双抗体夹心法微量ELISA测定人血小板因子4

测定血小板因子4(PF_4)有多种方法,但是都有一定的局限性。本文介绍一种敏感性强、特异性高、重复性好的方法,即双抗体夹心微量酶联免疫吸附试验(ELISA)。测定过程如下:(1)包被:聚苯乙烯微板的每个孔加150μl缓冲液稀释的抗人PF_4抗体,置37℃孵育20小时,用PBST(磷酸盐缓冲盐水-吐温20溶液)洗4次。(2)抗原孵育:加200μl/孔含1％牛血清白蛋白的PBS,37℃1小时,板用PBST洗1次,再加入50μl/孔含已知量抗原的抗原标准液及血浆标本,37℃1小时,板用PBST洗3次。(3)标记抗体孵育:加100μl/孔用PBST稀释的辣根过氧化物酶标记     

用ELISA定量测定人血清载脂蛋白A-1

血清高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白apoA-1的定量测定在临床上具有重要意义。apoA-1的定量测定常用放射免疫法、免疫电泳法和免疫浊度法。本文作者用ELISA[一种“三明治”式酶联免疫法)定量测定人血清apoA-1,具有灵敏度高、抗体用量少、避免放射性、样本处理能力大等优点。本法所用的兔抗人apoA-1抗体均经亲和层折法纯化。聚乙烯酶标板先用纯化apoA-1抗体包被,37℃保温3小时后于4℃放置过夜;倒去包被液后用洗涤液洗涤三次,加入100μl适当稀释的标准apoA-1或待测血清样本,37℃保温2小时;倒去样本液并洗涤5次,加入100μl辣根过氧化物酶标记的纯化apoA-1抗体,置37℃保温2小时后,再次倒去抗体并如前洗涤。最后加入100μl酶反应     

病毒酶联细胞免疫试验(VELCIA)检测轮状病毒抗原及其中和抗体

病毒酶联细胞免疫试验(VELCIA)不仅能检出和滴定适应株或野毒株轮状病毒,还能测定血清中的抗轮状病毒总抗体和中和抗体。具体方法如下:MA-104细胞用含10%胎牛血清的MEM培养液悬浮成10~6细胞/ml,加50μl/孔至聚苯乙烯96孔板上,37℃孵育48-72小时长成单层细胞。粪便标本用PBS制成20%悬液,离心后取上清与等量含30μl/ml胰酶的MEM混合,37℃活化90分钟后,50μl/孔接种在MEM洗过3次的微孔板单层细胞上,室温吸附60分钟,倾弃样本,用MEM洗板上细胞3次,置于100μl/孔MEM孵育18-20小时。猪轮状病毒OSU株接种用含30μl/ml胰酶的MEM作一系列10倍稀释,活化60分钟,接种于MEM洗过3次的单层细胞上,37℃孵育48小时。然后用预冷至-20℃,85%丙酮固定不超过24小时,倾弃丙酮,自然干燥,用前及每次温育间均用含0.05%吐温20的盐水洗3—5次。VELCIA检测轮状病毒抗原时,每孔加50μl1/200稀释的猪抗轮状病毒过氧化物酶结合物37℃温育2小时,随即加100μl/孔ABTS底物(2.2-叠氮-3-二乙基苯噻唑磺酸)作用1小时后,将80μl     

用ELISA(方法)测定血清淀粉样蛋白P

血清淀粉样蛋白P(SAP)呈糖基化(蛋白),在血清中以两个五聚圆盆状的复合体存在。SAP 由肝脏合成,半衰期为7.8～8.5小时,说明SAP 产生快速而持续以维持血清中稳定浓度在40～50mg/L。为更好了解SAP 的功能,需要快速的测定方法。本文介绍ELISA 测定人SAP 浓度。方法如下:用经蛋白A 层析柱和SAP(琼脂糖CL-4B 柱纯化的抗SAP 包被。同一抗体用辣根过氧化物酶标记作为二抗。反应板每孔中加100μl抗SAP 抗体(20mg/L)溶液,放25℃16～18小时,递经洗涤加100μl 受检标本温育洗涤后,加100μl 标记抗体,按常规洗涤,于492nm 波长读取吸光度。本法从混合人血清分离出的SAP 的纯度>     

