大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定

目的　构建大容量噬菌体单链抗体库 ,从中筛选人源单链抗体 (ScFv)。方法　从正常成人外周血和新生儿脐血分离淋巴细胞 ,用RT PCR扩增轻链可变区基因 (VL)和重链可变区基因(VH) ,通过重叠PCR法将VH 和VL 拼接形成ScFv基因 ,并克隆入噬菌体表达载体PDF ,得到ScFv初级噬菌体抗体库。以高MOI超感染cre 菌株BS136 5 ,通过loxp cre定位重组系统 ,介导轻重链的组合配对 ,得到大容量抗体库 ,用多种抗原对抗体库进行生物淘筛 ,鉴定抗体库的性能。结果　获得了 6×10 10 的大容量单链噬菌体抗体库。分别用卵清蛋白、胃蛋白酶、铁蛋白、人角蛋白、人TNF α、地高辛等6种抗原进行筛选 ,均得到多样性的特异性噬菌体抗体。结论　经loxp cre定位重组系统在单细胞内重组成功地构建了大容量单链噬菌体抗体库 ,初步尝试对 6种抗原进行筛选均获成功 ,提示该抗体库可用于制备具有应用前景的人源抗体     

从大容量人源噬菌体抗体库中筛选抗黑素瘤特异性抗体

目的:用黑素瘤(MM)细胞系筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与MM细胞特异性结合的人源性单链抗体(scFv)。方法:用完整的MM细胞对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,并通过细胞ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步做DNA序列测定和免疫组化染色鉴定。结果:从80个随机挑选的克隆中,筛得1株抗MM细胞的抗体,该抗体对人的鳞癌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、角蛋白、胰蛋白酶、转铁蛋白及小鼠IgG等细胞或抗原的结合反应均呈阴性。免疫组化染色显示,该抗体与MM细胞系Libr的染色呈阳性,对黑素细胞和痣细胞的染色呈阴性。DNA测序结果表明,该抗体VH属于人IgGVH5亚群,VL属于人Vκ亚型。结论:通过筛选噬菌体抗体库获得到1株抗MM细胞的特异性抗体,为MM的靶向治疗研究奠定了基础。     

人噬菌体抗体库的构建及人源性bFGF抗体的筛选

目的选用含高效价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细胞为材料,构建人噬菌体抗体库,并从中筛选抗bFGF抗体克隆。方法收集自身免疫病患者外周血,提取淋巴细胞总RNA后逆转录得到cDNA第一链,经PCR扩增重链Fd段和轻链基因,分别构建到噬菌粒载体pComb3中,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL1Blue,以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人噬菌体抗体库。经过3轮固相筛选,获得能结合bFGF的抗体克隆,并用ELISA进行进一步鉴定及筛选,获得具有高亲和力的抗bFGF噬菌体抗体克隆。结果构建的人源噬菌体抗体库库容为2.5×107,经3轮筛选获得具有bFGF特异性的Fab噬菌体抗体克隆。结论构建了人噬菌体Fab抗体库,并能够从中筛选出与bFGF特异结合的抗体克隆,为bFGF抗体药物研究奠定基础。     

噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库(surface display phage antibody library)技术用PCR扩增出抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面表达技术(surface display),把Fab段或单链抗体(single chain Fv,ScFv)表达在噬菌体表面,经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体。这一技术将表型和基因型联系在一起,使识别抗原的能力和进行再扩增的能力结合在一起,是一极为高效的表达、筛 选体系,使单抗的制备根本改观,在生物技术领域极具潜能。     

大容量人源Fab噬菌体展示抗体库的构建及抗CD276抗体筛选

目的构建大容量人源Fab噬菌体库,筛选并鉴定抗CD276的特异性抗体。方法通过采集10位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,插入噬菌体载体pCANTAB5H中,构建人源Fab噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后,随机挑取96个单克隆进行phage-ELISA鉴定,筛选出与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。结果成功构建库容为5×1010的噬菌体抗体库,从中筛选到11株阳性克隆,对其进行测序鉴定,表明该11株克隆的序列均一致,ELISA证实其对抗原CD276具有较强的结合性。结论构建了大容量人源Fab抗体库,从中获得具有抗CD276的人源Fab抗体片段,为进一步的研究和应用提供实验基础。     

多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

目的:构建多样性良好的人源天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血中分离淋巴细胞,以RT-PCR和半巢式PCR扩增重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,以重叠延伸PCR将VH、VL组装成scFv基因,并将其克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中。以pCANTAB-5E电转化大肠杆菌TG1,构建人源天然噬菌体抗体库,测序分析抗体基因的家族信息和多样性,并用多种抗原对其进行筛选。结果:获得了库容为2×108的人源天然噬菌体抗体库。分别用5种抗原对其进行筛选,均可获得特异性噬菌体抗体的富集。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。     

