉴定. 细菌表达产物及纯化后的产物经SDS-PAGE和Western免疫印迹分析. 结果:经限制性酶切分析及测序鉴定,证实成功构建全-X原核表达质粒. SDS-PAGE和Western免疫印迹分析表明重组质粒在大肠杆菌中表达. 结论:本研究将全-X基因定向克隆于原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达、纯化. 为进一步研究全-X的功能及制备相应抗体奠定了基础.     

人重组CD137-Fc分子的构建与真核表达

目的构建人CD137-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人CD137-Fc融合蛋白。方法从cDNA文库中用PCR扩增cD137全长编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，继续用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgGIFc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，转染293T细胞瞬时表达，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与免疫印迹进行鉴定。结果测序证实构建的CD137与CD137-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实cD137-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与免疫印迹证实其为人cD137-Fc蛋白。结论获得了纯化的hCD137-Fc融合蛋白，为探讨CD137在免疫自稳调节中的地位，以及探索CD137的其它生物学功能奠定了坚实的实验基础     

人酪氨酸酶抗原表位肽的表达、纯化及在白癜风患者中的抗原性检测

目的 表达人酪氨酸酶抗原表位肽,探讨其在白癜风患者自身抗体检测中的应用。方法目的基因合成后克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和Western印迹鉴定目的蛋白表达,以此蛋白为抗原,检测100例进展期白癜风患者和30名正常人血清IgG抗体情况。结果 成功构建重组表达载体,重组蛋白成功表达。应用凝胶分析系统分析蛋白表达量发现,目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的70％。融合蛋白经过谷胱苷肽S-转移酶试剂盒纯化后,其蛋白纯度达90％以上。100例白癜风患者中64例血清与目的蛋白结合反应呈阳性,30名正常人血清结合反应均呈阴性。结论 成功表达了人酪氨酸酶抗原表位肽,其在白癜风患者血清中具有抗原性。     

人ICOS-Ig融合蛋白的真核表达及其生物学活性

目的:真核表达人ICOS胞外区与IgG Fc融合蛋白,并对其生物学活性进行初步分析。方法:以RT-PCR方法克隆人ICOS胞外区片段和人IgG Fc片段,定向插入真核表达载体pSecTag2,构建重组质粒pSecTag2-ICOS-Ig,脂质体转染CHO细胞,可溶性表达并纯化ICOS-Ig融合蛋白。采用SDS-PAGE、蛋白质印迹、ELISA对融合蛋白进行鉴定,配体结合活性实验和混合淋巴细胞增殖反应实验检测融合蛋白的活性。结果:构建的ICOS-Ig融合蛋白表达载体在CHO细胞中表达ICOS-Ig蛋白。纯化获得的ICOS-Ig可以与配体ICOSL特异性结合,并抑制同种T淋巴细胞增殖反应。结论:成功构建了人ICOS胞外区与人IgG Fc融合蛋白真核表达系统,获得有生物学活性的ICOS-Ig融合蛋白。     

DPP-rhBMP-4m融合表达载体的构建和应用

目的:构建容易去除标签蛋白的大肠杆菌融合蛋白表达载体.方法:PCR方法获得带有Asp-Pro-Pro前缀的重组人骨形态发生蛋白-4成熟肽(recombination human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP-4m)编码序列并克隆入pRSET载体,转化大肠杆菌后诱导表达;经免疫印迹法鉴定融合蛋白;甲酸裂解去除6His标签后细胞学实验检测其活性.结果:构建的融合表达载体序列测定结果与预期结果一致;诱导表达的DPP-rhBMP-4m融合蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白量的37%,亲和层析后目的蛋白纯度为97%;免疫印迹法鉴定显示,该融合蛋白可与相应抗血清产生特异性反应;对C2C12细胞具有良好的生物活性.结论:成功构建了利于目的蛋白纯化的pRSET-DPP-rhBMP-4m融合表达载体.     

INHIBITION OF FARNESYL PROTEIN TRANSFERASE AND P21RAS MEMEBRANE ASSOCIATION BY D-LIMONENE IN HUMAN PANCREAS TUMOR CELLS IN VITRO

The monoterpene d-limonene inhibit the plasma membrane associated P21^ras expresion and the post-translational isoprenylatlon of P21^ras, a mechanism that may contribute to its efficacy in the ehemoprevention and therapy of chemically induced rodent cancers and some human solid tumor cells. In the present study, the relative abilities of d-limonene to inhibit membrane associated P21^ras expression in Imncreas tumorcell (PaCa) was carried out with Western blotting, and the inhibition of farnesyl protein transferase (FT-Pase ) activity during the Rns p~otebi isoprenylation and cell proliferation were determined. Concomitantly,the effects of d-limonene on P21^ras localization hy immunohimcchemistry and H-ras oncogene expression in PaCe tutor cell line by Northern blotting were observed. The results showed that ddimonene inhibited FPTase activity, thus to reduce P21H-ras isoprenylation, d limonene couM decrease P21^ras meanhrane asso-ciation and increase cytosolie accumulation of P21^ras This phenomenon was also noted when d-llmmaene-treated PaCe cells were stained immunohistcchemieally with anti-P21^ras antibody. It is suggested that the inhibition of FPTase activity was closely related with the inhibiton of P21^ras membrane assoclaticon aad the alteration of P21^ras localization. Inhibition ot farnesylation of P21^ras altered their intraeellulsr localization and, hence, disrupted their biological activity, hut no relationship with H ras oneogene expression was found.     

重组人可溶性突变体BAFF蛋白的制备及生物学活性的鉴定

目的制备高纯度的B细胞活化因子(BAFF)可溶性突变体(smBAFF)蛋白,鉴定其生物学活性。方法重组原核表达载体pET41a/smBAFF在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达smBAFF蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,超声碎菌,提取包涵体,Ni2+-NTA亲和层析纯化,复性,鉴定其生物学活性。结果经鉴定表达出相对分子质量为1.7×104的外源蛋白smBAFF,经Ni2+-NTA亲和层析纯化出该重组蛋白,复性后的smBAFF与B细胞具有较高的亲和力,但失去共刺激B细胞增殖的能力,且能竞争性抑制天然sBAFF的作用。结论成功制备具有B细胞结合活性而失去刺激B细胞增殖活性的smBAFF,为以smBAFF为靶向载体在B细胞恶性增殖性和异常活化性疾病治疗研究奠定基础。