mRNA差异显示技术的应用与改进

目的：克隆和研究高低分化胆管癌间差异表达基因。方法：对ｍＲＮＡ差异显示ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）的一系列条件进行了探索和改进,建立了有效的ＤＤＲＴ－ＰＣＲ法。结果;在高,低分化胆管癌差异分化基因的研究方面获得了满意的结果,共获得９个有显著差异的ｃＤＮＡ片段,测序后进行同源序列比较,有一个与层粘连蛋白受体基因高度同源,还有一个可能是一个新基因的部分序列。结论：通过对传统方法的改进,大大提高了工作效率     

银染mRNA差异显示方法的建立和吗啡诱导基因的克隆

目的：建立非同位素银染ｍＲＮＡ差异显示方法，分离吗啡相关基因。方法：以吗啡处理的ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞中提取的总ＲＮＡ为模板，用５’ｄＴ１２ＭＧ锚定经物和两条随机引物合进行ＤＤＲＴ－ＰＣＴ扩增，经测序凝胶电泳分离后，用银染方法显示差异ＤＮＡ条带，在直视下从凝胶中回收差异条带并进行再扩增，扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体。结果建立了非同位素的银染ｍＲＮＡ差异显示方法，分离和克隆了一些吗啡诱导的差异表达基因     

银染mRNA差异显示方法的改进与优化

目的 对银染mRNA差异显示方法进行改进与优化,建立具有良好重复性和稳定性的银染mRNA差异显示新方法.方法 通过对银染mRNA差异显示方法中的PCR参数进行优化以及凝胶电泳和加样方式进行改进.结果 经改进与优化的银染mRNA差异显示方法具有良好的重复性、稳定性,差异条带清晰易辨.结论 经改进和优化的银染mRNA差异显示方法具有良好的重复性、稳定性,可以代替传统的放射性同位素方法,应用于基因差异表达的研究.     

银染mRNA差异显示法在糖尿病早期大鼠背根神经节差异基因筛选中的初步应用

目的：建立银染mRNA差异显示方法，并初步应用于筛选糖尿病早期大鼠背根神经节中差异表达基因。方法：制备糖尿病模型大鼠，以锚定引物与随机引物组合分别对正常与模型大鼠背根神经节的mRNA行DD-PCR扩增，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，银染法显示差异片段。结果：建立了银染mRNA差异显示方法．初步筛选出一些糖尿病早期大鼠背根神经节中差异表达的基因。结论：银染mRNA差异显示方法是简便快捷、行之有效的筛选差异基因的方法。     

小鼠胸腺增龄相关性基因的差异表达及其克隆

目的 小鼠胸腺增龄相关性基因差异表达研究及其克隆。方法 利用DDRT－PCR技术对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行分析,获得差异表达片段（ESTs)。进一步作Northern印迹分析并进行核苷酸测序。选取其中一个EST为探针,从小鼠胸腺cDNA文库中克隆基因。结果 对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行DDRT－PCR分析,发现小鼠胸腺基因存在增龄相关性的表达差异,某些基因在1或10月龄胸腺内有选择性表达,某些基因仅有表达量的变化。共获得108个差异表达的ESTs,其中31个呈Northern印迹阳性,全部测序。经同源性分析,有14个ESTs与已知基因有较高的同源性,17个ESTs为新的cDNA片段。选取其中1个在1月龄鼠胸腺水平表达的EST,从小鼠胸腺cDNA文库中克隆到1个与小鼠的LAF1转酮醇酶高度同源的1480bp片段。结论 小鼠胸腺内存在增龄性基因表达差异。据此差异所获得的胸腺差异表达基因可能参与胸腺衰老与萎缩过程。     

银染mRNA差异显示方法的建立和吗啡诱导基因的克隆

目的：建立非同位素银染ｍＲＮＡ差异显示方法，分离吗啡相关基因。方法：以吗啡处理的ＳＨＳＹ５Ｙ细胞中提取的总ＲＮＡ为模板，用５’ｄＴ１２ＭＧ锚定引物和两条随机引物组合进行ＤＤＲＴＰＣＲ扩增。经测序凝胶电泳分离后，用银染方法显示差异ＤＮＡ条带，在直视下从凝胶中回收差异条带并进行再扩增，扩增产物克隆入ｐＧＥＭＴ载体。结果：建立了非同位素的银染ｍＲＮＡ差异显示方法，分离和克隆了一些吗啡诱导的差异表达基因。结论：建立的非同位素银染差异显示方法是简单快捷和高效的分离差异表达基因的方法     

mRNA差异显示

差异基因的分离，对细胞生命过程中调节机制的研究以及致病机制的探讨极有价值。分离差异基因的方法多种多样，但根据所分差异基因性质的不同，可粗略分成两大类：①差异基因的分离，常用方法主要有消减杂交法〔１〕及其改进〔２，３〕，随机引物多态性ＤＮＡ聚合酶链反应...     