抗人纤维蛋白噬菌体单链抗体库的构建和鉴定

目的应用噬菌体展示技术构建抗人纤维蛋白单链抗体(scFv)文库,筛选高亲和力抗人纤维蛋白scFv并进行鉴定。方法利用人纤维蛋白免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸聚合酶链反应(PCR)将VH和VL基因拼接成scFv基因,SfiⅠ/NotⅠ双酶切克隆入pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1构建成库,采用人纤维蛋白原对抗体库进行负筛选,人纤维蛋白进行正筛选,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测阳性克隆的抗原特异性并进行测序分析。结果构建了库容为8.7×106的抗人纤维蛋白scFv库,ELISA测定显示scFv具有较高的抗原特异性;抗人纤维蛋白scFv基因序列长732 bp,编码244个氨基酸,VH和VL基因均有明确的3个互补决定区和4个骨架区。结论成功构建了抗人纤维蛋白scFv文库,并筛选到高亲和力的抗人纤维蛋白scFv,为新型血栓显像剂的开发奠定了实验基础。     

鸡源性免疫单链抗体库的构建与鉴定

目的:建立鸡源性免疫单链抗体库的构建方法。方法:根据鸡抗体基因结构特点,借助噬菌体展示技术原理,以免疫变形链球菌全菌抗原后的鸡脾脏B细胞为抗体基因来源,构建鸡源性免疫单链抗体库;采用固相淘选法筛选抗变形链球菌的噬菌体单链抗体(scFv),以此鉴定所构建的免疫单链抗体库。结果:从鸡脾脏总RNA中扩增出了鸡免疫球蛋白的轻、重链可变区的全部基因;得到了一个库容量为1·6×107的鸡免疫单链抗体库;筛选到了抗变形链球菌的噬菌体scFv,并测出了其DNA序列。结论:结合噬菌体抗体库技术原理与鸡抗体基因结构的特点,可以成功地构建鸡源性免疫单链抗体库。     

噬菌体抗体库技术的构建及应用研究进展

噬菌体抗体库（phage antibody library）技术是由噬菌体展示技术发展而来的一项新型抗体制备技术。噬菌体抗体库技术的基础,噬菌体展示技术,发展自上世纪80年代中期。1985年,美国密苏里大学的Smith[1]首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段加以改造。     

米尔比霉素肟化物ScFv噬菌体展示抗体库的构建

目的构建具16元大环内酯共性结构小分子物质的特异性抗体库。方法免疫原MILO-BSA免疫小鼠后从脾细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增得到全套抗体重链可变区基因(VH)及轻链可变区基因(VL),SOE-PCR将VH、VL片段拼接扩增得到单链抗体可变区基因片段(ScFv)。将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化感受态大肠杆菌,辅助噬菌体超感染得到上清液即为噬菌体抗体库。结果RT-PCR扩增出长360bp左右的抗体重链可变区基因(VH)及340bp左右的轻链可变区基因(VL),SOE-PCR扩增得到750bp左右的ScFv基因片段,成功构建了库容量为2.4×106,滴度为2.0×1012pfu/mL的噬菌体单链抗体库。结论构建的抗体库目的片段连接率较高,多样性较好,为下一步16元大环内酯类小分子物质高特异性抗体的筛选奠了基础。     

抗P选择素免疫小鼠单链抗体噬菌体展示文库的构建和筛选

目的 构建抗P－选择素的全套单链抗体噬菌体表面展示文库，从中筛选与P－选择素高亲合力的单链抗体，为其临床应用奠定基础。方法 从P－选择素免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后，用抗体可变区混合引物扩增全套轻、重链可变区基因，经重叠延伸反应，装配成单链抗体（ScFv)基因，将其克隆到噬菌体载体pHEN1中，构建单链抗体噬菌体抗体库。对抗体库进行亲合筛选后，ELISA法鉴定抗活化血小板单链抗体。结果 经过5轮“吸附－洗脱－扩增”的富集过程，phage-ELISA得到一个ELISA活性较高的与P－选择素结合的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。结论 成功构建了全套抗P－选择素单链抗体噬菌体展示文库，并筛选得到具有P－选择素结合能力的单链抗体基因。     

噬菌体表面呈现抗人红细胞血型A抗原单链抗体的研究

目的 构建表达抗人红细胞血型Ａ抗原５０Ａ杂交瘤细胞的单链抗体（ＳｃＦｖ）。方法 应用重组噬菌体抗体技术,从５０Ａ杂交瘤细胞中分离、构建单链抗体基因,并将其克隆入噬粒ｐＣＡＴＮＡＢ５Ｅ中,转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ－Ｂｌｕｅ,辅助噬菌体援救构建５０Ａ噬菌体单链抗体库;采用完整红细胞亲和富集法淘选阳性重组噬菌体,鉴定重组噬菌体并进行序列测定分析;免疫印迹试验检测重组单链抗体的特异性抗原活性。结果 用Ｍ１３     

