比较胚胎和新生小鼠肠神经嵴干细胞体外增殖分化的实验研究

目的联合应用简化无血清培养基和连续传代法，从胚胎14～17d、新生1d、新生5d小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞（gut neural crest stem cells，GNCSCs），观察其体外培养过程中增殖、分化的特点，用p75、GFAP、Peripherin、α-Actin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系，比较胚胎和新生小鼠GNCSCs在生长速度、分化细胞的种类及数量上的差异。方法取3组小鼠的肠管，分离制成单细胞悬液，接种于DMEM／F12完全培养基贴壁培养，在连续传代培养中观察克隆球的形成；将克隆球接种于含血清培养基，观察其分化现象；用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达。结果部分胚胎和新生小鼠肠管细胞在无血清培养基中连续传代培养形成克隆球。在血清刺激下克隆球可分化为多种形态的细胞。克隆球和分化细胞系的免疫染色均为阳性。结论胚胎和新生鼠肠管内存在具有自我更新能力的GNCSCs，且均可分化为神经元、神经胶质细胞和平滑肌三类细胞。新生鼠较胎鼠GNCSCs生长速度慢，分化的神经元数量减少，神经胶质细胞数量增加，平滑肌细胞无显著变化。     

内毒素血症对新生鼠脑一氧化氮合酶表达的影响

目的　在脑的正常发育及一些病理条件下 ,一氧化氮合酶 (NOS)发挥一定作用 ,但不同亚型的NOS作用不同。该研究观察正常新生鼠脑以及内毒素血症时新生鼠脑 3种一氧化氮合酶 (NOS)亚型蛋白的表达 ,并探讨脂多糖 (LPS)和地塞米松 (DXM)对其表达的影响。方法　生后健康 7日龄Wistar大鼠 6 8只 ,随机分为对照组、内毒素血症组 (腹腔内注射E .coliLPS 5mg kg)及DXM组 (LPS 5mg kg +DXM 10mg kg) ,分别于用药后2 ,4 ,6 ,2 4h取脑进行NOS免疫组织化学染色。结果　正常对照组新生大鼠脑神经元型NOS(nNOS)明显表达 ,内皮型NOS(eNOS)微弱表达 ,诱导型NOS(iNOS)无表达。LPS腹腔注射后 4hnNOS表达开始增加 ;eNOS及iNOS表达于 6h开始增加 ,3者表达均于 2 4h时达高峰 ;3种NOS表达阳性细胞主要分布于脑皮质、海马、下丘脑、脑室旁核团、纹状体神经细胞。除此之外 ,nNOS在梨状皮质有较强表达 ,eNOS及iNOS在血管内皮细胞呈微弱表达。3种NOS亚型蛋白表达在DXM注射后 2～ 6h受到明显抑制 ,并持续至用药后 2 4h。结论　正常新生鼠脑表达nNOS及eNOS ,无iNOS表达 ;LPS诱导 3种NOS亚型的表达 ,其表达的部位及受诱导表达的程度亦不同 ,提示NOS在中枢神经系统的正常发育及LPS诱导的内毒素血症脑损伤发病中发挥一定作用 ,DXM具有神     

不同状态下新生鼠海马神经干细胞体外培养特征

目的探讨不同状态下新生鼠海马神经干细胞(NSCs)体外培养特征。方法将42只新生7日龄SD乳鼠随机分为正常对照组、单纯缺氧组及缺氧缺血(HI)组,每组14只。每组又根据处死时相点随机分成3、6 h,1、3、7、14、21 d 7个小组,每小组2只。建立HI动物模型后,采用细胞克隆和免疫组织化学技术对3组左侧海马的NSCs进行培养、传代、分化及鉴定。结果3组SD鼠海马组织均能培养出悬浮生长的NSCs神经球,具有连续克隆能力,可传代培养及分化。在3、6 h时间点处死培养SD鼠原代细胞时,3组获得克隆球的数目无显著差异,而在1、3、7、14、21 d时间点培养的原代细胞中均以单纯缺氧组培养出的克隆球最多,HI组培养出的克隆球最少。结论不同状态下新生鼠海马组织均能培养出NSCs,NSCs随年龄的增加、病程的延长和病情的加重而减少。     