用mRNA差异显示法分离大鼠吗啡依赖相关基因

目的：分离并克隆大鼠吗啡信赖相关基因。方法：ＳＤ大鼠用递增剂量的吗啡作皮下注射,形成吗啡依赖的动物模型。分离鼠脑的中脑导水管周围灰质、伏核、纹状体等核团,提取总ＲＮＡ,用ｍＲＮＡ差异显示（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ,ＰＣＲ,ＤＤＰＣＲ）的方法,筛选吗啡依赖大鼠特异表达产物的ｃＤＮＡ片段。用３组锚定引物（Ｔ１２ＭＮ,Ｍ＝Ａ,Ｇ,Ｔ或Ｃ,Ｎ＝Ａ,Ｃ或Ｇ）和６组随机引物（ＡＰ１￣ＡＰ６）作     

银染mRNA差异显示法克隆肝癌相关基因

目的 建立银染mRNA差异显示方法,筛选并克隆肝癌相关基因,方法 以建系的人肝癌细胞HepG2和正常的肝细胞L02的总RNA为模板,用5′-dT11G锚定引物和8条随机引物（AP1-AP8）组合进行RT-PCR扩增,PCR产物经60g.L^-1尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,凝胶银盐染色显示差异的DNA片段。结果 建立了快速敏感的银染mRNA差异显示方法,分离并克隆了一些肝癌相关基因,结论 建立的银染mRNA差异显示法简单、有效,在差异表达基因的筛选中有较高的实用价值。     

mRNA差异显示筛选卵巢癌相关基因

目的：利用ｍＲＮＡ差异显示技术研究正常卵巢上皮和卵巢上皮癌之间的基因表达差异状况,筛选和克隆卵巢上皮癌相关基因。方法：通过ＤＤ－ＰＣＲ分析正常卵巢上皮和卵巢上皮癌总ＲＮＡ将差异片段分离并显示出来,将其回收,利用基因克隆技术将其筛选和克隆出来作为探针进行斑点杂交鉴定、ＤＮＡ序列测定、通过国际互联网络检索ＧｅｎＢａｎｋ进行同源性分析。结果：共筛选克隆鉴定６个差异显示片段。其中４个为未知基因片段,已收录     

半定量RT-PCR检测细胞因子表达的研究

目的：建立一种客观、敏感的检测IL-2／IL-4细胞因子基因表达变化的方法。方法：采用TRIzol试剂提取免疫排斥／免疫耐受大鼠脾脏组织总RNA，分光光度计法定量。取2μg总RNA．采用RT—PCR法逆转录-扩增IL-2、IL-4和内参照β-actin cDNA。扩增产物经电泳分离后。用凝胶图像分析仪照相和扫描分析，检测其相对表达量。结果；RT—PCR产物经电泳后。β-actin、IL-2和IL-4分别在226bp、342bp和332bp处出现明显条带，与预定条带大小相一致；免疫耐受组IL-4与免疫排斥组IL-2的表达有明显差异．在免疫耐受组中IL-4表达增高，而在免疫排斥组中IL-2表达增高，内参照β-actin扩增条带亮度在两组中相同，PCR产物量与扩增初始模板量之间存在良好的对应关系。结论：半定量RT—PCR检测是-种从少量细胞中快速、简便、可靠地检测特异基因mRNA表达的方法。     

脑脊液肠道病毒RT-PCR检测对病毒性脑炎患者的临床意义

的了解脑脊液肠道病毒（EV）逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）检测对病毒性脑炎患者的临床诊断和治疗意义。方法回顾分析2000～2003年进行了脑脊液EVRT—PCR检测的43例患者的临床特征，包括临床症状、体征、脑脊液生化常规及其他病毒病原体检查、头颅影像学和脑电图检查，并进行统计学分析。结果脑脊液EVRT—PCR阳性者18例，占41．9％，男性较多，多发病于7～9月。脑脊液EVRT-PCR阳性者的临床症状与阴性者无明显差异，但脑脊液蛋白和细胞数较高，可同时合并血中其他病毒（单纯疱疹病毒、巨细胞病毒）抗体阳性。结论肠道病毒引起的病毒性脑炎发病率高，并可合并其他病毒感染，EVRT-PCR检查结果可指导临床诊断和针对性用药。     

实时荧光定量RT-PCR检测结肠癌中Musashi-1 mRNA的表达

目的:了解正常结肠干/祖细胞标志Musashi-1mRNA在结肠癌中的表达情况.方法:应用实时荧光相对定量RT-PCR的方法检测25例结肠癌组织和18例远端正常结肠组织中Musashi-1mRNA的表达,用2-△△CT的方法计算相对于远端正常组织结肠癌组织中Musashi-1mRNA的表达倍数.结果:经实时荧光定量RT-PCR法检测,结肠癌组织中Musashi-1mRNA的表达与远端正常结肠组织相比有差异(P＜0.01),且是远端正常结肠组织的4.24倍(1.95～9.23).低分化组织与高、中分化组织相比,Musashi-1mRNA的表达有差异(分别为P＜0.001、P＜0.005).低分化组织中Musashi-1的表达是高分化组织的5.54倍(3.07～9.98).结论:正常肠干/祖细胞标志物Musashi-1在结肠癌组织中尤其是低分化组织中的高表达提示Musashi-1可能在结肠肿瘤的发生发展中起着一定的作用.     