人源性抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达及活性测定

目的 :制备有活性的人源性抗HBsAg单链抗体。方法 :应用噬菌体表面呈现技术获得人抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗体的Fab片段 ,并将VH 和VL 基因以 (Gly4Ser) 3linker连接成单链 ,插入表达载体pQE40 ,筛选大肠杆菌高表达菌株。结果 :工程菌表达优化试验表明 ,在OD6 0 0 为 0 6时开始诱导 ,持续 6h ,目的蛋白表达量最高可达菌体总蛋白的 31%。包涵体变性后上样镍离子螯合层析柱一步纯化 ,收集目的峰 ,透析复性 ,得纯度为 97%的重组单链抗体 ,其亲和常数为 0 2 3× 10 8mol L。结论 :抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌内获得高效表达 ,经变性和复性 ,得到有活性的单链抗体 ,氨基酸组成正确。为进行临床前研究打下基础。     

从噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白单链抗体

目的　从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体 (scFv)并进行鉴定。方法　以人表皮角蛋白为抗原 ,通过“吸附 洗脱 扩增”过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白单链抗体 ,对其抗原结合活性、识别角蛋白的相对分子质量 (Mr)和序列进行分析鉴定。结果　经过筛选 ,获得 6株能与角蛋白特异性结合的阳性克隆 ,所识别角蛋白的Mr 相同 ,均在 5 6 0 0 0～ 5 70 0 0之间 ;序列分析显示 ,所获抗体克隆的可变区基因分别属于免疫球蛋白基因家族的不同亚群。结论　利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫制备出高特异性的人源性抗角蛋白单链抗体     

用于大容量噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的:构建一个适用于大容量抗体库的噬菌体抗体表达载体。方法:通过插入人工合成寡核苷酸、PCR介导的定位突变等技术,将载体p3MH进行改造,使之更适于构建大容量抗体库。通过噬菌体抗体的表达、ELISA及细胞内重组试验鉴定所获得的表达载体。结果:通过插入loxp511和loxp序列,将Lac启动子更换为阿拉伯糖启动子、改造抗体基因克隆位点等,将p3MH改造成pAL。经检测pAL可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,其表达调控更为严密,可以在cre+细菌胞内发生预期的loxp-cre介导的定位重组。结论:所获得的表达载体pAL适用于构建大容量Fab噬菌体抗体库。     

从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛人单链抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛（Dig）人单链抗体（ADA ScFv）,为Dig中毒的诊断和治疗提供人源性抗体。方法：①以改良法制备Dig-BSA偶联物②以固相化的Dig-BSA偶联物对人噬菌体ScFv抗体库进行了4轮筛选,通过ELISA筛选出能结合Dig的抗体克隆并鉴定其活性,通过ELIS竞争抑制实验分析其特异性,对阳性克隆的DNA进行测序分析。结果：①在对抗体库的筛选过程中可见有明显的富集;②获得一株可结合Dig及其类似物的阳性克隆;③阳性克隆的可变区分别属于VH5和Vλ1亚群。结论：利用噬菌体抗体库技术获得了能与Dig及其它洋地黄类药物结合的人ADA ScFv,经过一步分析及抗体工程改造后,有可能为临床上诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源性抗体。     

抗KGla细胞噬菌体展示ScFv的筛选及鉴定

目的 应用ＫＧ１ａ细胞（髓系白血病细胞系）筛选噬菌体抗体库,获得能以一定特异性结合ＫＧ１ａ细胞的单链抗体（ＳｃＦｖ）,克隆重其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布。方法 用完整的ＫＧ１ａ细胞筛选一个经ＫＧ１ａ细胞免疫小鼠脾细胞的ＳｃＦｖ噬菌体抗体库,重复筛选４轮;细胞ＥＬＩＳＡ鉴定了其中９６个克隆重与ＫＧ１ａ细胞的结合反应;从２６个ＫＧ１ａ细胞ＥＬＩＳＡ阳性克隆中挑选了３个克隆重,进一步用免疫     

噬菌体展示技术在抗体亲和力成熟中的应用进展

抗体因其高度的特异性在诊断和靶向治疗上一直备受青睐,相关行业发展也是突飞猛进。噬菌体展示技术作为一种抗体库构建技术,不仅可应用于特异性抗体的筛选,也可应用于对已获得的低亲和力抗体进行亲和成熟的研究。该方法主要利用VH和VL的随机重组,能在一定程度上模拟体内抗体亲和力成熟的过程,使噬菌体展示技术在提升抗体亲和力方面拥有许多优势,以下对噬菌体展示技术在亲和力成熟方面的应用进行综述。