缺氧所致神经元AMPA受体的结构组成及功能变化

目的探讨缺氧损伤后神经元膜表面谷氨酸AMPA受体亚单位(GluRs)含量、受体结构组成、功能的变化及其在Ca2 超载和延迟性细胞死亡中的作用.方法建立神经元缺氧损伤模型,采用PI染色、双重免疫荧光标记和细胞比色分析技术定量观察神经元死亡和膜表面GluRs含量变化,采用Fura-2法测定胞内Ca2 含量,以膜片钳技术检测微兴奋性突触后电流(mEPSCs)的变化.结果伤后胞内Ca2 含量和神经元死亡数量明显高于对照组;膜表面GluR2含量及含GluR2的突触数目显著减少(P<0.05),而GluR3含量较对照组则显著升高(P<0.05);缺乏GluR2的AMPA受体通道对Ca2 有很高的通透性.结论缺氧可致神经元膜表面AMPA受体的结构组成发生变化,缺乏GluR2的受体通道数目增加,介导了Ca2 的快速内流,引起神经元的延迟性死亡.     

PTEN对原代培养大鼠海马神经元牵张损伤后GluR2受体亚单位定位表达的调节作用

目的 探讨第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)对大鼠原代海马神经元牵张损伤后AMPA受体GluR2亚单位定位表达的调节作用.方法 选用新生SD大鼠培养原代海马神经元,建立神经元牵张损伤模型,利用RNAi 慢病毒载体敲减神经元中PTEN基因的表达.采用Tunel染色评估神经元牵张各时相点的损伤情况.采用Western blot检测牵张各时相点AMPA受体GluR2亚单位在细胞中的表达定位变化.结果 慢病毒介导的RNAi能有效下调PTEN 基因的表达.PTEN基因表达下调后,0、2、6 h细胞凋亡比例无明显差异,但24 h细胞凋亡比例由(68.7%±5.1%)下降至(39.3%±3.5%),48 h细胞凋亡比例由(76.7%±5.3%)下降至(52.0%±4.3%).神经元细胞膜中的AMPA受体GluR2亚单位含量在牵张损伤6、24、48 h明显降低.下调PTEN 基因的表达后,神经元细胞膜中的AMPA受体GluR2亚单位含量在牵张损伤6 h无明显降低,牵张损伤24、48 h后降低.细胞损伤6、24、48 h时,下调PTEN 基因的表达能够明显上调神经元细胞膜中的AMPA受体GluR2亚单位含量.结论 海马神经元受到机械性牵张损伤后,下调PTEN的表达能够有效地阻止AMPA受体GluR2亚单位在细胞膜上定位的降低,降低凋亡细胞比例.PTEN对AMAP受体的调节作用可能为预防和治疗脑创伤提供一条新途径.     

全脑缺血再灌模型大鼠皮层神经元GluR2表达的变化

目的:采用免疫组化技术,研究全脑缺血后再灌不同时点大鼠皮层神经元AMPA受体亚单位GluR2表达的变化,探讨GluR2在缺血性神经元损伤中的作用。方法:将36只SD大鼠随机分为6组,即正常组、缺血再灌注后2h、12h、24h、48h、72h 5个时间点组。参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法制备全脑缺血大鼠模型,缺血再灌后的大鼠分别在存活2h、12h、24h、48h及72h后采用免疫组化法测定皮层神经元GluR2的表达量。结果:模型再灌5个时点之间SD大鼠皮层神经元GluR2表达量没有统计学差异(P>0.05),但与正常组相比,各组的的表达量明显降低(P<0.05)。结论:脑缺血再灌后皮层神经元AMPA受体亚单位GluR2表达减少,介导胞外Ca2+内流,引起神经细胞死亡。     

