溶酶体自噬途径降解α-synuclein蛋白作用研究

目的 探讨α-synuclein蛋白细胞内溶酶体途径降解机制.方法 用神经生长因子NGF诱导分化PC12细胞作为研究多巴胺能神经元的细胞载体,应用鱼藤酮处理PC12细胞建立α-synuclein蛋白细胞模型.使用溶酶体途径降解抑制剂E64处理神经元样分化的PC12细胞,应用免疫荧光双标方法观察PC12细胞内硫黄素S、α-synuclein蛋白阳性聚集包涵体形成情况,比较各组的差异.结果 用E64处理鱼藤酮预处理过的PC12细胞后α-synuclein蛋白聚集且较多包涵体形成(15.36±0.85)%,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 溶酶体自噬途径可能在α-synuclein蛋白降解、聚集和多巴胺神经元死亡过程中发挥重要作用.     

α-核突触蛋白和自噬在帕金森病中的作用

α-核突触蛋白（α-synuclein）是路易小体的重要组分与帕金森病（PD）发病机制密切相关,如何调控其表达一直是阐明其致病机制以及防治的研究热点。在蛋白质量调控系统巾,泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬-溶酶体途径（ALP）都参与了仪一核突触蛋白的降解。在老化、外源性毒素和基因突变等情况下,UPS和ALP都可以被诱导。如果上述两条途径,尤其是自噬出现功能障碍就会导致神经变性和细胞死亡。因而,通过调控自噬进而促进易聚集蛋白α-核突触蛋白的清除成为延缓PD疾病进展的一个潜在治疗靶点。     

α—synuclein与帕金森病（综述）

α-synuclein是一种位于突触前末梢的蛋白,NACP是α-synuclein的人类同系物。α-synuclein基因的两种错义突变与家族性帕金森病（FPD）密切相关。目前大量研究发现在PD的路易小体中有NACP的免疫阳性反应,推测α-synuclein可能参与路易小体的形成及神经变性过程,本文就α-synuclein基因、α-synuclein蛋白的聚集及其在PD发病机制中作用等方面的研究做一综述。     

蛋白降解途径与帕金森病关系研究进展

帕金森病(PD)中具病理诊断意义的蛋白包涵体路易小体的出现提示蛋白聚集异常或清除障碍在PD发病中的作用。泛素蛋白酶体系统(UPS)和自噬溶酶体途径(ALP)是细胞内两个主要的蛋白质降解通路。随着对UPS在PD发病机制中作用的认识加深,ALP与PD的关系也越来越受关注,一系列应用ALP增强剂的研究显示,通过增强自噬、增加异常蛋白的清除,具有良好的PD治疗前景。近来的研究发现,ALP和UPS在功能上相互联系,如何合理调节自噬及有效利用ALP与UPS之间的联系,由此精确调控细胞内蛋白质的代谢还有待进一步研究。     

自噬和蛋白酶体降解途径在突变型α-突触核蛋白PC12细胞凋亡中的作用

目的 利用建立好的转染A53T突变型α-突触核蛋白的大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞株,探讨自噬和泛素-蛋白酶体通路在细胞凋亡途径中的具体作用.方法 选择特异性蛋白酶体抑制剂和大自噬抑制剂及诱导剂作用于稳定转染的A53T细胞株,四甲基偶氮唑盐法和流式细胞仪检测细胞活力和各组细胞凋亡率,电镜观察超微结构,并测定细胞培养液中NO的活力和热休克蛋白70(Hsp70)及Caspase-3蛋白表达.结果 蛋白酶体抑制剂环氧霉素(100 nmol/L)和(或)大自噬抑制剂3-MA(10 mmol/L)处理A53T细胞24 h后环氧霉素组、3-MA组和环氧霉素+3-MA组细胞活力(A值分别为0.23±0.01、0.19±0.01、0.17±0.01)较对照A53T细胞组(A值为0.32±0.06)明显下降(P<0.05);而大自噬诱导剂雷帕霉素(0.2 μg/ml)处理后细胞存活率(A值为0.44±0.08)显著高于其余用药组.与对照组(1.55%±1.15%)相比,3-MA、环氧霉素、环氧霉素+3-MA组作用24 h后A53T细胞的凋亡百分率(分别为4.74%±0.91%、4.59%±1.18%、5.40%±1.75%)显著增高(P<0.05),而大自噬诱导剂下调蛋白酶体抑制剂导致的凋亡;蛋白酶体抑制剂组NO和Hsp70蛋白含量也明显高于对照组.结论 大自噬和蛋白酶体途径障碍促进了凋亡发生,抑制或诱导自噬对Hsp70和NO的影响不如蛋白酶体途径对其影响大.     

