成人退变髓核细胞体外培养和细胞周期测定

[目的] 建立成人退变髓核细胞的单层培养模型并观察其形态;测定其细胞周期,探讨传代后髓核细胞生长不佳的原因.[方法] 取24例椎间盘突出症患者手术切除的椎问盘组织,分离出髓核组织,胰酶和胶原酶消化,DMEM/12培养基培养.倒置相差显微镜观察其形态学特征,流式细胞分析仪检测原代和P2细胞周期.[结果] (1)原代髓核细胞生长良好,7 d后贴壁生长的细胞可达90%.(2)原代细胞凋亡率为(38.10±11.7)%,P2代凋亡率为(44.74±17.6)%,原代S期细胞(7.88±2.1)%,P2 S期细胞(2.76±0.7)%.[结论] 传代后的髓核细胞凋亡率增高,S期细胞减少明显.     

单纯Ⅱ型胶原酶消化法分离、培养人退变椎间盘髓核细胞的形态学观察

目的:探讨单纯Ⅱ型胶原酶消化法体外培养扩增人退变椎间盘髓核细胞的可行性。方法:收集20例人退变椎间盘髓核,单纯Ⅱ型胶原酶消化分离出髓核细胞并连续培养传代,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖的表达,免疫细胞化学法行Ⅱ型胶原染色,观察髓核细胞的类软骨表型表达情况。结果:单纯Ⅱ型胶原酶消化法可较好的分离培养人退变椎间盘髓核细胞,20例人退变椎间盘髓核,培养成功16例;原代髓核细胞平均7d贴壁,呈类圆形或多角形,P1代髓核细胞平均12h贴壁,呈大梭形或多角形,两代细胞融合95%所需时间分别为30d和7d,差异有统计学意义(P0.01);聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原主要表达于原代和P1代髓核细胞浆内,被甲苯胺蓝染成天蓝色,免疫细胞化学染色主要表现为黄褐色沉淀,两代间聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达无统计学差异(P0.05)。结论:单纯Ⅱ型胶原酶消化法可简化髓核细胞分离步骤,提高培养效率;传一代后髓核细胞增殖速率提高,但仍维持类软骨表型,表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。     

pH值对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响

[目的]观察不同pH值对体外培养人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响,为椎间盘退变的预防与治疗提供理论依据。[方法]对体外培养的人退变椎间盘髓核细胞利用甲苯胺蓝和番红O染色进行鉴定,并对P3代细胞分别用普通培养基(pH值7.4)、酸性培养基(pH值6.8)和酸性培养基(pH值6.8)+Cucl_2(酸质子受体抑制剂)培养24 h,用流式细胞仪测定细胞凋亡,计算细胞凋亡率。[结果]细胞染色结果均为阳性,证明实验中所培养的细胞为髓核类软骨细胞。普通培养基组的凋亡率为(8.86±0.20)%,酸性培养基组的凋亡率为(11.23±0.77)%,酸性培养基+Cucl_2组的凋亡率为(9.60±0.49)%。与其他两组相比,酸性培养基组的凋亡率明显增加(P0.05)。[结论]在低pH值的环境下,人退变椎间盘髓核细胞的凋亡率增加。     

人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养的形态学及活性观察

[目的]观察平面培养体系内人退变椎间盘髓核细胞的形态及活性变化.[方法]收集20例人退变椎间盘髓核,分离髓核细胞行平面培养,倒置相差显微镜和HE染色观察髓核细胞的生长过程与形态变化,流式细胞仪量化细胞周期分布和凋亡率,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色髓核细胞聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,观察平面培养传代对髓核细胞活性和基质合成能力的影响.[结果]原代髓核细胞呈类圆形或多角形,平均7d贴壁,31 d融合至95％,P1代髓核细胞呈长梭形或多角形,平均12h贴壁,6.6d融合至95％,两代细胞增殖能力的差异有统计学意义(P＜0.01).原代与P1代髓核细胞的细胞浆阳性染色聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,生长融合至95％后约90％的细胞分布于G1期,约16％的细胞凋亡,两代细胞的细胞活性和基质合成能力无统计学差异(P＞0.05).[结论]人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养将经历显著的形态学变化.传一代后髓核细胞增殖能力提高,但能维持细胞活性以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成能力.     