AMPA受体GluR2亚基研究进展

GluR2亚基由于其mRNA Q/R位点编辑,使得它在AMPA受体中的相对含量决定了AMPA受体的钙离子不通透性。在多种神经性损伤或退行性疾病中,神经元GluR2表达下调,Ca2＋内流增加。但是目前关于GluR2下调机制,GluR2在神经元死亡或耐受中的作用及机制尚未完全阐明。本文就AMPA受体GluR2亚基调控及其与神经元损伤关系的研究进展作一综述。     

下调PTEN基因对缺氧损伤后海马神经元NR2B受体调控机制研究

目的:探讨用RNAi干扰技术下调第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)对缺氧损伤引起的神经元NR2B受体表达调控机制.方法:建立海马神经元培养缺氧缺糖(Oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤模型,转染shRNAspten-GFP质粒,采用细胞比色分析(Colorimetric assay)法观察神经元膜表面NR2B含量,RT-PCR测定NR2B受体的mRNA的表达,采用Fura 2-AM法测定胞内Ca2+浓度,AlamarBlue进行神经元活力分析.结果:shRNAspten-GFP能成功转染到神经元中;细胞比色法显示神经元膜表面有大量NR2B表达,与PshGFP对照组相比shRNAspten治疗组NR2B含量明显降低(P＞0.05),RT-PCR测定结果与细胞比色法结果基本一致;OGD损伤组比正常组胞内Ca2+浓度显著升高(P＜0.05),转染PTEN基因后胞内Ca2+浓度比PshGFP对照组明显降低(P＜0.05);无关对照PshGFP组神经元活力较正常对照组和治疗组均有显著下降(P＜0.05) o结论:下调PTEN基因可降低NR2B的表达,阻断Ca2+内流,增加细胞活力,从而保护神经元损伤.     

永久性局灶性中动脉阻断脑缺血(pMCAO)模型大鼠脑内突触相关蛋白表达的免疫组织化学观察

目的观察永久性局灶性中动脉阻断脑缺血(pMCAO)模型大鼠脑缺血发作后2 d、7 d脑内突触相关蛋白表达的变化。方法制作大鼠永久性局灶性中动脉阻断脑缺血(pMCAO)模型。缺血动物术后随机分为缺血2 d组、缺血7 d组,另设假手术组。在术后2 d、7 d 2个时间点采用HE染色观察动物神经病理学改变,同时采用免疫组织化学法观察动物的缺血侧脑组织突触素-I(synapsin-I)、突触后致密蛋白95(PSD-95)、α-突触核蛋白(α-synuclein)表达情况。结果与假手术组相比,缺血后,模型动物神经元大量变性坏死,数目减少,排列散乱。缺血后2 d,synapsin-I在CA1区、CA3区、皮层表达显著减少(P<0.05或P<0.01),PSD-95在CA1区、皮层表达显著减少(P<0.05或P<0.01),α-synuclein在CA1区神经元产生显著积聚(P<0.01);缺血后7 d,synapsin-I在CA1区、皮层表达仍显著降低(P<0.01),PSD-95在CA1区、皮层表达显著减少(P<0.05或P<0.01),α-synuclein在CA1、CA3、皮层表达显著增加(P<0.05或P<0.01)。结论 pMCAO模型大鼠在脑缺血发生后,神经突触有关蛋白的表达显著改变,并随缺血后不同时间点表达情况不同,这可能与神经元突触重塑有关。突触相关蛋白的表达与缺血损伤程度密切相关。     

α-突触核蛋白通过Rab5B下调海马神经元膜表面NMDA受体含量及其介导的Ca~(2+)内流和内向电流

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)对原代海马神经元膜表面N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体含量和功能的影响及其机制。方法细胞外添加基因重组α-Syn,使其进入原代培养神经元细胞内,观察敲减Rab5B基因前后神经元膜表面NMDA受体(NMDAR)和Rab5B表达的变化;NMDA激活NMDAR,活细胞工作站测定神经元Ca~(2+)内流变化,全细胞膜片钳记录内向跨膜电流变化。结果α-Syn增加神经元Rab5B的表达,减少膜表面NMDAR含量,并因而抑制NMDA引起的Ca~(2+)内流及内向跨膜电流;敲减Rab5B可逆转α-Syn对NMDAR的下膜作用及功能的影响。结论α-Syn通过上调Rab5B而下调海马神经元膜表面NMDAR含量及其介导的Ca~(2+)内流及内向电流。     

