体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向内耳毛细胞样细胞分化的研究

目的 探讨体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向耳蜗毛细胞样细胞分化的可行性.方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并加以鉴定.分离出生1～3 d的乳鼠耳蜗Corti器,与骨髓间充质干细胞在体外共培养14 d.通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学染色对分化细胞的特异性分子指标(myosinⅦa、math1及calretinin)进行鉴定.结果 免疫细胞化学染色显示诱导分化后的细胞myosinⅦa、math1和calretinin表达阳性,RT-PCR提示分化后的细胞可表达毛细胞的标志物myosinⅦa和math1.结论 体外培养的骨髓间充质干细胞可诱导分化为具有毛细胞分子标志物的毛细胞样细胞.     

体外诱导人脐带间充质干细胞向内耳毛细胞样细胞分化的研究

目的 探讨并建立一种体外定向诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells ,hUC-MSCs)向内耳毛细胞样细胞分化的方法.方法 采用组织贴壁法培养获得hUC-MSCs,流式细胞仪鉴定其表面标记物;神经干细胞诱导阶段分为对照组(DFNB基础诱导培养基)、实验1组(DFNB基础诱导培养基+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF)、实验2组(DFNB基础诱导培养基+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF+琼脂糖包被),培养3~5天后采用免疫荧光法检测各组标记蛋白Nestin的表达;内耳毛细胞样细胞诱导分化阶段,分为对照组(DFNB基础诱导培养基+明胶包被)、诱导组[DFNB基础诱导培养基+20 ng/ml EGF+1 μM全反式维甲酸/全反式维生素A酸(all trans retinoic aid,ATRA)],培养4周后采用qRT-PCR和免疫荧光法检测各组毛细胞标记物Math1、MyosinⅦa、Brn3c的表达.结果 在神经干细胞诱导阶段,对照组、实验1组均无神经球结构,实验2组中hUC-MSCs分化3 d后细胞有明显神经球样结构,且Nestin阳性细胞数更高(P<0.05);而向内耳毛细胞样诱导分化4周后,诱导组毛细胞标记物Math1、MyosinⅦa、Brn3c的mRNA和阳性细胞数的表达水平明显升高(P<0.05).结论 体外诱导人脐带间充质干细胞先向神经干细胞方向分化再向内耳毛细胞分化方向诱导,可有效提高毛细胞标记物MyosinⅦa、Brn3c、Math1的表达水平,促进hUC-MSCs向类毛细胞样细胞分化,可能为将来感音神经性聋的内耳移植治疗提供更为适合的种子细胞.     

干细胞向耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞诱导分化研究

随着干细胞研究的深入,世界各国科学家已证明多种干细胞可向耳蜗毛细胞及螺旋神经节诱导分化,采用的方法也不尽相同.本文从细胞种类及诱导方法两方面就干细胞向耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞诱导分化的研究做一综述.     

兔骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨组织的实验研究

目的：探索兔骨髓间充质干细胞向软骨组织转化的条件,为组织工程寻找新的工程化软骨。方法：用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化骨髓问充质干细胞．并传代扩增后．用离心三维培养法在成软骨诱导剂下进行诱导培养,并分别在诱导培养第7、14、21天取出标本并进行组织切片,对标本行免疫组织化学、原位杂交柃测。结果：骨髓间充质干细胞经7、1l、21d的离心三维诱导培养后．培养管出现软骨外观组织块,纠织学切片可见软骨陷窝,进行Ⅱ型胶原的免疫组织化学、原位杂交检测均为阳性。结论：兔骨髓间充质干细胞在软骨诱导剂和离心管培养条件下可成功生成软骨组织。     

