RNA干扰沉默IGF—IR表达对非细胞肺癌细胞生物学特性及化疗敏感性的影响

目的：评价RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术,对人肺癌A549细胞系中胰岛素样生长因子Ⅰ类受体（IGF—IR）表达的阻断效应,和IGF—IR基因沉默后细胞增殖、凋亡等生物学特性及肿瘤细胞对化疗药物敏感性的改变。方法：应用U6启动子,介导DNA模板转录生成短发夹样RNA（shRNA）,并转染人肺癌A549细胞株,从而产生IGF—IR特异性小干扰RNA（siRNA）,经RT—PCR和Western blot检测IGF—IR表达的改变;联合应用化疗药物顺铂（DDP）,通过MTT法和流式细胞技术等,观察细胞生长、细胞周期、细胞凋亡及DDP半数致死量（IC50）的变化。结果：IGF—IR表达水平明显下降（抑制率高达89．8％）,肿瘤细胞增殖能力明显减弱,细胞滞留于G0期的比例上升;DDP对肿瘤细胞24h、48h、72h的IC50均明显减少,IGF—IR siRNA1组DDP作用72h的IC50为0．92mg／L,明显低于control—siRNA组的3．77mg／L,0．5mg／L DDP联合IGF—IR siRNA1作用48h后,A549细胞的生长抑制率达32．1％,明显高于control—siRNA组的18．9％,细胞凋亡率从27．8％上升至44．2％。结论：运用RNAi技术能有效抑制A549细胞IGF—IR的表达,使细胞增殖能力减弱,化疗敏感性增加。     

RNA干扰抑制ERCC1对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响

目的 探讨利用RNA干扰技术沉默切除修复交叉互补基因组1(ERCC1)表达对非小细胞肺癌耐药细胞株顺铂化疗敏感性的影响.方法 设计并合成3段靶向人的ERCC1基因的小分子干扰RNA(siRNA),构建携带ERCC1-shRNA的重组质粒表达载体,采用脂质体Lipofectamine 2000转染入人肺癌细胞株A549/...     

微小RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响

目的:探讨微小RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响。方法:采用Aurora A特异性siRNA对人脑胶质瘤细胞进行转染,使用Western blot和RT-PCR对Aurora A mRNA及蛋白表达情况进行检测,同时使用化疗药物尼莫司汀(ACNU)对转染后人脑胶质瘤细胞进行处理,观察并分析处理前后胶质瘤细胞的增殖和凋亡情况。结果:40 mg/L ACNU处理后各组U251细胞吸光度较0mg/L ACNU处理后各组细胞器吸光度值明显下降(P<0.05),其中以siRNA干扰组细胞吸光度值最低(0.20±0.05),细胞增殖抑制率为75.1%,远高于阴性对照组和正常对照组(P<0.05);转染Aurora A siRNA的U251细胞在经40 mg/LACNU处理72h后,其细胞凋亡率明显高于0mg/L处理组(P<0.05),且siRNA干扰组的U251细胞在培养72h后其凋亡率均明显高于正常对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:采用特异性微小RNA对Aurora A基因的表达进行干扰抑制,可有效阻碍胶质瘤细胞的增殖过程,且可有效提高胶质瘤细胞对于化疗药物的敏感性,有利于增强恶性胶质瘤术后化疗效果,对于改善患者生存质量,延长其生存时间具有十分积极的意义。     

EGFR、pEGFR蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)和磷酸化表皮生长因子受体(pEGFR)蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和癌旁正常肺组织中的表达情况,探讨其临床意义.方法 采用免疫组化法检测140例NSCLC组织及癌旁正常肺组织中EGFR和pEGFR蛋白的表达.结果 EGFR和pEGFR蛋白在肺癌组织中的表达高于癌旁正常肺组织...     