用亲和素-生物素-免疫酶法(NABA)检测溶菌酶

本法可用于测定正常人和急性髓样白血病患者血清中的溶菌酶,步骤如下:用抗溶菌酶抗体(15μg/ml)包被微孔板,置4℃过夜后洗涤。加样品(100μl),置37℃1小时。经洗涤后加生物素化抗溶菌酶抗体(100μl,1:500),同法温育并洗涤。加酶标亲和素(1mg/ml 原液经1:2000稀释,每孔加100μl),置室温10分钟。洗涤,加底物,置室温10分钟终止反应。若采用快速法,加样品、生物素化抗体、酶标亲和素及底物后的温育时间应分别缩短为20分钟、20分钟、5分钟和5分钟。同时以竞争性亲和素-生物素-免疫酶测定法作对比。竞争     

用标准品界定ELISA法测定HBsAg结果的复检范围

我室多年来一直使用上海荣盛公司的HBsAg诊断试剂盒(双抗体夹心ELISA法)。从2011年3月开始,因其试剂盒改良,原标本量及酶标记抗体的加入量由50μL增至100μL,方法由标本和酶标抗体一起加入包被孔后37℃温育30min(一步法)改为标本加入后先温育60 min,然后加酶标抗体再温育30 min(二步法),其余步骤及结果阳性判定值未     

微量全血ELISA检测HBsAg

一、操作:在4×10孔聚苯乙烯反应板的每孔中,加用包被液稀释的抗HBsAg200μl,40℃置24小时后倾去包被液,用洗涤液洗三次.每孔加稀释液(pH7.4,0.02MPBS:内含0.1g/dl EDTANa_2,     

酶联反应板包被链霉亲合素的优化方法

目的对链霉亲合素(streptavidin,SA)预包被酶联反应板的优化方法进行研究,比较干法、湿法包被的优越性。方法通过对包被缓冲液、SA浓度、17种市售反应板的比较试验,得出SA包被的较优条件。结果选择洁特高亲和力板,采用碳酸缓冲液干法包被,37℃温育16 h至全干,达最佳包被效果,此时SA浓度为2μg/ml。干法包被的孔间差2.95%,批间差7.37%,37℃保存7 d结合生物素的效果无显著改变。生物素结合量为每孔1 ng,是国产SA预包被反应板的5倍。结论用干法预包被SA优于传统的湿法包被,效果等同甚至超过现有进口SA预包被板。     

ABC—ELISA用于疟疾现场血清学检测

由于血涂片显微镜观察诊断疟疾的方法可能遗漏那些低疟原虫血症的患者,本文介绍一种检测血疟原虫抗体的新血清学方法(ABC—ELISA)。其主要步骤为:1.抗原制备:收集体外培养的疟原虫感染占20%以上的RBC,混匀,以0.45%NaCl 溶血后,置0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液作声波处理,再以该缓冲液稀释终蛋白浓度为250μg/ml 的抗原液备用或冻干贮存。2.抗原包被及处理:在96孔U 型微量滴定板内,每孔加20μl 抗原液,37℃过夜、干燥、PBS 洗涤后,每孔加50μl0.5%高碘酸作用10min 以抑制抗原内的过氧化物酶活性,之后,每孔再加50μl 含2%正常羊血清的PBS(PBS-GS),置37℃作用30min,以防止免疫球蛋白的非特异性结合。3.加待检血清:每     

一种检测TgA缺乏的快速筛选试验

本文介绍筛选IgA缺乏的一种快速固相红细胞吸附试验(SPRCA)。方法:用蒸镏水稀释亲和纯化羊抗人IgA 至20μg/ml.然后取100μl 加于聚苯乙烯U型孔底微量反应板孔内.置37C 孵育4小时后保存于4℃备用。试验前反应板孔用0.85%生理盐水洗5次,加1滴被检血清包被反应孔,置37℃孵育5■,再用0.85%盐水洗5次,于每孔加1滴IgA 致敏指示红细胞,600×g 离心(?),观察反应结果。指示红细胞全部或部分复盖在孔的表面为阳性(IgA 水平<1mg/dl),红细胞形成小而分散扣于孔底为阴性(IgA水平>1mg/dl)。22例住院病人血清先用比浊法确定样本IgA水平,再将每份血清样本用6%白蛋白稀释成IgA     

