人正常子宫内膜原代腺上皮细胞的优化分离和培养

目的 优化人正常子宫内膜腺上皮细胞分离和原代培养的方法,提供子宫内膜相关疾病研究的体外细胞模型。方法 采用酶消化、筛网过滤、离心的方法体外分离和培养人子宫内膜腺上皮与间质细胞。腺上皮细胞鉴定采用光学显微镜下观察细胞形态;免疫细胞荧光及免疫细胞化学法检测上皮细胞角蛋白(CK)和间质细胞波形蛋白(Vim)的表达。结果 经诊刮获得的18份标本中有17份分离培养成功;细胞形态符合腺上皮细胞特征,CK免疫荧光及免疫化学染色阳性,Vim染色阴性,纯度达90%以上;正常原代人子宫内膜腺上皮细胞不能传代,培养5～6d后细胞逐渐衰老。结论 改良后的原代培养方法取材简单,克服了污染问题,可获得高纯度及足够数量的人正常子宫内膜腺上皮细胞作为体外实验模型。     

分离培养子宫内膜腺上皮和间质细胞方法的改进

目的:探索一种获得高产量、高纯度子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的分离培养方法.方法:通过高浓度胶原酶和DNase联合消化、过滤及贴壁纯化等技术,分离培养30例子宫内膜腺上皮和间质细胞,并拟传代.结果:29例标本培养成功,每1g子宫内膜组织约可分别得到(40～50)×106个腺上皮细胞和(40～50)×106个间质细胞,细胞产量高.并且腺上皮细胞纯度率约96%,间质细胞纯度率达98%以上.间质细胞可以有限传代,腺上皮细胞不能传代.结论:通过改良步骤,可提高腺上皮和间质细胞产量,同时保证了其纯度及活性,不失为一种较理想的子宫内膜细胞分离培养方法.     

子宫内膜异位症体外细胞模型的建立

目的从子宫内膜组织分离腺上皮细胞和间质细胞，建立子宫内膜异位症体外多细胞模型。方法收集子宫内膜异位症和其他良性疾病的在位子宫内膜，采用高浓度胶原酶消化法进行内膜细胞的原代培养，以及传代培养。观察两组细胞形态，SABC免疫细胞化学进行细胞鉴定，MTT法绘制两组细胞的生长曲线。结果高浓度胶原酶消化后，子宫内膜异位症组和对照组腺上皮细胞和间质细胞大部分在48h内都能贴壁；腺细胞平均生长时间为6周；间质细胞平均生长时间为15周。腺上皮细胞角蛋白（cytokeratin）免疫细胞化学染色呈阳性，渡形蛋白（vimentin）为阴性；间质细胞角蛋白染色为阴性，而波形蛋白为阳性。两组生长曲线接近。结论高浓度胶原酶消化法建立子宫内膜异位症体外多细胞模型简单、易行。子宫内膜异位症在位内膜细胞的形态、生长和正常内膜细胞无明显差异。可以用作研究子宫内膜异位症细胞基因型特征、及其他因素对异位内膜细胞的影响的模型。     

子宫内膜异位症在位及异位内膜IGF-1及IGFBP-3的表达

目的:探讨子宫内膜异位症患者在位及异位内膜胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及胰岛素样因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的表达水平,并探讨IGF-1及IGFBP-3在子宫内膜异位症发病过程中的作用,为临床治疗子宫内膜异位症提供新的思路.方法:选择子宫内膜异位症患者共64例(内异症组),另选择同期入院的非子宫内膜异位症患者54例作为对照(非内异症组),2组患者均经手术治疗,术毕分别取2组患者的内膜组织,经免疫组化、染色等步骤,制作好切片,在光镜下进行结果判定.结果:免疫组化结果显示,IGF-1在内异症患者的异位内膜间质细胞和腺上皮细胞均呈中度、强阳性表达,在内异症患者的在位内膜间质细胞(59例)及腺上皮细胞(62例)呈中度、强阳性;在非内异症患者子宫内膜间质细胞(48例)及腺上皮细胞(52例)呈阴性表达;IGFBP-3在内异症患者异位内膜间质细胞(62例)及腺上皮细胞(60例)呈阴性表达,在内异症患者在位内膜间质细胞(58例)及腺上皮细胞(52例)呈阴性表达,在非内异症患者子宫内膜间质细胞(51例)及腺上皮细胞(48例)呈强阳性表达.结论:IGF-1在子宫内膜异位症患者异位内膜及在位内膜均呈中度阳性及强阳性表达,在非内异症患者子宫内膜细胞则大部分呈阴性表达;而IGFBP-3在子宫内膜异位症患者异位内膜及在位内膜大多数均呈阴性表达,在非内异症患者子宫内膜细胞大多数呈阳性表达,推测IGF-1在子宫内膜异位症发病过程中起了一定的作用,而 IGFBP-3在对抗子宫内膜异位症的发生发展中有一定作用.     