NMDA受体在培养神经元突触内和突触外发育中的变化

目的 观察培养大鼠海马神经元NMDA受体在突触内和突触外发育中的变化.方法 采用膜片钳的全细胞模式和外面向外模式分别记录突触内和突触外NMDA受体通道电流.结果 培养2周海马神经元突触内NMDA受体通道介导的微小兴奋性突触后电流(mEPSCNMDA)幅度比培养1周神经元小,对NMDA受体亚单位NR2B的特异拮抗剂ifnprodil的敏感性远低于培养1周神经元;培养2周神经元突触外NMDA受体的单通道电流幅度和开放概率比培养1周神经元增大,但两者的电导和翻转电位无显著差异.ifenprodil降低培养1周和2周神经元突触外NNDA受体单通道电流的电导和开放概率,且对培养2周神经元开放概率的抑制作用更显著.结论 NMDA受体通道电流在培养海马神经元突触内和突触外有发育变化,提示NMDA受体NR2亚单位在培养1周的神经元突触内和突触外均主要为NR2B亚单位;而神经元培养到2周时,突触内NR2B亚单位逐渐被NR2A亚单位取代,突触外仍主要为NR2B亚单位.     

原代培养大鼠海马神经元液压冲击后PAFR、COX-2和GluR2基因表达比较研究

【目的】研究海马神经元在中度液压冲击损伤后PAFR、COX-2和2GluR2基因表达时序性变化的相关性。【方法】原代培养大鼠海马神经元,复制改良Scott’s中度液压冲击神经元损伤模型,采用免疫荧光双标技术鉴定神经元纯度,应用RT-PCR技术对PAFRmRNA、COX-2mRNA和GluR2mR．NA的表达进行定量研究。【结果】对照组COX-2mRNA呈低表达,损伤后表达逐渐增高,12h达最高值,损伤后12h组与对照组相比差别有显著性（P〈0．05）;对照组GluR2mRNA呈高表达,损伤后表达逐渐减弱,8h达最低值,损伤后8h、12h组与对照组相比差别有显著性（P〈0．05）;对照组PAFRmRNA呈高表达,损伤后表达逐渐减弱,8h达最低值,损伤后8h、12h组与对照组相比差别有显著性（P〈0．05）。【结论】正常时COX-2mRNA在体外培养神经元中仅有少量表达,损伤后4h表达增加,12h达最高值,钙h时仍高于正常。正常时GluR2mRNA在体外培养神经元有较多表达,损伤后4h表达下降,8h达最低值,48h时仍低于正常。正常时PAFRmRNA在体外培养神经元中有较多表达,损伤后4h表达下降,8h达最低,48h时仍低于正常。PAFRmRNA、COX-2mRNA和GluR2mRNA在体外海马神经元中度液压冲击损伤中表达的时序性变化特点基本一致,三者关系密切,共同参与脑损伤病理生理过程。     