大鼠椎间盘巢源性干细胞对退化髓核细胞作用的研究

目的 :研究大鼠椎间盘巢源性干细胞(stem cells derived from ISN,ISN-SCs)对衰老髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)的作用。方法:取10只SD大鼠(雄性,10周龄),处死后分离获取脊柱功能单位,显露髓核及椎间盘干细胞巢(stem cell niches of the intervertebral disc,ISN)区域,解剖显微镜下仔细分离获取髓核和ISN组织,采用Ⅱ型胶原酶消化、细胞滤网过滤后,将原代ISN-SCs和NPCs分别重悬于培养液,接种于普通培养箱培养,细胞达约90%融合后进行传代,第三代(P3)NPCs及第四代(P4)ISN-SCs用于进一步实验。采用三系诱导分化(成骨、成软骨、成脂肪)培养液对P4 ISN-SCs分别进行定向诱导分化培养,采用茜素红、钙钴染色检测其成骨分化能力,阿利新蓝染色检测其成软骨分化能力,油红O染色检测其成脂肪分化能力;采用连续传代法,将P3 NPCs连续传代,制备NPCs衰老模型,衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-Gal)染色法检测衰老模型的有效性。研究将细胞培养体系进一步分为正常对照组、衰老组、共培养组,正常对照组采用P3NPCs接种,衰老组采用衰老NPCs接种,共培养组采用P4 ISN-SCs与衰老NPCs以1∶1混匀后接种,各组样本细胞总数及培养环境相同。培养1周后,采用甲苯胺蓝染色检测各组蛋白聚糖表达水平,采用免疫组化检测各组Ⅱ型胶原蛋白表达水平,采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测各组ACAN和COL2a1的m RNA表达水平。结果 :在特定诱导环境下,ISN-SCs可以定向成骨、成软骨、成脂肪分化。SA-β-Gal染色显示连续传代后NPCs衰老率随着传代次数而逐渐增加,P3 NPCs未出现明显的衰老[衰老率(3.0±0.5)%],P5 NPCs衰老率为(18.3±0.7)%,P10 NPCs达到严重衰老标准[衰老率为(86.0±4.6)%]。胞外基质蛋白检测结果显示:与正常对照组相比,衰老组的蛋白聚糖甲苯胺蓝染色明显减弱,Ⅱ型胶原免疫组化染色强度定量也显著减弱(P0.05);而接触共培养后,与衰老组相比,共培养组中的蛋白聚糖甲苯胺蓝染色明显增强,Ⅱ型胶原免疫组化染色强度定量显著增强(P0.05)并恢复至正常水平。qPCR结果显示:与正常对照组相比,衰老组的ACAN和COL2a1的m RNA表达水平均显著性降低(分别为1.00±0.05 vs 0.43±0.03,P0.05;1.00±0.03 vs 0.40±0.02,P0.05);接触共培养后,与衰老组相比,共培养组中ACAN和COL2a1的m RNA表达水平均显著性增加(分别为0.43±0.03 vs 0.99±0.05,P0.05;0.40±0.02 vs1.07±0.04,P0.05),且与正常组相比无显著性差异。结论:ISN-SCs具有较好的三系分化能力,通过接触共培养能够提高胞外基质蛋白和基因的表达水平,对衰老NPCs产生良好的修复作用,为后续ISN-SCs修复椎间盘的体内研究打下理论基础。     