碱性成纤维细胞生长因子对胚胎大鼠神经干细胞增殖分化的影响

目的探讨分离、培养及鉴定胚胎大鼠神经干细胞(NSCs)方法，观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对NSCs增殖、分化的影响。方法从大鼠胚胎脑组织中分离出NSCs，用bRGF和胎牛血清诱导其增殖和分化，予BrdU以标记分裂细胞，采用免疫细胞化学鉴定NSCs和分化神经细胞。结果大鼠胚胎脑NSCs在无细胞因子和胎牛血清的培养基中无新生细胞形成，但能在bFGF和血清诱导下形成克隆，并产生nestin和BrdU阳性细胞，贴壁后分化为神经元和星形胶质细胞。结论该方法从大鼠胚胎大脑分离出的细胞具有NSCs特性，即自我更新和多向分化潜能;bFGF是NSCs增殖必须的丝裂原。     

神经营养素-3体外诱导新生鼠海马神经干细胞定向分化

目的探讨神经营养素-3（NT-3）对神经干细胞（NSCs）定向分化的影响。方法取24h龄新生鼠海马组织，以无血清培养基获得NSCs，随即分为实验和对照组。实验组用基础培养液加50g／L胎牛血清（FBS）和20μg／LNT-3诱导其分化；对照组用基础培养液加50g／LFBS。用免疫荧光及流式细胞仪法检测分化得到神经元特异性烯醇化酶（NSE）神经元及阳性神经元比例。结果随着分化培养时间延长，二组NSE阳性神经元渐增加；实验组NSE阳性神经元的比例在分化培养第3天达到高峰，约63％，对照组仅29％，二组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论NT-3体外促进NSCs向神经元定向分化，并可提高其分化比例。     

新生大鼠海马神经干细胞的无血清培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞无血清培养的最佳方法，观察神经干细胞的生长、增殖及分化的特点。方法分离新生24h大鼠的海马组织，分别采用含碱性成纤维生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、及bFGF＋EGF的无血清条件培养基进行悬浮培养，采用神经巢蛋白（nestin）免疫荧光染色方法鉴定神经干细胞，通过胎牛血清诱导分化，鉴定分化细胞，进一步证实神经干细胞。结果bFGF＋EGF能更好的诱导神经干细胞增殖，培养细胞呈nestin抗原阳性，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性抗原。结论bFGF＋EGF的无血清培养基可用于培养大鼠海马神经干细胞。     

内源性一氧化氮合酶/一氧化氮体系对反复高热惊厥脑损伤的影响

目的 研究神经元型一氧化氮合酶(nNOS)在反复高热惊厥(FS)中的变化规律，探讨NOS／一氧化氮(NO)体系对反复FS脑损伤的影响．方法 采用热水浴诱导大鼠FS。实验分两步进行。时第1批大鼠，采用定量RT-PCR方法检测海马nNOS cDNA含量，Western blot检测nNOS蛋白表达；对第2批大鼠，记录惊厥强度。潜伏期、持续时间及惊厥时肛温，HE染色观察海马神经元形态学改变。结果 反复FS后海马nNOS cDNA含量明显高于正常对照组和高热对照组，同时nNOS蛋白表达也出现一致性增高；随惊厥次数的增加。FS组大鼠惊厥潜伏期呈波动状，惊厥持续时间呈延长趋势，NOS抑制剂的干预使惊厥潜伏期呈延长趋势，惊厥持续时间的延长趋势较FS组降低。惊厥强度和惊厥时肛温在两组间无统计学意义；反复FS后，光镜下可观察到海马神经元出现组织学改变，抑制剂减轻了神经元损伤。结论 反复FS诱导nNOS的基因表达，NOS／NO体系的上调可能参与反复FS脑损伤发展。     

脑源性神经营养因子体外诱导新生大鼠海马神经干细胞定向分化

目的 探讨脑源件神经营养因子(BDNF)对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)定向分化的影响.寻找新的NSCs诱导剂,以提高向神经元方向分化比例.方法 取1日龄新生大鼠海马组织,采用无血清培养液悬浮培养方法 进行培养,传2代后可得到高纯度NSCs.通过NSCs特殊标志物神经巢蛋白(nestin)染色鉴定培养细胞.将传3代的NSCs随即分为2组,每组15份.每份均为2mL.含细胞数为1×105.实验组用基础培养液加入50 g/L胎牛血清和20μg/L BDNF诱导其分化;对照组用基础培养液加入50 g/L胎牛血清.分化培养1周后用免疫荧光标记及流式细胞术检测其分化得到的神经元及其比例.结果 通过无血清悬浮培养海马组织细胞呈球形生长,nestin免疫荧光染色呈强阳性表达,细胞纯度90%;免疫荧光标记及流式细胞仪检测,实验组NSE阳性细胞的百分比为60.45%,明显高于对照组(23.67%)(x2=27.75 P<0.005).结论 通过无血清悬浮培养法培养新生大鼠海马组织细胞可获得纯度较高的NSCs;BDNF可体外诱导海马NSCs向神经元定向分化,并提高其分化比例;BDNF是一种较为理想的NSCs分化诱导剂.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向肠神经细胞分化及胶质细胞源神经营养因子表达的变化