GluR2在大鼠蜗核的年龄依赖性表达及与突触发育的关系

目的 检测α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体亚型GluR2和突触小泡蛋白(SYP)在不同年龄大鼠蜗核中的表达,探讨GluR2的表达规律及与突触发育的关系.方法 选取2、3、4、6、8和10周SD大鼠,应用免疫荧光组化方法观察各年龄大鼠GluR2及SYP在蜗核中的表达及其相互关系.结果 GluR2在不同年龄大鼠蜗核神经元中均有表达,生后2、3周时表达较弱,4周时逐渐增强,6周达高峰,之后急剧下降,10周表达最弱.GluR2在大鼠耳蜗背侧核颗粒细胞层表达较强,在分子层和多极细胞层表达较弱.SYP在不同年龄大鼠蜗核神经元中均有表达,生后2周表达最弱,4周显著增强,6周为高峰,8周时骤然降低并稳定表达.结论 大鼠生后发育过程中蜗核GluR2及SYP的表达呈现基本一致的年龄依赖性规律,GluR2在蜗核的表达可能与蜗核突触成熟及功能发育有关,其年龄依赖性表达现象可能是中枢神经系统感觉功能发育及可塑性的重要机制.     

半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对缺血性损伤后神经元形态的作用

目的:观察半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对原代神经元缺血性损伤后形态变化的作用。方法:在不同浓度孟鲁司特存在条件下,以缺氧缺糖(OGD)2 h和再灌(R)24 h(OGD/R)诱导大鼠原代神经元及皮层混合培养细胞的神经元损伤;以免疫染色法检测神经元数量、胞体大小、胞体总神经突起数量、一级神经突起数量、长度及其分支数量等指标,观察神经元形态的变化。结果:OGD/R可明显减少神经元的数量,显著改变神经元的形态。而孟鲁司特(0.0001～1μmol/L)能减轻单独神经元培养中OGD/R诱导的神经元数量减少,抑制一级神经突起分支数量增加;在混合培养中,孟鲁司特(0.0001～0.1μmol/L)增加OGD/R后一级神经突的长度,减少神经突起数量以及一级神经突起分支数量。结论:半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对大鼠原代神经元缺血性损伤有保护作用。     

Cu-ATSM保护内皮细胞糖氧剥夺再灌注损伤的机制

目的：探讨铜-二乙酰-2(N⁴-甲基氨基硫脲)(Cu-ATSM)对糖氧剥夺再灌注(OGD/R)后人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的作用及其潜在机制。方法：将体外培养的HUVECs分为Control组、OGD/R组、OGD/R+Cu-ATSM组;采用流式细胞术检测HUVECs的凋亡情况;采用Mito-tracker染色检测线粒体形态;JC-1染色分析各组线粒体膜电位的变化;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测各组自噬相关蛋白如ATG5、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ的激活情况;采用免疫荧光检测各组细胞LC3Ⅱ的表达情况。结果：流式细胞术结果显示,与Control组比,OGD/R损伤后HUVECs凋亡数目显著上升,而当Cu-ATSM治疗后,凋亡的HUVECs显著减少(均P<0.05)。Mito-tracker及JC-1染色结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后线粒体的形态明显受到损伤,线粒体功能受损,膜电位下降,而OGD/R+Cu-ATSM组治疗后能够改善损伤的线粒体功能,维持线粒体形态和线粒体膜电位(均P<0.05)。Weste...     

体外培养的大鼠皮层神经元氧糖剥夺后Sema3A;Nrp-1 mRNA表达上调与轴突网络损伤的关系

 【目的】 研究体外培养的大鼠皮层神经元氧糖剥夺(OGD)处理后,Sema3A,Nrp-1 mRNA的表达变化及其与神经元轴突网络损伤的关系。【方法】 体外培养新生SD大鼠皮层神经元,随机分为正常对照组和OGD处理组：噻唑蓝(MTT)比色法测定神经元活性;βⅢ-tubulin免疫荧光染色观察轴突网络形态学变化,Real-time PCR 检测Sema3A及其受体Nrp-1 mRNA的表达;βⅢ-tubulin免疫荧光染色观察外源性Sema3A蛋白对神经元轴突生长的影响。【结果】 随着OGD时间的延长,神经元活性呈梯度下降(P < 0.01);OGD处理4 h可导致神经元轴突网络发生明显的崩解损伤;OGD处理4 h、6 h后,Sema3A mRNA表达水平显著上调(P < 0.01);OGD处理6 h后,Nrp-1 mRNA表达水平显著上调(P < 0.01);经外源性Sema3A(5 mg/mL)蛋白处理,可观察到神经元的轴突生长及延伸受到明显抑制(P < 0.01)。【结论】 OGD处理可诱导Sema3A;Nrp-1 mRNA表达上调,并且外源性Sema3A蛋白可在体外抑制轴突生长,提示Sema3A/Nrp-1可能参与OGD处理后轴突网络崩解,细胞凋亡等病理生理过程。     