硫辛酸对帕金森病小鼠模型自噬蛋白表达水平的影响

目的 探讨硫辛酸(lipoic acid,LA)对MPTP诱导的C57BL/6帕金森病(Parkinson's disease,PD)小鼠模型黑质及纹状体TH、parkin、PINK1、DJ-1自噬相关蛋白表达水平的影响。方法 将60只C57BL/6小鼠随机分为PD模型组、正常组、治疗组、预保护组,采用背部皮下注射MPTP制作PD模型(每组各15只),行为学评价造模,Western Blotting法检测黑质、纹状体TH、parkin、PINK1、DJ-1蛋白的表达水平,免疫组化法观察黑质及纹状体阳性神经元数,免疫荧光检测PINK1的表达水平。结果(1)与正常组比较,PD模型组小鼠黑质、纹状体内TH、Parkin、PINK1、DJ-1的表达水平均明显降低(P<0.01);(2)与PD模型组比较,预保护组黑质、纹状体内TH、PINK1、Parkin、DJ-1表达水平均明显增高(P<0.05);(3)与治疗组比较,预保护组小鼠黑质、纹状体内TH、PINK1、Parkin表达水平略增高,预保护组DJ-1表达水平略降低,但两组比较无统计学差异(P>0.05)。结论 线粒体自噬参与PD小鼠的发病过程; 硫辛酸可能通过上调PD小鼠自噬相关蛋白的表达水平而发挥对多巴胺神经元的保护作用,从而为PD的防治提供新的思路。     

突变型α-核突触蛋白的自噬性降解途径及可能机制

目的 观察突变型α-核突触蛋白对PC12细胞增殖的影响和可能的降解途径,探讨其在帕金森病发病机制中的作用.方法 对转染了α-核突触蛋白(A30P)的PC12细胞进行药物干预,检测细胞的增殖活性,并采用透射电镜观察细胞超微结构改变以及自噬的特征性改变,同时检测α-核突触蛋白的表达和超氧化物歧化酶(SOD)的水平.结果 (1)Western Blot法检测α-核突触蛋白的表达:A30P+渥曼青霉素组(A30P+W组)、A30P+1-甲基4-苯基吡啶组(A30P+MPP+组)较A30P组明显增高,以A30P+W组最为明显;而A30P+雷帕霉素组(A30P+R组)条带较A30P组减低(P＜0.01);(2)不同时间点细胞培养液中SOD水平(U/ml)的测定:用MPP+处理转染了突变型α-核突触蛋白的PC12细胞后,培养液中SOD水平(A30P+MPP+组:3 h:97.49±13.8;12 h:102.7±12.7:24 h:101.5±11.8;48 h:104.3±12.4)较A30P组在各时间点显著下调(t=3.7721,P=0.0017);A30P+R组在给药12 h以后,培养液中SOD水平逐渐升高,其中在24 h(121.2±13.0)、48 h(124.3±14.1)和72 h(127.7±13.7)时与A30P+W组比较差异有统计学意义(t=2.9746,P=0.0083);突变型α-核突触蛋白激活了自噬途径,并介导了MPP+的毒性作用,自噬抑制剂渥曼青霉素可通过抑制自噬而加剧α-核突触蛋白积聚,导致细胞死亡;而自噬诱导剂雷帕霉素则可以通过诱导自噬的发生而促进α-核突触蛋白的降解和细胞生长.结论 α-核突触蛋白的异常积聚导致PC12细胞的自噬性细胞死亡,促进自噬有助于突变型α-核突触蛋白降解,对细胞具有保护作用.     

线粒体自噬和帕金森病

帕金森病(PD)是中老年人常见的中枢神经系统退行性疾病,目前认为此病与多个因素有关。近年的研究表明线粒体自噬是PD发病机制之一,本文就线粒体自噬及其与PD的关联作一综述。     

自噬参与帕金森病发病的研究进展

近年来,蛋白质的降解障碍被认为是帕金森病（Parkinson’Sdisease,PD）发病过程中的重要因素,人们已经公认泛素一蛋白酶体系统（ubiquitin--pro—teasomesystem,UPS）功能异常或衰竭能够导致细胞内异常蛋白蓄积、细胞功能障碍,甚至细胞凋亡。与此同时,蛋白降解的另一条途径——自噬-溶酶体途径（autophagy—lysosomepathway,ALP）也已成为了生命科学领域的研究热点,自噬与神经变性疾病,尤其是PD的关系日益受到人们的重视。     