Ezrin蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的:探讨Ezrin蛋白在肺非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及临床意义。方法:应用免疫组化S-P法,检测45例在非小细胞肺癌(NSCLC)、20例正常肺组织(NL)中Ezrin蛋白的表达。结果:Ezrin蛋白在鳞癌、腺癌、鳞腺癌、大细胞癌阳性率分别为63.64%(14/22),70.00%(7/10),71.43%(5/7),66.67%(4/6),Ezrin蛋白在非小细胞肺癌总的阳性率为66.67%(30/45),Ezrin蛋白在正常肺组织阳性表达率为100%(20/20),两组相比有显著性差异(P<0.05)。Ezrin蛋白在非小细胞肺癌主要表达于胞浆,在正常肺组织主要表达于胞膜,Ezrin蛋白的阳性表达与肺癌组织学类型、肿瘤分化程度、肺癌分期无关,而与有无淋巴结转移有关。结论:Ezrin蛋白在非小细胞肺癌表达下降且表达部位发生移位,可能与非小细胞肺癌发生发展及远处转移有关。     

低剂量胰岛素对非小细胞肺癌化疗的临床研究

目的:研究低剂量胰岛素对非小细胞肺癌化疗的增效减毒作用及对生存质量的影响。方法:将150例肺癌病人随机分为对照组、试验A组及试验B组各50例。三组均应用NP方案化疗,对照组只单纯进行化疗,在此基础上,试验A组于化疗前给予胰岛素0.4U/kg,试验B组于化疗前给予胰岛素0.3U/kg;观察并评价三组化疗不良反应、生存质量和生存率。结果:与对照组比较,试验A、B组治疗后不良反应发生率明显降低(P<0.01),生存质量明显提高(P<0.01),与试验A组比较,试验B组不良反应发生率明显降低(P<0.01),生存质量明显提高。三组治疗后1、2、3年的生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:对于非小细胞肺癌的治疗,化疗前使用低剂量胰岛素(0.3U/kg)可以降低不良反应发生率,提高患者生存质量和生存率。     

同步放化疗后巩固化疗治疗局部晚期非小细胞肺癌22例

目的:评价ⅢA、ⅢB期非小细胞肺癌(NSCLC)在同步放化疗后再给予巩固化疗的意义。方法:选取局部晚期NSCLC患者(ⅢA期和ⅢB期)采用同步放化疗后疗效达到CR、PR的患者进行随机两组:巩固化疗组:给予TC方案化疗4周期;对照组:给营养支持治疗。按WHO近期疗效及毒副标准评价治疗结果,用Ka-plan-Meier法计算生存率。结果:40例患者,巩固化疗组22例,对照组18例,巩固化疗组与对照组中位疾病无进展时间(TTP)分别为16.4个月比11.2个月(P=0.031),总体中位生存时间(OS)为21.8月比15.9月(P=0.044)。巩固化疗组毒副反应主要是骨髓抑制,能够耐受。患者1年KPS评分>60分者分别为77.2%(17/22)比83.3%(15/18)(P>0.05)。结论:巩固化疗对NSCLC同步放化疗后达到CR或PR的患者是有效且安全的治疗方案,能够改善无病生存时间。     

RNA干扰EGFR基因对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响

目的构建表皮生长因子受体（EGFR）基因的小干扰RNA（siRNA）质粒,转染人卵巢癌细胞株sk-ov3后检测RNA干扰（RNAi）对EGFR基因表达及细胞对化疗药物敏感性的影响。方法体外构建EGFR小发卡状RNA（shRNA）的表达质粒,脂质体法介导将其转染入skov3细胞。实验分为正常对照组、非特异性转染组和特异性转染组。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测EGFR mRNA的表达,使用免疫细胞化学法（ICC）检测EGFR蛋白的表达。使用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定EGFR shRNA转染skov3细胞后细胞对顺铂敏感性的改变。结果EGFR shRNA转染组细胞EGFR mRNA的表达与其他两组相比明显减弱（F=87.73,q=16.81、15.33,P〈0.01）,EGFR蛋白表达明显下调（F=69.29,q=14.71、13.57,P〈0.01）;顺铂敏感性比正常对照组提高了约3倍。结论靶向EGFR基因的序列特异性shRNA可有效抑制skov3细胞中EGFR基因的表达,增强skov3细胞对顺铂的敏感性。     

NPR-A在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的:探讨NPR-A在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及与非小细胞肺癌患者临床病理资料之间的关系。方法:应用免疫组化方法检测NPR-A在45例NSCLC患者组织中的表达情况,并分析NPR-A表达情况与NSCLC患者临床病理资料之间的关系。结果:NPR-A在NSCLC中主要表达于细胞浆和细胞膜,偶见细胞核表达;在45例NSCLC组织中,共有29例高表达,阳性率为64.4%。NPR-A的表达与NSCLC患者吸烟、病理分级、分期及淋巴结的转移相关(P<0.05),而与其他临床病理资料之间未见明显相关(P>0.05)。结论:NPR-A在NSCLC患者中的表达与患者吸烟、病理分级、分期及淋巴结转移相关,提示了其表达参与了NSCLC的发展、转移,在NSCLC发展过程中起促进或协同作用。     

