复制缺陷型人IL-2重组腺病毒的制备与鉴定

目的将人ＩＬ－２的重组腺病毒载体与Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ末端肽复合物同源重组，高效制备人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒，并进行体外表达和活性检测。方法将含全部编码序列的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ置于真核表达载体ｐＣＩｃｃ的ＣＭＶ启动子下游，切出含ＣＭＶ启动子、人ＩＬ－２ｃＤＮＡ和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号肽序列的ＣｌａＩ片段，插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘｌｏｗ，选择左向转录的人ＩＬ－２重组腺病毒载体ｐＡｘｌｃｗ．ＣＩｈＩＬ－２与经ＥｃｏＴ２２Ⅰ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞；通过同源重组获得人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒；体外转染人宫颈癌ＨｅＬａ细胞、人Ｔ细胞淋巴瘤Ｈｕｔ７８细胞和原代人皮肤成纤维细胞。结果扩增到的病毒滴度达２．１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ；体外转染的人肿瘤细胞均检测到ＩＬ－２的表达（４００～２６００Ｕ／１０６细胞／２４小时）。结论所制备的复制缺陷型重组腺病毒能有效介导人ＩＬ－２的基因转移，可望用于肿瘤基因治疗的临床研究。     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及共真核表达的研究

目的 克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ＭＣＰ）的ｃＤＮＡ，并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ 方法，从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ中扩增编码人ＭＣＰ分子的ｃＤＮＡ片段，快速克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体，测定共序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ载体，电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，经ＦＡＣＳ检测筛选表达ＭＣＰ的阳性细胞克隆，用补体容破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果 ＲＴ－ＰＣＲ     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

GM-CSF重组腺病毒扩增的骨髓树突状细胞体外经肿瘤抗原刺激后诱导抗肿瘤免疫应答

用ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒感染小鼠骨髓细胞，观察扩增到的骨髓树突状细胞的生物学功能。结果表明，ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒一次性感染骨髓细胞，１ｗ后能从一只小鼠股骨中扩增到２．４×１０６～３．３×１０６树突状细胞，扩增到的骨髓树突状细胞表达ＭＨＣ－Ⅱ、ＭＨＣ－Ⅰ、Ｂ７－１、Ｂ７－２和Ｉ－ＣＡＭ－１等免疫分子，分泌一定水平的ＧＭ－ＣＳＦ，对同种异体Ｔ细胞具有很强的刺激活性，体外经Ｂ１６肿瘤瘤苗刺激后免疫同系小鼠，能诱导出抗原特异性的ＣＴＬ活性，使免疫动物产生更强的保护性免疫反应，抵抗Ｂ１６细胞的攻击。提示可用ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒从骨髓中扩增足够数量的树突状细胞，用于肿瘤的免疫治疗和基因治疗。     

4型腺病毒载体的构建和β—半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４质粒，质粒ｐＡｄ４和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂｐ腺病毒晚期表达盒，在所构宾腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ     

HBsAg S与GM—CSF融合基因在L929细胞中的表达

将乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）主蛋白的编码基因Ｓ与人ＧＭ－ＣＳＦ基因融蛤 后,插入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ１中,经质粒酶切鉴定及ＤＮＡ序列分析证明,目的基因插入ｐｃＤＮＡ１的ＣＭＶ启动子下降。以获得的重组质粒ｐＳＧＭ转染Ｌ９２９细胞,经ＲＴ－ＰＣＲ及细胞原位杂交证实目的基因的转录。     

E—选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定，将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入一以天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ＾－１４３细胞，用     

以Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统表达人FGF-9

目的：在Ｂａｃｍｉｄ－杆状病毒－昆虫细胞系统中表达人ＦＧＦ－９。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,自新鲜人脑胶质瘤组织获取人ＦＧＦ－９全编码区ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＣＲ＾ＴＭⅡ质粒及ｐＹＥＸ４Ｔ－１真核表达质粒,经ＤＮＡ自动测序仪进行ＤＮＡ序列测定。将人ＦＧＦ－９ｃＤＮＡ定向克隆入ｐＦａｓｔＢａｃ质粒,进一步将其转座入Ｂａｃｍｉｄ中,在昆虫细胞Ｓｆ９中进行表达,采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对表达产物进行分析。     