同种髓核移植延缓椎间盘退变

自体髓核移植或复合培养的髓核细胞移植延缓椎间盘变性已有试验报道 ,但收集髓核引起供体椎间盘变性 ,KuenTak Suh等利用白兔作为椎间盘供体和受体进行试验 ,检查同种髓核移植是否同样延缓间盘变性以及是否诱导免疫反应 ,通过抽吸髓核制作椎间盘变性模型2周后 ,完整的髓核或髓核细胞被植入 ,然后同空白及正常组对照。接受移植的椎间盘在 16周后用组织学和免疫学检查 ,接受髓核移植的椎间盘发生最小的变性 ,接受移植髓核细胞的椎间盘次之。二者均好于对照组 ,这些发现同免疫染色的 型原旦白的强度有直接的关联 ,同种移植没有发生可见的宿…     

中药促进髓核细胞自噬延缓椎间盘退变的研究进展

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是引发腰痛常见的一种退变性疾病,IDD发生发展的主要原因是髓核细胞受损,自噬作为一种自然的、受机体调节的溶酶体降解途径,通过去除受损的蛋白质和功能失调的细胞器发挥保护作用,对髓核细胞的功能发挥极其重要。近年来,自噬相关基因、蛋白及相关通路陆续被发现和命名,以此更好地引导IDD的治疗进展。越来越多研究发现,中药防治IDD优势明显,疗效确切,调节髓核细胞自噬水平已成为中药防治IDD新的研究方向。因此,本文参考最新相关文献,对中药促进髓核细胞自噬延缓椎间盘退变的研究进展进行综述,为将来临床的诊治和预后研究提供新的思路。     

水凝胶人工髓核应用于椎间盘退变的研究进展

椎间盘退变是造成下背部疼痛的重要原因,其发病机制复杂,应用髓核假体可以较好的模拟自身正常的髓核组织,在临床上取得了较好的短期效果。水凝胶因其出色的力学特性以及不发生免疫排斥反应等优点而成为髓核假体的热门材料。而应用干细胞复合可降解水凝胶再造髓核,也为椎间盘退变的治疗提供了新的思路。     

TGF-β3修饰退变髓核细胞移植修复兔退变椎间盘的效果观察

目的探讨TGF-β3基因修饰后退变髓核细胞生物学效应以及植入兔退变椎间盘后对退变椎间盘的影响。方法将重组腺病毒载体Ad-TGF-β3与第2代退变髓核细胞按10∶1比例混合培养转染(Ad-TGF-β3组),待细胞融合后传代,MTT检测转染细胞增殖活性,Western blot检测TGF-β3蛋白含量,免疫细胞化学染色观察对数生长期转染细胞Ⅱ型胶原染色阳性率;采用病毒空载体转染髓核细胞(Adv组)和未经转染髓核细胞(空白组)作为对照。取30只新西兰兔,体重3.2～3.5 kg,雌雄不限,通过针刺L3、4、L4、5和L5、6椎间盘制备椎间盘退变模型。将实验动物按照随机数字法分为3组,转染细胞组(A组,n=12)、退变细胞组(B组,n=12)和空白对照组(C组,n=6)。A、B组将100μL浓度为1×105个/mL对应细胞悬液注射入退变椎间盘,C组同法注入等量PBS。注射后6、10、14周取A、B组各4只、C组2只实验动物处死,取L3、4、L4、5和L5、6椎间盘行组织学观察,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达。结果 Ad-TGF-β3转染后髓核细胞活性明显改善;转染后3、7、14 d,TGF-β3在髓核细胞内表达逐渐升高;Ad-TGF-β3组髓核细胞细胞质内见棕黄色Ⅱ型胶原阳性染色,阳性率显著高于Adv组及空白组(P<0.05)。组织学观察示,A组椎间盘退变程度较B、C组明显减轻。6、10、14周A组Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达显著高于B、C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TGF-β3基因修饰退变髓核细胞后可明显改善细胞生物活性,转染后髓核细胞植入兔体内可明显增加退变椎间盘的基质分泌。     