iPSCs定向分化的内耳毛细胞与支持细胞间相互作用的研究

目的利用诱导多能性干细胞定向分化的内耳毛细胞和支持细胞探究这两种体外诱导分化细胞之间的相互作用。方法首先,利用细胞单层贴壁两步诱导法将三株i PS细胞(野生株、MYO7A缺陷株、MYO7A校正株)向内耳祖细胞及内耳毛细胞诱导分化,探究i PSCs定向分化内耳毛细胞的过程中是否有支持细胞的产生;其次,通过细胞免疫化学的方法探究体外分化的内耳毛细胞和支持细胞间的相互作用;最后,将表达绿色荧光蛋白(EGFP)的上皮样内耳祖细胞以圆窗膜穿刺的方法移植到白化荣昌猪的内耳中观察分析移植细胞在体内的迁移、分化以及在体内形成的联系。结果三株i PS细胞诱导分化为内耳毛细胞的过程中均有一部分细胞分化为支持细胞;对分化细胞进行E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的免疫荧光检测结果显示,E-cadherin、N-cadherin和ZO-1在支持细胞-支持细胞连接和支持细胞-毛细胞连接间都有表达;移植4周后,耳蜗免疫组织化学结果显示,三株不同来源的移植细胞均有少量细胞成功迁移到了毛细胞受损部位—柯底氏器,并表达毛细胞标志性蛋白MYO7A。移植细胞之间以及移植细胞与宿主细胞之间有E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的表达。结论 i PSCs诱导分化的内耳毛细胞和支持细胞在体内、外均能形成钙粘连接和紧密连接。这些研究结果对毛细胞取代法治疗耳聋策略的完善与发展有一定的科学意义。     

干细胞诱导分化成毛细胞研究进展

以往认为毛细胞损伤、老化不能再生,但随着研究的深入发现鱼、两栖动物、鸟类毛细胞在受损后能够再生,并观察到在实验室中哺乳动物毛细胞同样也能够再生.从此人们开始设想将干细胞培育成毛细胞,再植入受损动物的耳内,并成为治疗耳聋的最有希望的方法之一.本文就近年干细胞诱导分化成毛细胞的研究进展做一综述.     

经鼓阶胚胎干细胞内耳导入的初步观察

目的观察未经体外诱导的胚胎十细胞（embyonic stem cells,ESC）导入听力正常大鼠内耳的可行性以及导入后的存活和分布情况,为ESC内耳移植治疗由毛细胞缺失导致的感音神经性耳聋提供实验基础和理论依据。方法5—6周龄Wistar大鼠,10只,右耳为实验耳：经鼓阶打孔法植入带有绿色荧光蛋白（EGFP）的ESCs;左耳为对照组,不实施手术。术前1周与术后即刻行听性脑干反应（ABR）检查,取双侧耳蜗做冰冻切片,观察ESCs植入内耳后存活和分布情况。结果术后动物存活8只,麻醉效果好无干扰完整测完ABR动物5只。鼓阶打孔途径导入耳蜗的ESCs大部分于鼓阶聚集悬浮,少数可在鼓阶基底膜嵴和鼓阶外侧壁处贴壁;未在柯替器等中阶部位巾发现有ESCs的分布。ABR检测结果显示鼓阶打孔途径导入方法对大鼠听力影响较小。结论胚胎干细胞可经耳蜗底转鼓阶打孔途径导入耳蜗。干细胞在内耳成功存活,并且对内耳损伤小,因此。它可以作为内耳细胞移植的重要方式。     

干细胞诱导分化成毛细胞研究进展

以往认为毛细胞损伤、老化不能再生,但随着研究的深入发现鱼、两栖动物、鸟类毛细胞在受损后能够再生,并观察到在实验室中哺乳动物毛细胞同样也能够再生.从此人们开始设想将干细胞培育成毛细胞,再植入受损动物的耳内,并成为治疗耳聋的最有希望的方法之一.本文就近年干细胞诱导分化成毛细胞的研究进展做一综述.     

胚胎干细胞向内耳细胞诱导分化的研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)可在体外无限增殖,且保持其未分化状态,但在特定环境下可以被诱导分化为各种组织细胞.     