不同载体对癌胚抗原DNA疫苗诱导小鼠产生抗—CEA水？…

目的 将癌胚抗原（ＣＥＡ）基因克隆入载体ｐｃＤＮＡ３及ＶＲ１０１２中，比较两套重组质粒在体内表达并诱导小鼠产生抗－ＣＥＡ的差别。方法 通过基因工程技术构建两套ＣＥＱ真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ＣＥＡ及ＶＲ１０１２－ＣＥＡ，将重组质粒肌注ＢＡＫＢ／ｃ小鼠，运用ＥＬＩＳＡ法检测不同时间肌肉组织表达ＣＥＡ水平及血清中抗－ＣＲＡ的产生。结果 ｐｃＤＮＡ３－ＣＥＡ在肌肉内呈低表达ＣＥＡ，最高时为０．１８ｍｇ／     

DNA修复蛋白MGMT基因的克隆及转导脐血CD23^＋细胞后耐药特征的研究

目的：增强脐血ＣＤ３４＾＋造血细胞对化疗药物的耐药表型,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率和耐药基因特性,以及在脐血造血干细胞保护性基因治疗中的作用和意义。方法：应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从人肝细胞中获得编码六氧甲基鸟嘌呤－ＤＮＡ－甲基转移酶（Ｏ＾６－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,ＭＧＭＴ）ｃＤＮＡ;利用基因重组技术,将其克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体并构建了逆转录病毒载体Ｇ１Ｎａ－ＭＧＭＴ;应用脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ基因转移法将后者导入ＧＰ＋Ｅ８６和ＰＡ３１７病毒包装细胞,以卡氮芥１,３－Ｂｉｓ（２－Ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）－１－Ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＢＣＮＵ）加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染脐血ＣＤ３４＾＋细胞。应用ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈ     

B7—1（CD80）基因的克隆及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人Ｂ淋巴瘤细胞系Ｒａｊｉ中克隆到Ｂ７－１（ＣＤ８０）ｃＤＮＡ，并经测序证实，将其插入至真核表达载体ｐＬＸＳＮ中，用脂质体转染小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６，Ｇ４１８筛选，并经流式细胞仪检测，得到了细胞表面表达Ｂ７－１的重组克隆。ＰＣＲ从其基因组ＤＮＡ中扩增到Ｂ７－１基因，提示Ｂ７－１ ｃＤＮＡ已整合至宿主细胞的基因组ＤＮＡ中，本文为研究Ｂ７－１在肿瘤免疫中所起的作用奠定了基础。     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达？…

目的 构建登革２型病毒Ｅ基因的真核表达载体,实现登革病毒Ｅ蛋白的真核表达。方法 采用逆录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增登革２型病毒（ＮＧＣ株）包膜糖蛋白Ｅ基因全长片段,克隆人真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的Ｐｃｍｖ启动子下游,构建重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｅ,用脂质体转染法转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,表达产物以免疫荧光、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹进行分析检测。结果 成功构建了重组真核表达质粒ｐｃＤＮ     

小鼠白细胞介素6的cDNA克隆及其在昆虫细胞中的表达

本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＬＰＳ刺激后的小鼠腹腔巨噬细胞，扩增小鼠ＩＬ－６ｃＤＮＡ，并克隆构建ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）ＩＬ－６质粒，继将小鼠所得ｃＤＮＡ克隆到ｐＶＬ１３９２载体上，利用杆状病毒ＡｃＮＰＶ表达系统在Ｓｆ９中进行瞬间表达，用ＩＬ－６依赖细胞株ＭＨ６０·ＢＳＦ２检测其表达活性，结果表明，感染后４８ｈ后就具有明显ＩＬ－６表达，由此可见，利用该系统可成功地表达小鼠ＩＬ－６基因。     

4型腺病毒载体的构建和β－半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段（７０．５－８３．０基因图谱单位）克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４（７０．５－８３）质粒，质粒ｐＡｄ４（７０．５－８３）和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂＰ腺病毒晚期表达盒，在所构建的腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ３区编码分子量为１９３００糖蛋白基因的３种Ａｄ４载体。将ｌａｃＺ基因插入载体表达区，与Ｂｅｌｌ消化的Ａｄ４ＤＮＡＡ片段共转染Ａ５４９细胞，ＯＮＰＧ法检测证实所构建的载体和表达盒功能良好。本项工作对于在国内研究口服活疫苗及开展基因治疗均具有重要意义。     