人胚椎间盘细胞体外培养模型的建立和鉴定

目的通过建立人胚椎间盘细胞体外培养模型,进一步研究细胞因素在椎间盘退变中的作用机制。方法取4例人体胚胎腰椎间盘,在改良Eagle培养基中建立椎间盘细胞模型,细胞染色、逆转录聚合酶链式反应、免疫荧光检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达进行鉴定。结果椎间盘细胞可在体外培养并进行传代,细胞中Ⅰ、Ⅱ型胶原具有较高的表达,细胞具有较高的分化状态。结论源自胚胎的髓核细胞于体外环境中可以较长时间维持其表型不变,且表型与正常髓核细胞很接近。     

兔腰椎间盘髓核细胞的培养及形态观察

目的：通过对兔腰椎间盘髓核细胞的培养,观察细胞内的演变,探讨髓核细胞的生物学行为及影响因素。方法：取兔腰椎间盘髓核细胞,在加10％灭活胎牛血清的F12－DMEM液中培养,建立体外髓核细胞培养模型。通过光镜、电镜观察,同时进行细胞活力测定。结果：（1）原代细胞生物学性状最接近体内细胞,传代后细胞呈现衰老现象。（2） 活力测定提示随着培养时间的延长及传代,活力逐渐降低。（3）髓核细胞内细胞器的变化与其生物学活性变化相一致。结论：兔腰椎髓核细胞的体外培养成功为人腰椎髓核细胞的培养奠定了基础。     

上皮膜蛋白-1在人椎间盘髓核细胞中的表达

目的观察上皮膜蛋白-1(epithelia membrane protein-1,EMP-1)在人椎间盘髓核细胞中存在的表达。方法利用我们已建成的人胚椎间盘髓核细胞和退变椎间盘细胞培养体系,采用半定量反转录PCR和免疫组化方法检测EMP-1在这两种细胞中的表达情况。结果人胚及退变椎间盘髓核细胞中EMP-1均有表达,分布在不同部位,且具有一定的丰度。结论 EMP-1在正常和退变椎间盘细胞中的存在和生物学特性改变,提示EMP-1可能在椎间盘退变中担当重要角色。     

Nucleus pulposus explant culture model

Many of the therapeutic interventions for intervertebral disc degeneration attempt to repopulate the nucleus pulposus (NP) tissue; however, NP cells are heterogeneous and not well characterized. To address this, we have investigated the morphology, extracellular gene and protein expression, and apoptosis changes in NP explants cultured in vitro with or without chondrogenic reagents for different periods. We also compared the susceptibility of the explants to different treatments by comparing: treatment of NP explants with GDF5 protein, transfection of NP explants with GDF5 plasmid, and infection of NP explants with GDF5 adenovirus vector. We found that expression levels of two of the major extracellular proteins found in NP tissue, that is, collagen II and aggrecan, could be maintained in an NP explant culture model with a chondrogenic medium up to 7 days, and were significantly higher than that of fresh NP tissue after 14 days of culture in vitro, whether or not chondrogenic medium was used. In addition, the NP explant responded to treatment with growth factor, and could be infected by virus and transfected by plasmid for further evaluation of growth factor gene therapy. NP explant culture could therefore provide an easy in vitro culture model to characterize NP cells and evaluate potential therapeutic reagents. © 2008 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 27: 814–819, 2009     

SMAD3 Functions as a Transcriptional Repressor of Acid‐Sensing Ion Channel 3 (ASIC3) in Nucleus Pulposus Cells of the Intervertebral Disc