自噬与神经退行性疾病

自噬(Autophagy)是真核细胞中普遍存在的生物学过程,通过溶酶体的介导作用完成对于一些大分子、细胞器以及一些半衰期较长的蛋白质的降解,从而使细胞维持正常的物质代谢,保持正常的生理状态。神经退行性疾病是一类由神经元不可逆性降解、神经胶质细胞过度增生以及一些异常蛋白在胞内累积从而产生细胞毒性,造成细胞代谢失调所引起的慢性、进展性认知障碍疾病。目前研究表明,神经退行性疾病的产生常伴随有细胞自噬过程的下调,而激活细胞自噬过程可以缓解神经退行性疾病的症状。因此,通过研究细胞自噬过程及其与神经退行性疾病的关联,可以为神经退行性疾病的临床治疗提供新的思路。     

α-突触核蛋白及其在帕金森病发病中的可能机制

α-突触核蛋白（AS）足Lewy体的重要组成成分。AS基因定位于第4号染色体，其突变型与常染色体显性遗传性帕金森病（PD）的发病密切相关。在PD中，AS出现了折叠错误和排列混乱。AS的聚集能力，特别是在氧化应激状态下，被认为是其病理机制的核心，AS的异常聚集和降解障碍导致蛋白酶的抑制和多巴胺能神经元的死亡。因此，AS致病形式对认识PD的发生有重要意义。     

左旋多巴-聚酰胺-胺树突状大分子共轭体抑制帕金森病α-突触核蛋白纤丝化过程

目的构建左旋多巴-聚酰胺-胺(PAMAM)树突状大分子共轭体,评价其在α-突触核蛋白(α-Syn)纤丝化过程中的作用。方法采用左旋多巴对PAMAM树突状大分子进行表面修饰,合成端基改性产物左旋多巴-PAMAM树突状大分子共轭体。应用超视光谱和衰减傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)鉴定左旋多巴-PAMAM树突状大分子共轭体合成,硫磺素含量测定及FTIR评价左旋多巴-PAMAM树突状大分子共轭体在α-Syn纤丝化中的作用。结果超视光谱和FTIR可以鉴定共轭体是否形成,相对于单独的左旋多巴及PAMAM树突状大分子,共轭体的FTIR峰值区域吸收增加。α-Syn与PAMAM树突状大分子共孵育后,与空白对照组(硫磺素+缓冲液)比较,其硫磺素荧光染色显著减少(P0.05);与左旋多巴-PAMAM树突状大分子共轭体共孵育后,硫磺素荧光染色进一步减弱。α-Syn的FTIR显示,左旋多巴-PAMAM树突状大分子共轭体组随时间延长,峰值区域明显下降,且吸收率的差异发生在1 636 cm-1和1 655 cm-1。结论左旋多巴与PAMAM树突状大分子可以形成共轭体,左旋多巴-PAMAM树突状大分子共轭体显著抑制α-Syn纤丝化,且各时间点的效果均较单独应用左旋多巴或PAMAM树突状大分子更好。     

Construction and expression of nucleic acid vaccine pVAXl-h-alpha S1-140 coding human alpha-synuclein

BACKGROUND： The deposition of α -synuclein （ α -syn） aggregates is a neuropathological feature of Parkinson＇s disease. It remains impossible to involve α-syn aggregation in the treatment of Parkinson＇s disease. A nucleic acid vaccine will provide a new pathway to immunotherapy for Parkinson＇s disease. OBJECTIVE： To construct a recombinant eukaryotic expression vector pVAX1 coding human α -syn and to observe its expression level in COS-7 cells. DESIGN AND SETTING： The present bioengineering and molecular biology experiment was performed at Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University ＆ Chongqing Key Laboratory of Neurology. MATERIALS： The eukaryotic expression plasmid pVAXI, human embryonic brain tissue, healthy human blood cells, and COS-7 cells were purchased from Promega Company, USA. METHODS： The full-length CDS sequence of the human a -syn gene was amplified by RT-PCR, which contained restriction sites for the enzymes Kpn Ⅰ, Xba Ⅰ and Kozak consensus sequence. Then the PCR products and eukaryotic expression vector pVAX1 were digested with Kpn Ⅰ and Xba Ⅰ simultaneously, and were extracted and ligated by T4 ligase. The recombinant constructs pVAX1-h α -S1-140 were transformed into competent E. coli TOP 1 0 cells and the positive clones were screened and selected using PCR analysis, restriction digestion analysis, and DNA sequencing. The constructs were then tested for protein expression in COS-7 cells by RT-PCR and Western blotting. MAIN OUTCOME MEASURES： Identification of an eukaryotic expression vector containing the human α -syn gene, pVAX1-h α-S1-140, and detection of the expression in mammalian cell COS-7. RESULTS： The pVAX1 vector was successfully cloned with human α -syn in the correct orientation and in-frame. The DNA vaccine constructs pVAX 1-h α-S1-140 with the human α-syn gene were shown to be expressed in COS-7 cells. Human α-syn was successfully expressed in the mammalian cell line and was detected by RT-PCR     