人MBL相关丝氨酸蛋白酶-1 cDNA的克隆与鉴定

目的 获得人甘露聚糖结合凝集素（ＭＢＬ）相关丝氨酸蛋白酶－１（ＭＡＳＰ－１）基因。方法 以人胎肝组织总ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ获取目的ｃＤＮＡ片段,克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体,进行酶切图谱分析和测序鉴定。结果 以ＲＴ－ＰＣＲ方法获得了含信号顺序的全长ＭＡＳＰ－１ｃＤＮＡ,将其与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转化大肠杆菌ＴＧ１,建立了ＭＡＳＰ－１的ｃＤＮＡ克隆,酶切图谱与微机分析结果一致。序列分析表明。与     

MTS1／p16抑制基因的克隆及其对宫颈癌细胞系的影响

利用重组ＲＴ－ＰＣＲ方法从人胎盘中扩增多重肿瘤抑制基因（ＭＴＳ１）全长ｃＤＮＡ片断，克隆测序后，亚顾隆入哺乳动物高铲表达质粒ｐＣＥＰ中。将表达质业转染两种遗传背影不同的吕颈癌细胞系，发现外源基因ＭＴＳ１／ｐ１６基因的导入对ＨＰ〖Ｖ阳性的宫颈癌细胞系具有明显生长抑制作用，并出现细胞滞留Ｇ１期的特性。     

人B7-1(CD80)逆转录病毒表达载体的构建及其在人肿瘤细胞系的表达

应用分子克隆技术，构建了含全长人Ｂ７－１ｃＤＮＡ（８６７ｂｐ）的逆转录病毒表达载体ｐＬＮＣ－ｈＢ７－１。以ｐＣＤＭ８－ｈＢ７－１为模板，５＇引物为：ＡＣＣＣＴＡＡＧＣＴ，ＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣ，内含ＨｉｎｄⅢ切点及起始密码ＡＴＧ，３’引物为：ＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＡＡＣＴＧ－ＴＴＡＴＡＣＡＧＧＧＣＧＴＡＣ，内含ＨｐａＩ切点和终止密码ＴＡＡ，经ＰＣＲ扩增及电泳回收后得到纯化ＰＣＲ产物，用内切每ＨｉｎｄⅢ和Ｈｐａｌ消化后，定向插入经同样内切酶消化的ｐＬＮＣＸ载体，获得含人Ｂ７－１ｃＤ…     

慢性髓系白血病bcr—abl融合基因的克隆及其在COS …

目的 克隆慢性髓系白血病（ＣＭＬ）融合基因ｂｃｒ－ａｂｌ的ｃＤＮＡ序列,并在真核细胞中表达。方法 以设计的两条引物扩增ｂｃｒ－ａｂｌ融合位点两侧的ｃＤＮＡ,测序后克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１,转染ＣＯＳ－７细胞。取常规培养的细胞进行ＲＴ－ＰＣＲ鉴定。结果 ①ＰＣＲ扩增出４９０ｂｐ大小的ｃＤＮＡ,其序列测定除第４５２位的碱基Ｃ突变为Ｔ外,其余序列均正确。②ＲＴ－ＰＣＲ法检测到转染细胞系中,有ｂ     

BPI23-Fcγ1重组融合蛋白在E.coli中的表达

目的 构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１抗菌重组蛋白。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＬ－６０细胞和正常人白细胞ｍＲＮＡ中扩增编码ＰＢＩ２３和ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃγ１）的基因;通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体;转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α细胞,通过温控诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白。结果 （１）ＲＴ－ＰＣＲ     

人IL-12的克隆、表达及生物活性的鉴定

目的：克隆中国人ＩＬ－２ｐ４０基因,构建ＩＬ－１２的真核基因表达载体。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ从北京地区人脐血树突状细胞（ＤＣ）中克隆ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因,并进行序列分析。利用ｐｃＤＮＡ３．１和ｐＬＸＰＸＳＮ构建ＩＬ－１２表达载体,转染人肝癌细胞后对其进行生物学和免疫学分析。结果：北京地区人ＤＣ中ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因２１０位密码子有独特的结构,为ＧＣＣ（Ａｌａ）。并且２３９和２９１位