mRNA差异显示技术筛选何首乌中二苯乙烯苷合成相关基因

【目的】筛选和克隆何首乌中二苯乙烯苷代谢相关酶基因。【方法】采用mRNA差异显示技术,对何首乌中二苯乙烯苷含量差异悬殊的不同组织(根、茎、叶)进行差异表达基因的筛选,将得到的差异基因连接pMD19-T载体进行测序后,通过数据库比对预测其基因功能。【结果】发现差异片段51条,选取其中9条进行半定量PCR验证,获得3条阳性差异片段。其中1条阳性片段为何首乌茎和叶特异表达,与甘氨酸脱氢酶高度同源,另外2条阳性片段为何首乌块根特异表达,分别与烯酰辅酶A水合酶、氨基肽酶N高度同源。【结论】通过mRNA差异显示技术得到的3个同源序列可为进一步研究何首乌中二苯乙烯苷生物合成途径提供帮助。     

COX-2基因在人脑星形细胞肿瘤组织中表达及其与Fas基因表达的相关性

目的：探讨COX-2 mRNA在星形细胞肿瘤组织中的表达及与Fas mRNA表达的相关性。方法： 应用RT-PCR技术检测不同级别星形细胞肿瘤组织及非肿瘤组织中COX-2 mRNA和Fas mRNA的表达水平。结果：COX-2 mRNA表达阳性率分别为：非肿瘤组织33.3%,肿瘤组织78.4%;Fas mRNA阳性表达率分别为：非肿瘤组织8.3%,肿瘤组织74.5%;二者在肿瘤组织中的表达显著高于其在非肿瘤组织中的表达（P<0.05）,且有良好的相关性（r=0.525,P=0.008）。结论：COX-2 mRNA表达与星形细胞肿瘤的发生、发展有关,是评估星形细胞肿瘤恶性生物学行为的可靠指标;COX-2 mRNA表达与Fas mRNA密切相关,两者可能存在共同的激活机制,构成抑制肿瘤细胞凋亡的多种途径。     

RT-PCR半定量法检测人脐静脉内皮细胞t-PA和PAI-1 mRNA表达

目的 建立一种敏感的检测组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）及其抑制剂（ＰＡＩ－１）基因表达的方法。方法 用异硫氰酶胍一步法提取细胞总ＲＮＡ。用单管ＲＴ＿ＰＣＲ法逆转录－扩增ｔ－ＰＡ、ＰＡＩ－１和内参照三磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ，扩增产物经电泳分离后，用凝胶图像分析仪照相和扫描分析，测定各条带分子量和光密度值。结果 ＰＣＲ产物均与预期长度相吻合，且ＰＣＲ产一与扩增初始模板量之间存在良好的     

Real-time PCR与RT-PCR检测儿童人偏肺病毒

目的：比较荧光定量PCR（ real-time PCR）与普通反转录酶-聚合酶链锁反应（ RT-PCR）对人偏肺病毒（ hMPV）的检测价值。方法：Real-time PCR和RT-PCR同时对500例急性下呼吸道感染（ ALRTI）患儿鼻咽部分泌物进行hMPV检测,分析两种方法的特异性和灵敏性。结果：Real-time PCR和RT-PCR的检出率分别为16％及9.8％,RT-PCR与Real-time PCR比较,灵敏度为31.3％（25/80）,特异度为94.3％（396/420）。结论：Real-time PCR检测hMPV敏感性高于RT-PCR,是临床检测儿童鼻咽部分泌物hMPV感染的有效的方法。     

GENE DIAGNOSIS OF HEMOGLOBINOPATHY IN CHINESE BY AMPLIFIED DNA

This paper describes the application of DNA amplification in vitro with the polymerase chain reaction on the prenatal diagnosis of thalassemia syndromes and on detection of HbS and HbD Punjab genes. DNA polymerase chain reaction was performed on lysed amniotic fluid cells or chorionic villus samples without prior DNA extraction and on DNA sampling from dried blood spots on filter paper blotters, α-thalassemia was prenatally diagnosed by direct analysis of amplified fetal target sequences on gel electrophoresis; and β-thalassemia was predicted by Hgi AI RFLP linkage analysis with amplified β-globin DNA. HbS and HbD Punjab genes were identified by Mst Ⅱor Eco RI mapping of the amplified β-globin DNA directly on the electrophoretic gels. The analysis of the amplified DNA does not require radioactive DNA probes and Southern hybridization. The total procedure can be completed within five hours.