白皮杉醇调控GSK-3β/Nrf2信号通路减轻神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤

目的：阐明白皮杉醇对抗脑缺血再灌注损伤的作用及机制。方法：构建氧糖剥夺再灌注（OGD/R）神经细胞模型,于氧糖剥夺2 h后给予白皮杉醇处理细胞24 h,采用MTT法检测细胞存活率,细胞内乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测细胞损伤程度,比色法检测细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性和三磷酸腺苷（ATP）含量,流式细胞术和倒置荧光显微镜检测细胞活性氧水平,透射电子显微镜观察神经细胞线粒体超微结构,JC-1探针法检测线粒体膜电位,蛋白质印迹法检测蛋白激酶B(AKT)与糖原合成酶激酶（GSK）-3β的磷酸化水平,免疫荧光染色法观测细胞核转录因子红系2相关因子（Nrf）2核定位。采用上述方法观察Nrf2抑制剂ML385预处理24 h对白皮杉醇改善OGD/R神经细胞活性、抗氧化性作用的影响,并采用蛋白质印迹法检测Nrf2、血红素加氧酶1、醌氧化还原酶1的表达水平。结果：白皮杉醇可以显著提高OGD/R神经细胞存活率、减少LDH释放和活性氧水平、提高SOD活性、改善线粒体超微结构损伤、提高线粒体膜电位和ATP水平（均P<0.05）,增强AKT与GSK-3β蛋白的磷酸化水平,上调Nrf2、血红素加氧酶1、...     

脑出血血肿周边脑区谷氨酸及受体的变化

目的 观察脑出血过程中血肿周边脑区谷氨酸（Ｇｌｕ）、谷氨酸受体（ＧｌｕＲ）的变化规律,探讨其对局部神经元的损伤机制。方法 应用高效液相色谱、受体的放射配基结合分析等,监测实验性脑出血后大鼠血肿周边脑区的谷氨酸及其受体含量。结果 脑出血后３ｈ血肿周边脑区Ｇｌｕ含量开始升高,在血肿形成的高峰期１２ｈ达峰值;而血肿周边脑区ＧｌｕＲ的表达在脑出血后６ｈ处于明显的低表达状态;Ｇｌｕ的含量与ＧｌｕＲ的表达呈显著的负相关;血肿周边脑区ＧｌｕＲ Ｋｄ值处于持续升高状态,且ＧｌｕＲ与其Ｋｄ值变化表现非常显著的负相关。结论 Ｇｌｕ与血肿周边脑区神经元损伤密切相关,血肿周边脑区Ｇｌｕ与ＧｌｕＲ结合力的分离,是血肿周边脑区神经元不可逆损伤的重要因素之一。     