新生豚鼠海马神经干细胞分化为类毛细胞的体外实验

目的体外定向诱导新生豚鼠海马神经干细胞分化为内耳毛细胞。方法将原代培养的新生豚鼠海马来源的神经干细胞进行体外培养,分别置入含有10%胎牛血清和5%～15%人工外淋巴液培养基使其分化,并用免疫荧光化学,蛋白免疫印迹扫描电镜对分化的细胞进行鉴定。结果胎牛血清和人工外淋巴液均能诱导新生豚鼠海马神经干细胞分化为表达毛细胞特异抗体的细胞。结论神经干细胞在胎牛血清和人工外淋巴液中可以存活并分化出表达毛细胞特异抗体的细胞,为神经干细胞移植内耳治疗提供理论依据。     

Gene expression changes during step-wise differentiation of embryonic stem cells along the inner ear hair cell pathway

Conclusion. Our study outlines an alternative approach for the selection and investigation of genes involved in inner ear function. Objective. To gain understanding of the gene pathways involved in the development of the normal cochlea. Materials and methods. Microarray technology currently offers the most efficient approach to investigate gene expression and identify pathways involved in cell differentiation. Epidermal growth factor (EGF) induces cultures derived from the organ of Corti to proliferate and produce new hair cells. Since pluripotent embryonic stem (ES) cells have the capacity to generate all tissues, we induced murine ES cells to differentiate towards ectodermal and neuroectodermal cell types and from there investigated their commitment towards the hair cell lineage in the presence of EGF. Cells were collected at three points along the differentiation pathway and their expression profiles were determined using the Soares NMIE mouse inner ear cDNA library printed in microarray format. Results. Three genes up-regulated after addition of EGF (serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade H, member 1 (Serpinh1), solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 10 (Slc2a10) and secreted acidic cysteine-rich glycoprotein (Sparc)) were selected for further analysis and characterization. Of the three genes, Serpinh1 and Slc2a10 have never been implicated in the hearing process.     

喉黏膜间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的 探讨喉部黏膜同有层中是否存在间充质干细胞(mesenchymal stem ceHs,MSC),并对其进行分离培养及鉴定.方法 从喉部手术患者切下的组织中获取正常喉黏膜,消化培养法获得固有层来源的细胞,绘制细胞牛长曲线观察其增殖情况,采用平板克隆形成实验获得多个不同形态的细胞克隆并计算其克隆形成能力.利用流式细胞仪对培养的第4代细胞进行表面标志物的分析;采用成脂、成骨、成神经诱导液对其进行多项分化能力的研究.结果 经上述方法获得的喉黏膜MSC具有较快的增殖能力和较高的克隆形成能力(克隆形成率为7.1%);高表达间充质的表面标志物CD29(16.9%)、CD44(97.4%)、CD90(89.5%)、CD105(85.9%)、CD146(2.5%)、stro-1(20.4%),不表达造血系的表面标志物CD34(1.2%)、CD45(0.8%).在体外分别经成脂、成骨和成神经诱导分化后,油红O染色阳性,茜素红染色阳性,神经细胞特异性抗原S100呈阳性表达,提示喉黏膜MSC可向脂肪、骨骼和神经细胞分化.结论 喉黏膜固有层中可分离得到具有快速增殖能力及多向分化潜能的MSC.