β淀粉样蛋白（1-42）促进α-突触核蛋白在Ser129位点磷酸化和聚集

目的：通过转染人α-突触核蛋白（α-syn）A53T突变基因的PC12细胞（A53T-PC12细胞）模型,探讨β-淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）对A53T-PC12细胞在Ser29位点α-syn磷酸化（Pα-syn）水平、聚集程度的影响。方法：分别予H2O2、PBS、Aβ1-42干预A53T-PC12细胞（将A53T-PC12细胞分为：PBS干预组;5μmol.L-1Aβ1-42干预组;5μmol.L-1Aβ1-42＋300μmol.L-1维生素C干预组;200μmol.L-1H2O2干预组）,观察细胞内活性氧自由基（ROS）水平变化。并通过双重免疫荧光染色观察A53T-PC12细胞内α-syn聚集情况,并通过Western blot半定量分析A53T-PC12细胞内Ser129位点磷酸化Pα-syn水平。结果：Aβ1-42增加细胞内ROS。免疫荧光染色提示Aβ1-42干预后促进A53T-PC12细胞内α-syn聚集;Western blot半定量分析显示Pα-syn较PBS干预组升高（P〈0.001,P〈0.05）。结论：Aβ1-42促进A53T-PC12细胞内α-syn在Ser129位点磷酸化和聚集。     

鱼藤酮灌胃制备帕金森病小鼠模型的评价及机制

目的探讨经持续鱼藤酮灌胃制备帕金森病小鼠模型及其发病机制。方法将50只老年雄性C57小鼠随机分为模型组和对照组,2组均给予连续灌胃12周,模型组予灌注0．01ml／g鱼藤酮氯仿溶液,对照组则予灌注0．01mg／g氯仿溶液。在灌胃前、灌胃6、12周时对2组小鼠行网格试验、爬杆试验和滚轴试验以检测行为学变化,使用高效液相色谱电化学法（HPLC-ECD）检测纹状体多巴胺（DA）、3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）等神经递质浓度;对肠、胸段脊髓、中脑行α-突触核蛋白（α-Syn）、硫磺素S（ThS）、酪氨酸羟化酶（TH）等免疫组化染色。结果至灌胃12周时模型组行为学变化较对照组均有显著性差异（P〈0．01）,模型组纹状体DA、DOPAC、HVA水平较对照组有显著性降低（P〈0．01）。灌胃6周时模型组小肠内、胸段脊髓处α-Syn的表达水平较对照组明显增加,且ThS表达比例增多,而中脑处a-Syn及TH阳性细胞数无显著性差异;至灌胃12周时模型组中脑处Syn的表达较对照组明显要增多,而TH阳性细胞数较对照组显著性减少（P〈0．05）。结论经持续鱼藤酮灌胃制备的慢性进展性帕金森病小鼠模型模拟了PD缓慢进展的病理过程,其机制可能是小肠神经丛局部的α-Syn多聚体通过类朊蛋白途径沿着神经传导通路播散至脑内。     

Rifampicin inhibits rotenone-induced microglial inflammation via enhancement of autophagy

Mitochondrial and autophagic dysfunction, as well as neuroinflammation, are associated with the pathophysiology of Parkinson's disease (PD). Rotenone, an inhibitor of mitochondrial complex I, has been associated as an environmental neurotoxin related to PD. Our previous studies reported that rifampicin inhibited microglia activation and production of proinflammatory mediators induced by rotenone, but the precise mechanism has not been completely elucidated. BV2 cells were pretreated for 2 h with rifampicin followed by 0.1 μM rotenone, alone or in combination with chloroquine. Here, we demonstrate that rifampicin pretreatment alleviated rotenone induced release of IL-1β and IL-6, and its effects were suppressed when autophagy was inhibited by chloroquine. Moreover, preconditioning with 50 μM rifampicin significantly increased viability of SH-SY5Y cells cocultured with rotenone-treated BV2 cells in the transwell coculture system. Chloroquine partially abolished the neuroprotective effects of rifampicin pretreatment. Rifampicin pretreatment significantly reversed rotenone-induced mitochondrial membrane potential reduction and reactive oxygen species accumulation. We suggest that the mechanism for rifampicin-mediated anti-inflammatory and antioxidant effects is the enhancement of autophagy. Indeed, the ratio of LC3-II/LC3-I in rifampicin-pretreated BV2 cells was significantly higher than that in cells without pretreatment. Fluorescence and electron microscopy analyses indicate an increase of lysosomes colocalized with mitochondria in cells pretreated with rifampicin, which confirms that the damaged mitochondria were cleared through autophagy (mitophagy). Taken together, the data provide further evidence that rifampicin exerts neuroprotection against rotenone-induced microglia inflammation, partially through the autophagy pathway. Modulation of autophagy by rifampicin is a novel therapeutic strategy for PD.