The goal of this investigation was to study the regulation of acid‐sensing ion channel (ASIC)3 expression by TGFβ in the nucleus pulposus cells of the intervertebral disc. Analysis of human nucleus pulposus tissue indicated decreased ASIC3 and elevated TGFβ expression in the degenerate state. In a parallel study, treatment of nucleus pulposus cells with TGFβ resulted in decreased expression of ASIC3 mRNA and protein. Suppression of ASIC3 promoter activity was evident when the nucleus pulposus cells were treated with TGFβ or co‐transfected with the constitutively active ALK5 or a smad3 construct. On the other hand, co‐transfection of dominant negative smad3 or smad7 restored ASIC3 promoter activity. We validated the role of smad3 in controlling ASIC3 expression using cells derived from smad3‐null mice. ASIC3 promoter activity in the null cells was 2‐ to 3‐fold higher than the wildtype cells. Moreover, expression of smad3 in null cells decreased ASIC3 promoter activity by almost 50%. Further studies using deletion constructs and trichostatin A treatment showed that the full‐length smad3 was necessary, and the suppression involved recruitment of histone deacetylase to the promoter. To determine the mechanism, we evaluated the rat ASIC3 promoter sequence and noted the presence of two smad interacting CAGA box motifs. Gel‐shift and supershift analysis indicated that smad3 protein was bound to this motif. Chromatin immunoprecipitation analysis confirmed that smad3 bound both the CAGA elements. Results of these studies clearly show that TGFβ is highly expressed in the degenerate disc and through smad3 serves as a negative regulator of ASIC3 expression.     

八珍汤对腰椎间盘突出症微创孔镜下椎间盘髓核摘除患者的疼痛及生活质量的影响

目的:探究八珍汤对腰椎间盘突出症微创孔镜下椎间盘髓核摘除患者的疼痛及生活质量的影响。方法:选取余姚市人民医院脊柱外科 2019年 2月—2020年 2月选取腰椎间盘突出症微创孔镜下椎间盘髓核摘除患者,将患者随机分成两组,每组 65例,对照组行常规治疗,观察组在对照组的基础上加用八珍汤治疗。观察比较治疗 1个月后两组患者的疼痛情况、脊柱功能障碍情况,以及生活质量。结果:治疗前,患者视觉模拟(VAS)评分比较差异无统计学意义;治疗后,两组 VAS评分均低于治疗前,且观察组低于对照组,差异有统计学意义( P<0.05)。治疗前,患者脊柱功能障碍( ODI)评分比较差异无统计学意义;治疗后,两组 VAS评分均低于治疗前,但两组差异无统计学意义( P>0.05)。治疗后,观察组患者生活质量评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:腰椎间盘突出症微创孔镜下椎间盘髓核摘除患者加用八珍汤治疗,能够有效缓解疼痛,提升生活质量。     

大鼠非压迫性髓核突出模型的建立

目的:设计一种新的非压迫性腰椎间盘髓核突出动物模型。方法:16只SD雄性大鼠随机分对照组和实验组,分别将生理盐水和大鼠自身尾椎髓核混悬液注射到腰椎硬膜外腔,对其马尾神经传导速度和神经根组织形态学进行观察。结果:无明显机械压迫情况下,大鼠硬膜外移植自体髓核能使马尾神经根传导速度和组织形态产生明显改变。结论:本动物模型简单、可靠、费用低廉,为进一步研究腰椎间盘突出症提供了一种动物模型。     

经椎板间隙术式摘除髓核65例报告

目的　探讨经椎板解剖间隙摘除L4 ,5、L5S1间盘髓核的可行性 ,以达到术后最大限度地保留腰椎后部结构 ,预防术后腰不稳和疤痕粘连、压迫的目的。方法　随机对 6 5例L4 ,5、L5S1单纯椎间盘突出的病人 ,经椎板解剖间隙行髓核摘除术。结果　术中摘除髓核 4～ 10 g ,平均 4 8g ,手术用时 1 5h以内 ,经 3～ 2 4个月的随访 ,优 6 0例 ,良 4例 ,可 1例 ,优良率98 46 %。结论　对单纯L4 ,5、L5S1椎间盘突出 ,经椎板解剖间隙能彻底地摘除髓核 ,椎板间隙作为一自然的间隙 ,能预防术后后方的疤痕粘连和压迫