A549细胞转染esp1基因后生物学行为的变化

目的:观察A549细胞转染esp1基因后细胞生物学行为的改变.方法:将IRE-EGFP-esp1质粒用FuGENE 6脂质体转染到肺腺癌细胞A549,经G418筛选获得转染阳性的细胞系(esp1-A549).采用DNA荧光染色流式细胞仪分析转染后细胞DNA含量、倍性及细胞周期,计算S期细胞比率(SPF)和DNA指数(DI);采用细胞表面磷脂酰丝氨酸检测法和闪烁计数法分别检测细胞凋亡和增殖情况,同时检测软琼脂集落形成能力.以未转染(A549)、转染空载体(neo-A549)的细胞作对照.结果:与其他2组比较,esp1-A549细胞的DI、SPF及细胞增殖率降低,细胞凋亡率升高.esp1-A549细胞软琼脂集落形成数为3.5±0.6,克隆形成率为12.5%,低于A549细胞的23.3±0.2(t=4.93,P=0.004)和46%.结论:esp1基因的上调表达对A549细胞部分恶性生物学表型具有一定的抑制作用.     

靶向存活素基因的RNAi联合X线照射对肺腺癌A549细胞凋亡的影响

目的:构建靶向存活素（survivin）基因的RNA干扰(RNAi）载体,观察其联合X射线照射对肺腺癌A549细胞凋亡的影响。方法:根据GenBank中survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建重组干扰质粒pGenesil2-survivin。酶切、测序鉴定正确后,干扰质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;实验设正常组、空载体组、pGenesil2-survivin组、5 Gy照射组和pGenesil2-survivin + 5 Gy照射组。流式细胞术与TUNEL检测细胞凋亡的变化,Western blotting检测survivin及caspase-3蛋白表达。结果：KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切,得到大小为389 bp和4 206 bp的两个片段,与预期结果一致;测序结果与寡核苷酸链经DNAssist2.0软件进行比对,二者完全一致,说明载体构建正确;质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡百分率增加（P< 0.05）,二者共同作用凋亡百分率增加更明显;Western blotting结果显示,pGenesil2-survivin组中survivin蛋白与β-actin蛋白灰度比值较正常组明显降低（P< 0.01）;而caspase-3蛋白与β-actin蛋白灰度比值较正常组明显增强,且pGenesil2-survivin+5 Gy照射组增加更明显（P< 0.01）。结论:靶向存活素基因的RNAi能够明显抑制survivin蛋白表达,增强caspase-3蛋白表达,促进凋亡;联合5 Gy X射线照射,增强促凋亡作用。     

靶向CysC基因shRNA慢病毒载体的构建对NSCLC A549细胞增殖的影响及机制初探

目的 构建半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)基因短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,探讨其对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖的影响及可能机制.方法 以CysC基因为靶点,设计并合成目标shRNA,构建CysC-shRNA慢病毒载体并进行鉴定、包装及浓缩;后转染A549细胞,并用qRT-PCR检测Cy-sC...     

RNAi抑制EGFR基因增强卵巢癌细胞对泰素敏感性的研究

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因在卵巢癌细胞对泰素敏感性的增强作用.方法 构建针对EGFR基因序列特异性shRNA的表达载体,用脂质体转染卵巢癌SKOV3细胞及G418筛选阳性克隆.采用RT-PCR、Western blot检测EGFR基因的抑制情况,用MTT法检测卵巢癌细胞对泰素的敏感性.结果 靶向EGFR的序列特异性shRNA可明显抑制EGFR基因的表达,EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为77.5%和76.1%;序列特异性shRNA-EGFR可明显提高卵巢癌细胞对泰素的敏感性,差异有统计学意义(P<0.01).结论 体外实验证实抑制EGFR基因的表达可提高卵巢癌细胞的化疗敏感性.     