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.     

表皮生长因子对人子宫内膜细胞GJIC影响的体外研究

[目的]探讨表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)对人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞间隙连接细胞间通讯(Gap Junction htercellular Communication,GJIC)及连接蛋白(Connexin,Cx)43、32表达的影响.[方法]采用划痕染料标记示踪技术,以荧光黄染料在细胞同的扩散作为评价间隙连接通讯的指标,观察EGF对原代培养的人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞GJIC的影响,采用激光共聚焦显微镜扫描技术,观察EGF对Cx43、Cx 32表达的影响.[结果]EGF可显著抑制人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞GJIC功能(P＜0.01);增强Cx43、Cx2表达(P＜0.05).[结论]EGF可显著抑制人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞GJIC功能,提示其在子宫内膜增殖性病变的阶段扮演重要角色;EGF增强子宫内膜Cx43、Cx2表达,提示Cx表达量不能完全反映GJIC功能.     

高纯度分离子宫内膜腺上皮及间质细胞和体外培养技术

【目的】探索一种简便、高纯度分离在位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的方法,建立高纯度体外子宫内膜细胞培养模型。【方法】选择正常的新鲜子宫内膜组织20例,通过酶解,过滤及贴壁纯化等技术,每例均用Ryan方法(对照组)及改良的新方法(改良组)分离、纯化及培养子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞,并进行传代。【结果】18例标本获得成功,对照组分离的间质细胞纯度为(84.22±5.17)%,腺上皮细胞纯度为(62.11±6.23)%;改良组分离的间质细胞纯度达(97.89±0.96)%,腺上皮细胞纯度(95.12±2.11)%,与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.01)。【结论】改良方法简便,可高纯度分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞。在体外建立高纯度子宫内膜细胞培养模型,更利于在细胞和分子水平上研究子宫内膜的各种功能及干预调节。     

妇科 宫体和宫颈

061892人子宫内膜细胞的体外纯化和培养/陈晓岚…∥生殖与避孕·—2006,26(9)·—530~532为建立一套子宫内膜细胞体外培养和贮存传代的方法。用胶原酶消化和铜网过筛法分离子宫内膜基质细胞和上皮细胞,进行单层培养。结果:子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗组化染色为阳性,腺上皮细胞可持续培养4~6周,传代2~3次;基质细胞可持续培养5~8周,传代4~6次。结论:建立了可体外培养贮存、传代的子宫内膜细胞,为进一步对其进行抗原组分研究奠定了基础。图2参7(周继铭)061893瘦素对子宫内膜间质细胞分泌白细胞介素的影响/商…     

雌二醇及雌酮对人子宫内膜细胞GJIC及连接蛋白的影响

【目的】 探讨雌二醇(E2)及雌酮(E1)对体外培养的人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞间隙连接细胞间通讯(GJIC)及连接蛋白(Cx)43?32表达的影响?【方法】 采用划痕染料标记示踪技术及激光共聚焦显微镜扫描技术(LSCM),观察E2及E1对原代培养的20例人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞GJIC的影响,采用激光共聚焦显微镜扫描技术,观察E2及E1对Cx 43?Cx 32表达的影响?【结果】 5 × 10-5 mol/L雌二醇作用48 h后间质细胞及腺上皮细胞GJIC功能没有明显变化(P > 0.05),2.5 × 10-5 mol/L雌酮作用间质及腺上皮细胞48 h后,细胞GJIC功能有所下降(P 0.05)?【结论】 E1抑制细胞GJIC功能,提示其在子宫内膜增殖性病变的阶段扮演重要角色;E1及E2均未影响子宫内膜细胞Cx43?Cx32的表达,提示Cx表达量不能完全反映GJIC功能?     