唾液中睾酮直接固相酶免疫测定法

测定唾液中的睾酮目前多用放免法(RIA),这类方法绝大多数需用有机溶剂抽提睾酮;也有报道需要抽提步骤的酶免疫法(EIA)。为简化操作,作者建立了一种在微滴定板孔直接测定唾液中睾酮的竞争性固相EIA,并测定了年龄在15～48岁的65例健康男性自愿者的唾液中的睾酮含量。方法:收集研究对象禁食至少1小时后的唾液2～5ml 于聚苯乙烯试管中置-20℃备用。分析时,将标本融化后置56℃2小时,取出后3000×g 离心15分钟,上清液作测睾酮用。微滴定板每孔加入稀释2000倍的抗睾酮抗血清100μl 包被,置37℃90分     

竞争性酶免疫法检测人布鲁氏杆菌

检测布鲁氏杆菌常用的血清学方法为凝集实验和补体结合实验 ( CFT) ,其准确性和灵敏度有待提高 ,间接酶联免疫实验灵敏度高 ,但易产生假阳性 ,且试剂的标准化较困难。本文介绍一种快速、简便 ,灵敏度高 ,特异性好的竞争性酶免疫法 ( CELISA)。方法　布鲁氏杆菌 S-LPS抗原用 0 .0 6mol/L Na H-CO3缓冲液 ( p H 9.6)稀释后 ,反应板每孔加 1 0 0μl,4℃过夜 ( 1 8h)包被。用含 0 .0 5% Tween-2 0的 0 .0 1 mol/L磷酸盐缓冲液 ( p H 7.2 )洗涤 4次 ,加入 95μl鼠单克隆抗体 (用含 0 .0 1 5mol/L EDTA-EGTA的 PBS液稀释 ) ,再加 5…     

固相LISS扰球蛋白试验检测红细胞抗体

固相低离子强度溶液抗球蛋白试验(LISS-SPAT)已经用在粘附有固相干燥血清的微量板上。本文作者就这一新技术的方法、结果作了详细介绍。方法:①粘附过程:AB型混合血清来自10名无输血史的男性献血员,其中加入热聚集的人免疫球蛋白以激活补体系统,然后取80μl用磷酸盐缓冲液(PBS)作1∶5稀释后,加到U型聚苯乙烯微量板孔里,4℃孵育24小时。然后以PBS冲洗微量板3次,再把微量板置37℃干燥2小时。经上述处理后,粘附血清的微量板可放4℃保存1月。②红细胞(RBC)的制备:浓度为0.05%的RBC 150μl,加入未经处理的聚苯乙烯U型微量板孔底,可在4℃保存1周。③     

尿纤维连接蛋白裂解片断的酶免疫法测定

癌症病人尿中纤维连接蛋白(UFN)几乎均以片断形式存在,主要是细胞连接位点片断。作者用抗细胞连接位点片断的单克隆抗体,建立了一种用于UFN 检测的夹心酶免疫分析法,现介绍如下:材料与方法:①单克隆抗体:利用杂交瘤技术制备两株抗细胞连接位点片断的单克隆抗体(FN10和FN30),经鉴定为IgG_1亚类。②夹心酶免疫法检测:以FN30单抗包被96孔板,加牛血清白蛋白封板,再加尿样或各浓度标准液20μl,加100μl 酶标FN10(FN10用蛋白A 层析纯化,HRP 标记),室温放置0.5h 后用去离子水洗涤。加2.9mmol/L 的3,3′,5,5′—四甲基联苯胺为底物液,室温作用15min 后加入1mol/L HCl 100μl 终止反应,450nm 波长下测各孔吸光度值。UFN 的量用每毫克肌酐来表示。     

抗双链DNA酶免疫法测乙型肝炎病毒DNA的评价

血清HBV DNA的检测是乙型肝炎的诊断和疗效观察的重要手段。已有许多方法可直接检测HBV DNA。作者等为了提高灵敏度,开发了一种新的酶联免疫技术来检测PCR扩增产物,称作PCR-DNA的酶免疫测定(DEIA)。此法应用抗双链DNA单克隆抗体的DNA-DNA杂交检测。将单抗预包被在酶联板上。扩增产物经95℃10分钟变性后立即在冰上冷却,加20μl于酶联板孔内,温育50±2℃1小时。洗涤后再加抗双链DNA液温育37℃1小时,洗涤后加过氧化物酶标记的抗抗体,经TMB显色。作者等将PCR-DEIA与斑点印迹杂交(dot blot未经PCR复制)及PCR产物的溴乙淀染色(PCR-EB)和斑点印迹(PCR-dot blot)进行比较。共研究了208份血清标本,其中73份是常规标本,135份是慢性肝炎患者的标本,部分是α-干扰素治疗期。对于乙肝抗原阳性的常规标本,dot blot检出率为70.4％,PCR-EB为74.1％,PCR-DEIA和PCR-dot blot为     