miR-29家族在深低温停循环相关性神经元损伤中的作用

目的 观察miR-29家族在低温糖氧剥夺/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R） HT22细胞中的表达,进而探究miR-29家族在深低温停循环（deep hypothermic circulatory arrest,DHCA）相关性神经元死亡中的特异性作用及其相关机制。方法 将HT22细胞随机分为对照组、低温OGD/R组、类似物组（agomir-NC组、agomir-29a组、agomir-29b组和agomir-29c组）和抑制剂组（antamir-NC组、antamir-29a组、antamir-29b组和antamir-29c组）;运用一个密闭容器和一个厌氧产气袋建立OGD/R模型;定量PCR检测HT22细胞内miR-29家族的表达;CCK-8方法检测活细胞数目;Western blot法检测HT22细胞内Bax和PUMA蛋白含量;JC-1和H2DCFDA法分别测定HT22细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）。结果 低温OGD/R模型中miR-29家族表达显著下降（P<0.01）。miR-29家族过表达显著抑制了低温OGD/R诱导的HT22细胞死亡,以及Bax和PUMA蛋白的表达（P均<0.01）;同时减轻了ROS含量和MMP水平（P均<0.01）。结论 miR-29家族可以通过减轻氧化应激从而对DHCA介导的神经元损伤产生保护性作用。     

PTEN表达下调对神经元缺氧损伤的保护及其作用机制

目的 探讨PTEN对NR2B磷酸化的调节作用及其在阻断Ca2 内流和神经元保护中的作用.方法 建立神经元缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤模型,转染shRNAspten-GFP质粒,采用Fura 2-AM法测定胞内Ca2 浓度,用免疫沉淀法和Western blotting检测NR2B及磷酸化水平.结果 OGD后NR2B酪氨酸磷酸化水平和胞内Ca2 浓度显著升高,shRNAspten-GFP能成功转染到神经元中,并可显著下调其酪氨酸磷酸化水平(F=11.82,P＜0.05),胞内Ca2 浓度也显著低于损伤组和PshGFP阴性对照组(F=62.85,P＜0.05).结论 PTEN表达下调对缺氧诱导的NR2B酪氨酸磷酸化水平升高有拮抗作用,阻断Ca2 内流,从而达到神经元保护作用.     

甘氨酸对氧糖剥夺诱导大鼠神经元损伤的抗凋亡作用

目的 探讨甘氨酸对氧糖剥夺诱导神经元损伤的作用及机制。方法 采用体外培养的大鼠原代神经元建立氧糖剥夺模型,随机分为正常对照组、氧糖剥夺组和甘氨酸处理组,应用MTT、流式细胞术等方法检测甘氨酸对神经元活性、生存率、细胞凋亡的影响; 应用蛋白质印迹测定甘氨酸对凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Bad、Bax的影响。结果 甘氨酸能够提高大鼠原代神经元活力和存活率,减少细胞凋亡,并且能够增加抗凋亡因子Bcl-2,降低促凋亡因子Bax的表达(P<0.05或P<0.01)。结论 甘氨酸对氧糖剥夺神经元有明显的保护作用,该作用可能与促进抗凋亡因子、抑制促凋亡因子释放有关。     

缺血再灌注引起神经元凋亡及褪黑素抗凋亡的机制

目的 探讨模拟缺血再灌注引起神经元凋亡的途径和褪黑素(melatonin，MT)抗凋亡的作用机制。方法 用原代培养的SD乳鼠小脑颗粒细胞建立以缺氧缺糖模拟缺血再灌注模型，并加不同浓度的MT(10^-5、10^-7、10^-9mol／L)孵育。采用荧光比色法检测其线粒体跨膜电位及细胞内的活性氧；用Western blot及ELISA分别检测线粒体和胞质中的细胞色素C；比色法检测胞质中Caspase-3的活性。结果 在模拟缺血再灌注小脑颗粒细胞模型中，细胞内的活性氧在缺氧缺糖后明显增加；线粒体跨膜电位降低并随再灌注时间延长而加重；线粒体释放入胞质的细胞色素C增加，胞质的Caspase-3活性增加；MT可显著减少活性氧和抑制线粒体释放细胞色素C，抑制线粒体跨膜电位的降低，并呈一定剂量依赖性。结论 ①缺血再灌注引起的神经元凋亡部分是通过线粒体凋亡途径；②MT可通过抗氧化作用和阻止线粒体凋亡而抑制模拟缺血再灌注诱导的小脑颗粒细胞凋亡。