人子宫内膜异位症在位和异位内膜细胞原代培养及形态学观察

目的:探讨子宫内膜异位症(endometriosis,EM)异位子宫内膜细胞原代培养方法,并比较EM在位及异位子宫内膜细胞与正常对照在位子宫内膜细胞形态的差异。方法:采用改良EM细胞原代培养方法,免疫细胞化学法鉴定细胞类型,在光学显微镜及电子显微镜下观察细胞形态差异。结果:正常对照子宫内膜细胞及EM在位、异位子宫内膜细胞分离培养成功率分别为91.67%、93.75%和75.00%。EM异位、在位子宫内膜腺上皮细胞与正常在位子宫内膜腺上皮细胞大小相似,但EM异位子宫内膜腺上皮细胞染色质增多,核增大。EM异位子宫内膜间质细胞较EM在位及正常在位子宫内膜间质细胞小,且细胞膜表面有较多的微绒毛和胞浆突起。结论:注意取材方式,采用改良原代培养方法,可以提高EM异位子宫内膜细胞培养成功率。EM异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞超微结构与正常妇女及EM在位子宫内膜细胞有显著不同。     

高纯度子宫内膜细胞分离和体外培养技术及其应用

目的：分离、纯化子宫内膜间质细胞（ESC）和腺上皮细胞，建立体外ESC蜕膜化模型。方法：选择正常育龄妇女的新鲜子宫内膜组织，经多酶消化制成细胞悬液，分离、纯化间质细胞和腺上皮细胞；分别培养至细胞聚合成片，随机分组，用等渗浓度的甾体激素诱导ESC体外蜕膜化改变。结果：分离的间质细胞其纯度达95%以上，其细胞活力达92%——95%。在此体外培养系统中，ESC对生理剂量激素的应答出现与活体相仿的蜕膜化改变。结论：利用此技术可在细胞和分子水平上研究子宫内膜的各种功能及其调节。     

人子宫内膜细胞的分离培养及鉴定方法的探索

目的　体外分离并培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。方法　用酶解、二次滤网过滤、沉降等方法进行分离、纯化及培养 10例正常子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞并传代 ,通过光镜进行形态学观察 ,用免疫细胞化学法进行细胞鉴定。结果　 9例标本获得成功 ,基质细胞纯度可达 95 %以上 ,腺上皮细胞的纯度约为 90 % ,分离出的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞可以在体外进行增殖。结论　采用二次滤网过滤法可以分离得到纯度较高的内膜腺上皮细胞和基质细胞 ,这两种细胞均能在体外成活并传代。     

异位和正常子宫内膜间质细胞对上皮细胞间隙连接细胞间通讯的影响

目的 研究体外异位和正常子宫内膜间质细胞对内膜上皮细胞间隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular communication, GJIC)功能的不同影响.方法 取24例卵巢处子宫内膜异位灶以及10例正常子宫内膜,分离、纯化上皮细胞和间质细胞,建立体外上皮细胞单独培养、上皮细胞与间质细胞共培养模型.在激光共聚焦显微镜下采用荧光漂白后恢复技术分别检测各组上皮细胞的GJIC功能.结果 ①异位内膜上皮、间质细胞纯度分别为92%、95%,对照组内膜上皮、间质细胞纯度分别为95%、98%;②单独培养的异位内膜上皮细胞与单独培养的正常内膜上皮细胞的GJIC功能无显著性差异(P＞0.05);③与正常间质细胞共培养后,上皮细胞中GJIC功能明显上调,而与异位内膜间质细胞共培养的上皮细胞中GJIC功能未见明显变化.结论 异位间质细胞丧失了调节上皮细胞GJIC的能力,这种调节能力的异常可能与子宫内膜异位症发生有关.     