商品化酶—免疫试验测定人血清中胰岛素的评价及其临床应用

作者根据“夹心”法的原理,制成胰岛素酶标(EIA)检验箱。此箱内有抗胰岛素血清包被的小珠、过氧化物酶标记的抗胰岛素抗血清、底物5-氨基水杨酸,人胰岛素标准品、过氧化氢、叠氮化钠、吐温20表面活化剂、含有动物血清的pH6.4,76mmol/L磷酸缓冲液。主要操作是:先用含有动物血清的磷酸缓冲液稀释胰岛素的标准品,然后取0.4ml标准液加到每个标准管中,另外取0.1ml血清,加到0.3ml磷酸缓冲液中,作为测定管,向每管中加入抗胰岛素包被的小珠,混匀,室温放置1小时。再将     

IgG抗-A/BELISA检测方法的初探

目的建立1种IgG抗-A/B ELISA检测方法。方法将唾液血型物质以磷酸盐缓冲液包被酶标板,10%脱脂奶粉磷酸盐缓冲液37℃封闭1 h,洗涤后加入系列稀释的待检血清,37℃孵育30 min,洗涤并加入酶标记羊抗人IgG,37℃孵育30 min,洗涤,TMB显色,2 mol/L H2SO4溶液终止反应,酶标仪读取A450/A630,以P/N≥2.1判为抗体阳性,将抗体阳性的最高稀释度作为血清IgG抗-A/B效价。结果阴性对照血清与反应系统无交叉反应;检测IgG抗-A批内变异2.3%~7.7%,批间变异5.9%~8.1%,IgG抗-B批内变异3.7%~5%,批间变异6.5%~8.7%。ELISA法检测30名孕妇IgG抗-A效价阳性率为26.67%,抗体效价检测结果与抗球蛋白法符合率73.33%;IgG抗-B效价的阳性率和符合率分别为23.33%、76.67%。结论 IgG抗-A/B ELISA检测法特异性强,精密度较高,实现了IgG抗-A/B效价检测方法由定性试验到半定量试验的转变。     

酶免疫测定法检测丁型肝炎病毒抗体

作者研制了一种检测丁型肝炎(HD)病毒抗体(抗-HD)的阻断酶免疫测定法(EIA)。这种方法使用源于大肠杆菌的重组表达抗原。并将其与一种市售放射免疫测定法(RIA)和另外一种普通EIA 进行了比较。后两种方法分别使用源于感染土拔鼠和黑猩猩肝的抗原。抗-HD EIA 法的操作:用经0.05M 碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释的125μl 抗-HD 包被微量滴定孔并于室温下过夜孵育。然后,吸出各孔包被液并用pH7.2含有0.5%牛血的蛋白的磷酸盐缓冲液     

夹心酶联免疫吸附法检测血浆胆固醇酯转移蛋白浓度

血浆胆固醇酯转移蛋白 (CETP)介导高密度脂蛋白和含 apo的脂蛋白之间的胆固醇酯和甘油三酯的交换。 apo在心血管疾病如动脉粥样硬化、肥胖和胰岛素依赖性糖尿病 (IDDM)中活性较高。由于 CETP在血浆中浓度较低 ,不易检测。作者运用两个单抗 TP2和 TP2 0 ,通过夹心 ELISA建立了灵敏检测血浆 CETP浓度的方法。实验检测了 35例 IDDM儿童 ,通过静脉穿刺取血。用 96孔微量板 ,每孔加入含 TP2 0的包被液 2 0μl,37℃孵育 1.5 h,甩干 ,加入 2 0 0μl封闭液孵育 ,洗涤 ,再加入 10 0μl 1∶ 7稀释的 IDDM血样、正常血样及空白对照 ,室温…     

白喉抗毒素水平测定的对比研究

本文摘要报告用酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)作白喉抗毒素水平测定的对比研究结果。 ELISA条件优选 1、不同批号聚苯乙烯板对实验的影响。先后试用三批板,一批板不受pH和包被时间的影响;另一批板最适包被条件为:以pH9.6碳酸盐缓冲液为包被液,37℃作用1小时后冰箱过夜;还有一