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞向肠神经分化的条件及胶质细胞源神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor,GDNF)及其受体RET基因表达的变化.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),传至第四代,进行诱导分化.以10ng/ml GDNF和10%FBS的稀释胎肠培养基(fetal gut culture medium,FCCM)以及仅含有10 ng/ml GDNF的L-DMEM诱导7 d,对照组为含10%FBS的L-DMEM完全培养液,免疫组化的方法鉴定细胞的神经特异性烯醇化酶(neural specific enolase,NSE)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)及一氧化氮合酶(nit ric oxide synthase,nNOS)的表达.RT-PCR检测GDNF及RET mRNA的变化,Westem Blot方法检测GDNF蛋白的表达情况.结果 BMSCs能在体外成功培养及纯化,诱导7 d后,实验组均可见NSE、VIP及nNOS的表达,两实验组的阳性率有统计学差异,而对照组为阴性.RT-PCR检测示,BMSCs向肠神经细胞诱导后,GDNF表达显著增强,并促使RET基因表达Western Blot结果提示,诱导后的细胞GDNF在蛋白水平上表达增强.结论 GDNF联合FCCM可诱导BMSCs分化为肠神经细胞,在向神经细胞分化的过程中,能促进GDNF表达的增强,并促使RET基因的表达,GDNF-RET信号通路在肠神经分化过程中可能发挥着重要作用.     

一氧化碳对热性惊厥大鼠海马一氧化氮合酶/一氧化氮体系的影响

目的：反复热性惊厥(FS)后血红素氧合酶(HO)/一氧化碳(CO)系统和一氧化氮合酶(nNOS)/一氧化氮(NO)系统上调,但二者相互关系不清。本研究观察HO抑制剂锌原卟啉Ⅸ(ZnPPⅨ)对FS大鼠海马神经元型NOS(nNOS)mRNA和蛋白表达及NO含量的影响,以探讨CO对NOS/NO体系的调节作用。方法：采用热水浴诱导大鼠FS,隔日诱导1次,共诱导10次。发育期大鼠随机分为3组:对照组,FS组,FS+ZnPPⅨ组(均n=16)。分光光度计间接测定血浆CO和NO含量;核酸原位杂交法检测海马nNOSmRNA表达;Westernblot方法检测海马nNOS蛋白含量。结果：反复FS后海马nNOSmRNA和蛋白表达增高。用ZnPPⅨ进行干预后,血浆CO含量下降,海马nNOSmRNA和蛋白表达及血浆NO含量呈现一致性的显著。结论：反复FS时,外源性给予HO抑制剂ZnPPⅨ可可抑制HO/CO系统,降低血浆CO,增加神经元NOS的基因表达及NO含量,提示CO可能下调NOS/NO系统活性。     

Vagal neural crest provides inhibitory neurotransmission to the chick embryo cloaca

Introduction  The intrinsic innervation of the developing chick cloaca originates in the vagal and sacral regions of the neural tube. Its major inhibitory neurotransmitters are nitric oxide (NO) and vasoactive intestinal peptide (VIP). It has previously been shown that the majority of neurons in the chick embryo cloaca are derived from vagal neural crest cells. This study aimed to identify the phenotype of these vagal-derived neurons using quail-chick chimeras. Materials and methods  Chicken embryos were incubated until the 10–12 somite stage. The vagal neural tube was then microsurgically ablated in ovo and replaced with the vagal neural tube from age-matched quail embryos. Quail-chick chimera embryos were harvested at E12, and E14, and fixed and embedded in paraffin wax, and serially sectioned. Immunohistochemistry was performed using human natural killer-1 (HNK-1), quail-cell-specific perinuclear (QCPN), NOS and VIP antibodies. Expression of NOS and VIP neurons in the developing chick embryo cloaca was also further analysed using immunohistochemistry. Results  HNK-1 labelled all ganglia in the myenteric and submucosal plexuses of the cloaca, whilst the quail-specific QCPN antibody labelled all ganglia derived from the transplanted quail vagal neural tube. NOS- and VIP-immunoreactive neurons appeared to make up a large proportion of the quail-derived vagal neural crest cells. Both NOS and VIP expression was seen to increase throughout development. Conclusion  This data suggests for the first time that the inhibitory neurons in the chick cloaca primarily originate in the vagal neural crest, thus providing new insights into the developmental origin of the intrinsic innervation of the developing cloaca.     