人子宫内膜细胞原代体外培养方法

目的改良人子宫内膜细胞原代体外培养方法的建立,并对其进行特征鉴定。方法将选择的子宫内膜组织机械法分离,复合酶消化,传代自然增殖法纯化细胞,进行单层培养。通过倒置显微镜观察其大体形态,HE染色观察其胞核情况,免疫细胞化学染色法对间质细胞(endometrial stromal cell,ESC)及上皮细胞(endometrial glandular epithelial cell,EEC)进行鉴定。结果培养的子宫内膜细胞均有ESC和EEC两种形态细胞。EEC和ESC经角蛋白单抗体和波形蛋白单抗体染色,凡是胞质被染成棕黄色的细胞为阳性细胞。结论成功培养了原代人子宫内膜细胞,方法经济、简单,获得细胞成活率高,生长稳定。成功建立子宫内膜细胞原代体外培养体系,为从细胞和分子水平方面研究子宫内膜的各种功能及干预调节奠定基础。     

Three-dimensional cultures of human endometrial cells on Matrigel mimic in vivo morphology

Background  The regulation of endometrial physiology and morphogenesis by the paracrine effectors has been well established using in vivo studies. A more complete understanding of the endometrial function has been delayed due, in part, to a lack of appropriate culture models. In this study, we aimed to simulate the in vivo three-dimensional (3-D) growth pattern of endometrial cells using a 3-D in vitro culture system.

Methods  Isolated endometrial epithelial cells, stromal cells and RL95-2 cells were seeded into culture chambers coated with the extracellular matrix Matrigel and observed using light microscopy. Fluorescence staining and immunohistochemistry were used to assess the morphology.

Results  Depending on the culture conditions, epithelial cells and RL95-2 cells formed multicellular structures on Matrigel; stromal cells remained individually distinguishable or grew together to form 3-D lattice-like structures.

Conclusions  Matrigel provided a good microenvironment for culturing endometrial cells. The cells cultured in the Matrigel-coated chambers closely resembled those seen in vivo.

     

人离体子宫内膜细胞培养方法的建立

目的：建立分离培养人在位及异位子宫内膜间质及腺上皮细胞的方法，为进一步探讨子宫内膜异位症发生，发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：对36例在位子宫内膜及19例异位内膜随机分为离心分离组及筛网分离组进行体外培养。通过光镜观察及S－P免疫组化染色法，对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：离心分离法培养的在位和异位内膜细胞中，成功率分别为61．1％和30％；筛网分离法培养的在位和异位内膜细胞中，成功率分别为83．3％和77．8％。结论：采用筛网分离法及离心分离法均能获得纯度较高的间质与上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于揭示子宫内膜异位症的发病机制，为临床治疗提供重要的理论依据。     

改良式筛网法人子宫内膜细胞的分离与纯化

目的探讨改良式筛网法在分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞中的应用价值。方法通过高浓度胶原酶结合不同浓度、时间消化、过滤及贴壁纯化等技术,应用筛网分离法培养各15例子宫内膜腺上皮和间质细胞,并传代。结果改良式筛网分离法培养中的15例标本中,腺上皮细胞和间质细胞成功率分别为93.3%和93.3%;分离出的腺上皮细胞及间质细胞可体外培养,经分离纯化后腺上皮细胞纯度>90%,间质细胞纯度>98%;两种细胞经传代后间质细胞成功率92.9%;腺上皮细胞传代培养后活力下降,成功率14.3%。结论通过改良式筛网分离法能获得纯度较高的腺上皮细胞与间质细胞;间质细胞可行传代培养;腺上皮细胞传代培养后活力下降,不宜传代。     

子宫腺肌病异位内膜细胞原代培养及鉴定

目的 探讨子宫腺肌病异位内膜细胞原代培养,为进一步研究子宫腺肌病发病机制提供体外细胞模型. 方法 采用酶解、筛网分离、贴壁法分离异位内膜细胞.采用免疫细胞化学法进行细胞鉴定. 结果 经此法分离培养异位细胞培养成功率可达75.0%,消化得到的异位细胞种类较多,不容易分离提纯,腺细胞占6.5%,间质细胞占13.3%,平滑肌细胞占80.2%. 结论 采用酶解、筛网分离、贴壁法可以获得子宫腺肌病的异位细胞,不能获得纯度较高异位腺细胞,子宫腺肌病异位腺细胞提纯需要进一步探讨.