PIK3R1对多发性骨髓瘤细胞侵袭转移的影响及其机制初探

目的:观察应用RNA干扰(RNAi)技术敲低PIK3R1表达后在体外对人类多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞侵袭的抑制作用。方法:将重组质粒表达载体pGenesil-1.1-PIK3R1转染至RPMI8226细胞。Realtime PCR和Western blot分别检测转染前后目的基因mRNA和蛋白的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞外基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的浓度变化。Transwell实验评价肿瘤细胞侵袭能力的变化。结果:pGenesil-1.1-PIK3R1可以有效抑制PIK3R1mRNA及蛋白的表达,MMP-2、MMP-9表达下调,基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-2表达上调,ELISA证实细胞外MM9-2、MMP-9浓度在治疗组明显减低。Tramwell穿过细胞数:对照组(115.5±3.9)和无义序列组(112.8±6.0),pGenesil-1.1-PIK3R1转染组(73.7±4.0)。结论:靶向PIK3RI的RNAi技术可以序列特异性地抑制PI3KR1表达,在体外明显抑制RPMI8226细胞的侵袭能力。     

细胞定位表达的新城疫病毒HN蛋白对肺癌A549细胞体外生物学作用的研究

目的 研究定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN蛋白体外对肺癌A549细胞抑制作用.方法 体外瞬时转染胞浆型、跨膜型、分泌型重组真核表达新城疫病毒HN蛋白质粒和空载体质粒,用MTT法和流式细胞仪检测对肺癌A549细胞抑制作用.结果 重组质粒经体外转染后,对肺癌A549细胞的生长抑制率表现为时间和空间上的差异.体外转染24 h后,转染跨膜型质粒组对肺癌A549的抑制率最高;体外转染48 h后,转染分泌型质粒组对肺癌A549的抑制率最高,有统计学差异(P<0.05).体外转染72 h后,各种重组质粒组间对肺癌A549的生长抑制无显著性差异(P>0.05).流式细胞仪检测经修饰后的重组质粒即跨膜型和分泌型均能提高早期凋亡(24 h)和总的凋亡(72 h)的比率.结论 重组修饰后的新城疫病毒HN蛋白即跨膜型和分泌型的同其自身定位表达于胞浆型相比,体外抗肿瘤作用提高.     

RNAi沉默HSP70基因对宫颈癌HeLa细胞的影响

目的:本研究初步探讨RNAi技术应用于宫颈癌基因治疗的特异性及其作用机理。方法:设计靶向HSP70基因siRNA序列,构建重组表达载体pTZU6+1-siRNA-HSP70,在脂质体介导下瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,在体外诱导RNAi沉默HSP70基因,同时设转染空载体pTZU6+1为阴性对照组和不加任何试剂的空白对照组。采用RT-PCR和Western blotting方法检测实验组和对照组中HSP70表达;MTT法检测细胞生长与增殖;流式细胞术检测细胞的凋亡率和细胞周期分布。结果:与对照组相比,实验组转染HeLa细胞后,细胞的HSP70 mRNA和蛋白表达均明显下调(P<0.01);细胞生长抑制率增高(P<0.05);细胞周期相分布发生变化。结论:siRNA明显抑制HSP70的表达及宫颈癌HeLa细胞的增殖,并引起细胞凋亡和细胞周期改变,为进一步研究HSP70基因在宫颈癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础。     

L-BSO对人肺腺癌细胞A549化疗增敏的体外研究

目的 研究L-BSO对人肺腺癌细胞A549体外化疗增敏的机制及效果。方法 采用酶循环法检测A549细胞内谷胱甘肽（GSH）含量，MTT比色法体外观察L-BSO对A549细胞化疗增敏作用，流式细胞仪检测细胞内Dau荧光强度变化。结果 L-BSO能有效抑制A549细胞内GSH合成，并能明显增加A549细胞对顺铂、阿霉素化疗敏感性，但不增加细胞内药物的聚集。结论 L-BSO是一种较好的化疗增敏剂。     

RNAi干扰食管癌EC9706细胞MTA1基因表达对侵袭和迁移的影响

目的 采用RNAi抑制食管癌EC9706细胞株MTA1基因的表达,观察对食管癌细胞侵袭和迁移的影响.方法 用脂质体包裹转染沉默MTA1表达的siRNA表达载体人食管癌细胞EC9706.定量RT-PCR和免疫印迹分别检测MTAl mRNA和蛋白表达情况;划痕损伤实验和细胞体外侵袭实验分别测定迁移和侵袭的影响.结果 定量RT-PCR检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低;转染沉默MTA1的siRNA表达载体组的食管癌细胞划痕未愈合,穿透Matrigel的细胞数量明显减少,与未转染组、转染空载体组和转染无关序列siRNA载体组比较差异有显著性(P<0.05).结论 RNA干扰介导的MTA1基因表达沉寂可有效降低食管癌细胞侵袭和迁移;MTA1基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点.