神经干细胞植入鼠侧脑室后迁移与神经元分化

目的探讨人胎脑神经干细胞（hNSC）在新生鼠（生后9d内）脑内迁移与分化，为hNSC移植治疗新生儿脑病提供实验依据。方法无血清培养基从流产人胎脑前脑培养出hNSC球，取部分同批hNSC球，用酶消化为单细胞悬液。将培养14d的hNSC和消化好的单细胞悬液经脑室途径移植到出生8d的健康SD大鼠侧脑室内，于移植24、48、72h通过取脑，制作石蜡切片，免疫组织化学观察。结果体外培养获得典型的人胎脑hNSC球，神经细胞呈球样悬浮生长，移植入脑室内的2种类型细胞，其在脑内存活迁移的结果明显不同，用抗人细胞核抗体（Anti—hNuc）免疫荧光检测，移植入细胞球的72h就可迁移到嗅球、额叶皮层的内侧中央前区、海马、枕叶皮层等部位的颗粒层内、小脑回内相当于蒲氏细胞层位置有排列整齐的单层细胞，中脑区域也有广泛的细胞分布；抗神经纤维抗体Anti—NF可看到大脑皮层的颗粒层和嗅球部有阳性反应细胞，细胞间通过突起发生了连接。移植入单细胞悬液组24h可在脑室内见到大量的Anti-hNuc（＋）细胞，72h组可在脑室内及其附近脑组织内均见少量的细胞。结论体外培养获得的hNSC移植入鼠脑后可存活并发生迁移分化，细胞形态不同存活迁移分化的效果有明显不同，以直接培养出来的细胞球移植较制备成单细胞悬液移植的后存活迁移的能力明显增强。     

子痫前期母亲所生新生儿血清S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白检测及其临床意义

摘要： 目的 探讨S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在不同程度子痫前期母亲所生新生儿血清中的变化、关系及与1 min Apgar评分的相关性,为早期预测新生儿脑损伤的可能性寻找依据。方法 选择2012年10月至2013年3月在山西省儿童医院子痫前期母亲所生新生儿40例,分为2组：子痫前期轻度组（L组）20例、子痫前期重度组（H组）20例,设立健康对照组（N组） 20例,三组新生儿均于入院时留取标本,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）法检测血清GFAP和S1OOB浓度。另每例患儿均于入院后第3天行头颅超声检查。结果 L组、H组、N组之间血清S100B、GFAP浓度比较差异有统计学意义（P2=17.20,P＜0.001）;L组、H组S100B与GFAP浓度呈正相关（γ=0.658,P＜0.05）;L组、H组S100B、GFAP浓度与新生儿1 min Apgar评分均呈负相关（γ$subScript$S100B$/subScript$=-0.482, γ$subScript$GFAP$/subScript$=-0.534,P＜0.01）。结论 母亲子痫前期程度越严重,新生儿脑损伤可能性越大,S100B和GFAP浓度升高越明显,与1 min Apgar评分呈负相关,说明S100B蛋白和GFAP做为预测新生儿脑损伤的可能性值得进一步研究。     

缺氧缺血性脑病新生鼠胃壁内一氧化氮的改变

目的探讨缺氧缺血性脑病新生鼠胃壁局部一氧化氮（ＮＯ）的改变及窒息对消化系统的影响。方法采用二氢硫辛酰胺脱氢酶ＮＡＤＰＨ组织化学方法，检测２４只正常或缺氧新生鼠胃壁各层一氧化氮合成酶（ＮＯＳ）的分布变化。结果急性缺氧组与正常对照组相比，ＮＯＳ阳性产物无论在分布、染色深浅、纤维密度及ＮＯＳ阳性胞体数目上，差异均无显著意义（Ｐ＞０．０５）。但在缺氧缺血性脑病组，其肌层的ＮＯＳ阳性纤维无论是密度还是染色深浅，均明显强于正常对照组，ＮＯＳ阳性胞体亦明显多于正常对照组，其差异有非常显著意义（Ｐ＜０．０１）；而粘膜和粘膜下层的ＮＯＳ分布与正常对照组相比，差异无显著意义（Ｐ＞０．０５）。结论窒息时胃动力降低及胃粘膜病变与一氧化氮在胃壁内的改变有关     