Abstract：

Objective To investigate the presence of mesenchymal stem cells ( MSC) in laryngeal mucosa, and to seek for the method to isolate, cultivate and identify these cells. Methods Normal laryngeal mucosa was obtained from patients with laryngeal carcinoma during surgery, and the generating mesenchymal cells was obtained by digestive method. The cell growth curve was evaluated by 3-(4. 5-methylthiozol-2yl)-2. 5-diphenyltetrazolium bromide ( MTT) assay. Colony forming cell assay was used to screen different morphologic colonies and evaluate clone formation ability. Flow cytometry was performed for the expression of the cells of the 4th passage surface marker profiles. Multiple differentiation potentials were confirmed by adipogenic, osteogenic and neural lineages induction. Results MTT assay and colony forming cell assay showed that laryngeal mucosa MSC had a relatively rapid proliferation capacity and a relatively high clone formation capacity ( clone formation rate 7. 1 % ). Flow cytometry analysis revealed that the laryngeal mucosa MSC were positive for CD29 (16. 9% ), CD44 (97.4% ), CD90 ( 89. 5% ), CD105 ( 85. 9% ), CD146 (2. 5% ) and stro-1 ( 20.4% ), but negative for CD34 (1.2%) and CD45 (0. 8% ). Laryngeal mucosa MSC undergone adipogenic, osteogenic and neural lineages induction were positive for oil red staining, alizarin red staining and S100 staining respectively, which suggested that laryngeal mucosa MSC could differentiate into adipogenic, osteogenic and neural lineages. Conclusion This study demonstrated that MSC with rapid proliferative capacity and multiple differentiation potential could be obtained from lamina propria of laryngeal mucosa.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与初步鉴定

目的探讨体外分离、传代培养大鼠骨髓问充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的方法,并对培养细胞进行初步鉴定,为利用大鼠骨髓MSCs进行感音神经性聋细胞移植治疗的研究奠定基础。方法用贴壁培养法分离大鼠骨髓细胞,第1组于24小时全量换液,第2组于24小时半量换液,第3组于3天全量换液,传代扩增。相差显微镜进行形态学观察;RT—PCR检测培养细胞表面分子表达;定向诱导培养细胞向成脂细胞、成骨细胞方向分化。结果24小时首次全量换液组培养7天后观察见少量细胞集落,细胞形态不规则;24小时首次半量换液组培养7天后观察见较多细胞集落,细胞规则,呈梭形、椭圆形;3天首次全量换液组培养7天后观察见较多悬浮细胞．与贴壁细胞混杂在一起。培养细胞表面分子SH2、CD31、CD44呈阳性表达,但不表达CD34。第2组培养细胞传代后加入不同诱导剂定向诱导分化一定阶段,分别经油红O及VOFIKossa法染色鉴定证实MSCs可分别向脂肪细胞及成骨方向分化。结论本实验分离培养的大鼠骨髓原代细胞24小时首次半量换液培养利于大鼠骨髓MSCs的分离和纯化,可稳定表达SH2、CD31、CD44。MSCs具有多项分化潜能。     

鸡内耳基底乳头毛细胞的透射电镜观察

了解鸡内耳基底乳头毛细胞的超微结构对其电生理及其毛细胞再生的研究有重要意义。为此应用透射电镜对成年鸡内耳基底乳头毛细胞的超微结构进行观察，依据毛细胞的形态、表皮板的大小及其神经分布的特点，可将毛细胞分为：高毛细胞、过渡型毛细胞和矮毛细胞。从基底乳头的上缘到其下缘，每个毛细胞的静纤毛呈楼梯状增高排列。该文并对毛细胞的表皮板及纤毛在耳蜗生理中的作用进行了初步的探讨。     

内毛细胞的分离和形态学特点

目的　探讨内毛细胞 (innerhaircells ,IHC)的分离技术和形态学特征。方法　从豚鼠耳蜗制备基底膜活体铺片 ,微分干涉倒置显微镜下用显微分离结合酶消化的方法单离IHC。高倍显微镜下 ,用两个钨丝电极沿IHC和第一排外毛细胞 (outerhaircells,OHC)之间的Corti隧道显微切割 ,游离的IHC团被吸引至玻璃微吸管内。结果　从每只豚鼠耳蜗可分离到 3 0～ 5 0个活性良好的单离IHC ,并存活 2h左右。典型的IHC胞体具有特征性 ,呈梨状或长颈的烧瓶形状 ,胞体中间可见大的圆形细胞核。胞体内包含较多细胞器 ,颗粒状 ,粗糙感。大部分可观察到静纤毛 ( 93 / 98)。静纤毛分布沿表皮板一侧 ,排列呈线状或“C”形。部分细胞可观察到明显狭窄的颈部 ( 61/ 98)。IHC的表皮板一般为倾斜状 ,凹面向上 ,较厚。另外 ,IHC的表皮板通常与细胞胞体长轴成锐角或钝角。豚鼠耳蜗IHC长度为 13～ 3 1μm ,平均 ( 2 2 45± 4 14) μm ( x±s,n =98,下同 ) ;直径为 7～ 15 μm ,平均 ( 11 95±1 5 9) μm。静纤毛长度为 2～ 7 5 μm ,平均 ( 5 2 1± 1 0 0 ) μm。 结论　本研究成功建立一种能够分离到大量的、生物活性好的IHC的技术 ;内、外毛细胞单离后在形态学上的鉴别要点是表皮板 ,尤其是表皮板与细胞胞体长轴的成角特征     

脂肪来源的间充质干细胞治疗变应性鼻炎的研究进展

变应性鼻炎(AR)是机体经变应原诱发产生的常见良性变态反应性疾病。除了与过敏相关的鼻部和眼部症状外,还会导致睡眠质量下降,白天生活质量降低等问题,影响患者的工作和生活。目前AR的治疗方法是以远离变应原及药物控制为主,且在疗效上有其局限性和弊端。干细胞疗法的应用在各疾病的治疗中正在得到极大地发展。脂肪来源的间充质干细胞(MSCs)因其独特的免疫调节及抗炎等作用以及获取方便等优势,在AR的治疗上具有相当的潜力。本文就脂肪来源MSCs治疗AR的实验研究进展作一综述。     

自体脂肪间充质干细胞移植促进声带修复再生的实验研究

目的 探讨自体脂肪间充质干细胞移植入损伤声带后的生长分布及对声带固有层及其主要细胞外基质变化的影响特点.方法 对34只实验用兔(68侧声带)的53侧声带进行全麻支撑喉镜下声带锐性损伤.分离培养、鉴定及定向诱导20只实验用兔脂肪间充质干细胞.将自体脂肪间充质干细胞植入20侧损伤声带后,示踪观察脂肪间充质干细胞在声带固有层内的生长分布;同时以单纯支架(胶原或透明质酸凝胶)植入18侧受损声带(胶原10侧,透明质酸8侧)及单纯损伤15侧声带作为对照组.术后15 d～12个月时采用HE染色、Masson染色、Alcian Blue染色及免疫组化染色观察声带形态学变化及声带固有层胶原、透明质酸、纤维连接蛋白的含量及分布变化.结果 脂肪间充质干细胞呈梭形贴壁生长,具有多向分化潜能,植入损伤兔声带后持续分布于声带固有层.损伤声带在脂肪间充质于细胞植入6个月时形态接近正常,12个月时部分组织学结构类似正常;声带细胞外基质中的胶原于植入3个月内含量有增高趋势,无序分布于固有层,后逐渐减少至正常水平附近,12个月时部分分布略显不规则;透明质酸于植入40 d含量亦有增高趋势,分布于固有层各层,6个月含量减至正常水平附近,局限于固有层浅中层;纤维连接蛋白于植入后始终在固有层内散在分布,含量在40 d内有增高趋势,后逐渐减少,12个月时含量接近正常.单纯声带损伤3个月后局部开始出现瘢痕挛缩,以胶原纤维为主的大量纤维组织增生,12个月时仍紊乱分布于声带固有层各层.单纯支架植入组变化介于二者之间.结论 脂肪间充质干细胞植入兔损伤声带后具有促进声带细胞外基质分泌、合理分布及部分有序化排列的功能,具有促进声带修复再生的作用.