脑源性神经营养因子及神经干细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的实验研究

目的 观察脑源性神经营养因子(BDNF)及神经干细胞(NSCs)联合移植对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的治疗效果.方法 取新生24 h的Wistar大鼠海马NSCs进行培养、鉴定.选7日龄Wistar大鼠制备HIBD动物模型,模型制备后7 d行损伤侧侧脑室移植.将实验大鼠随机分为6组:正常组、模型组、假移植组、NSCs移植组、BDNF组、BDNF+NSCs移植组(联合移植组).移植后4周进行功能实验,取脑组织进行免疫组化免疫荧光检测.结果 从新生大鼠海马可成功培养出NSCs.Y迷宫实验结果:NSCs移植组达到学会的次数及正确记忆次数(163±11.60,5.00±1.13)n;BDNF组(150.00±8.94,5.17±1.47)n;BDNF+NSCs移植组(111.25±13.56,6.23±1.60)n.悬吊实验结果:NSCs移植组平均(30.10±11.8)s;BDNF组(36.25±10.98)s;BDNF+NSCs移植组(43.6±10.56)s.斜坡试验结果:NSCs移植组(20.3±8.25)s;BDNF组(14.33±2.88)s;BDNF+NSCs移植组(11.17±2.48)s.表明联合移植组大鼠学习记忆能力及神经功能与NSCs移植组比较明显改善(P＜0.05),而NSCs移植组大鼠学习记忆能力及神经功能与HIBD组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).联合移植组损伤侧额叶皮层、海马存活的NSCs数量(9.31±0.71个,10.10±1.65个)与NSCs移植组(3.33±0.24个,4.22±0.33个)比较差异具有统计学意义(P＜0.01),且NSCs分化为神经元的比例明显增多,与NSCs移植组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 BDNF与NSCs联合移植较单独NSCs移植对HIBD有更好的疗效.     

银杏叶提取物对宫内缺氧新生大鼠神经细胞凋亡的保护效应

目的 探讨银杏叶提取物(EGb)对宫内缺氧新生大鼠急性脑缺血损伤的保护作用。方法 夹闭妊娠大鼠子宫血管，制成急性脑缺血损伤新生鼠模型，治疗组给予腹腔注射EGb，在生后不同时间比较两组仔鼠脑组织含水量、NO的变化,神经型一氧化氮合酶(nNOS)的表达及神经细胞凋亡情况变化。结果 急性脑缺血后，脑组织含水量明显增加，NO的含量迅速上升，同时凋亡细胞数增加，两者成直线正相关。EGb治疗后NO含量显著低于未治疗组，同时观察到治疗组的nNOS表达明显降低，凋亡细胞数量减少。结论EGb对急性缺血引起的脑损伤有保护作用。     

一氧化碳和一氧化氮对热性惊厥大鼠海马神经元凋亡的影响

目的：热性惊厥(FS)是小儿时期最常见的惊厥性疾病,反复FS可造成海马神经元的损伤,同时血红素氧合酶(HO)/一氧化碳(CO)系统和一氧化氮合酶(NOS)/一氧化氮(NO)系统明显上调并相互影响。该研究使用HO的抑制剂锌原卟啉Ⅸ(ZnPP-Ⅸ)和NOS的抑制剂Nω硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对FS时两个系统进行干预,探讨此两个系统对反复FS大鼠海马神经元凋亡的影响。方法：采用热水浴诱导大鼠FS,隔日诱导1次,共诱导10次。21日龄SD大鼠随机分为4组对照组,FS组,FS+ZnPP-Ⅸ组,FS+L-NAME组。TUNEL法对各组大鼠海马CA1区神经元进行凋亡检测。结果：FS组大鼠海马CA1区凋亡细胞数较对照组多225%,两组比较,差异有显著性(P<0.01),FS+ZnPP-Ⅸ组大鼠海马CA1区凋亡细胞数较FS组和对照组分别多62%和425%(均P<0.01),FS+L-NAME组大鼠海马CA1区凋亡细胞数较FS组低38%(P<0.01),较对照组多100%(P<0.05)。结论：反复FS时,外源性给予HO抑制剂ZnPP-Ⅸ可导致海马神经元的凋亡增多,而NOS的抑制剂L-NAME可致海马神经元的凋亡减少,提示HO/CO系统可保护FS神经元的损伤,NOS/NO系统可加重FS神经元的损伤。