脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜Müller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因对体外培养的鼠视网膜Müller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜Müller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染Müller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对Müller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜Müller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染Müller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为（9.7±1.9）%、（18.1±16）%、（17.2±2.5）%、（16.9±1.7）%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为（98.2±5.6）%、（96.1±6.2）%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导Müller细胞的转染,为进一步明确Müller细胞的病理、生理功能及靶向Müller细胞的基因治疗提供了新的手段。     

胶质纤维酸性蛋白在青光眼大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达

目的:探讨胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在青光眼大鼠视网膜Müler细胞上的诱导表达情况及可能的意义。方法:采用烧灼涡静脉的方法制作大鼠青光眼模型,分别于术后2h;1,3d;1,2,3wk取材,制作视网膜矢状位冰冻切片和视网膜铺片,进行GS/GFAP免疫荧光双标。提取视网膜总蛋白行GFAP免疫印迹半定量分析。结果:视网膜矢状位切片可见,正常大鼠视网膜中,GFAP阳性染色只出现在神经节细胞层的星形胶质细胞上,而Müller细胞不表达GFAP。制作青光眼模型术后2h,Müller细胞上出现GFAP阳性染色,术后1,3d,GFAP的表达显著增加,到术后1wk,GFAP在Müller细胞上的表达量达到高峰,一直持续到术后3wk,免疫印迹半定量分析与以上结果吻合。术后1wk视网膜铺片中清晰可见Müller细胞足板出现GFAP的诱导表达。结论:高眼压时GFAP在Müller细胞上的诱导表达尤其在足板处的强烈表达是Müller细胞对眼压升高产生的一种反应,GFAP可能是一种潜在的有用的生物标记物。     

牛磺酸对低氧诱导的大鼠视网膜Müller细胞细胞骨架蛋白的影响

目的观察牛磺酸对低氧培养的视网膜Mller细胞特征性骨架蛋白的影响。方法体外纯化培养并鉴定大鼠视网膜Mller细胞,流式细胞技术检测低氧培养时牛磺酸干预对细胞周期的影响,免疫荧光法观察细胞中的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白和S-100的变化。结果低氧降低Mller细胞24h活性,牛磺酸促进阻滞于G0/G1期的细胞进入S期和G2/M期。低氧引起Mller细胞GFAP和波形蛋白表达增强,S-100表达核质比降低。0.1、1、10mmol/L的牛磺酸预处理减弱低氧引起的GFAP和波形蛋白的过表达。S-100表达核质比在牛磺酸处理后趋于正常。结论低氧导致的Mller细胞特征性蛋白表达变化可被牛磺酸减轻或阻止。     

牛磺酸对低氧诱导的大鼠视网膜Müller细胞细胞骨架蛋白的影响

目的观察牛磺酸对低氧培养的视网膜Mller细胞特征性骨架蛋白的影响。方法体外纯化培养并鉴定大鼠视网膜Mller细胞,流式细胞技术检测低氧培养时牛磺酸干预对细胞周期的影响,免疫荧光法观察细胞中的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白和S-100的变化。结果低氧降低Mller细胞24h活性,牛磺酸促进阻滞于G0/G1期的细胞进入S期和G2/M期。低氧引起Mller细胞GFAP和波形蛋白表达增强,S-100表达核质比降低。0.1、1、10mmol/L的牛磺酸预处理减弱低氧引起的GFAP和波形蛋白的过表达。S-100表达核质比在牛磺酸处理后趋于正常。结论低氧导致的Mller细胞特征性蛋白表达变化可被牛磺酸减轻或阻止。     

高浓度葡萄糖对体外培养大鼠Müller细胞P2Y2受体的影响

目的:观察高浓度葡萄糖对体外培养的大鼠视网膜Müler细胞P2Y2受体表达的影响。方法:用改进的酶消化法纯化培养并用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酰胺合成酶(GS)鉴定大鼠Müller细胞。分别在对照组(5.5mmol/L)与高糖组(10,25,50mmol/L)中孵育24h和72h,通过免疫荧光及荧光强度半定量分析检测Müller细胞中P2Y2受体表达的变化。结果:纯化培养到第3~4代的Müller细胞,经鉴定纯度大于90%,表达GFAP和GS。在24h,10,25,50mmol/L组的荧光强度分别为31.05±7.06,59.17±11.42和84.11±12.72,与对照组(26.60±5.15)相比较均明显增高(P<0.01)。而在72h,仅25和50mmol/L组的荧光强度明显强于对照组(P<0.01)。结论:高浓度葡萄糖上调大鼠视网膜Müller细胞P2Y2受体的表达,提示这一受体可能参与糖尿病视网膜病变过程。     

体外诱导猪Müller细胞定向分化为光感受器细胞的研究

背景 大鼠、小鼠Müller细胞在体外能诱导分化为表达视网膜光感受器细胞特异标记的细胞,但目前有关成年猪Müller细胞分化为视网膜光感受器细胞的研究鲜有报道.目的 研究成年猪Müller细胞于体外定向诱导后分化成视网膜第一级传导神经元光感受器细胞.方法 消化成年猪眼视网膜组织,分离Müller细胞行体外继代单层贴壁培养.使用定向分化培养基对P2、P3和P4代Müller单层贴壁细胞及先形成细胞球悬浮培养2—3d,然后再对贴壁细胞进行诱导分化,最后结合细胞形态和免疫荧光染色结果鉴定Müller细胞以及诱导分化效果.结果 免疫荧光染色结果显示,P2,P3和P4 Müller细胞均能表达Müller细胞特异蛋白分子标记,即谷氨酸合成酶(GS),P3 Müller细胞还同时表达另一种Müller细胞特异蛋白分子标记,神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP).免疫荧光染色分析并计算视网膜光感受器细胞特异标记视紫质Rhodopsin阳性率,P2 Müller单层贴壁分化细胞为(27.99±6.53)％,P2悬浮细胞球分化为(16.54±3.40)％.P2悬浮细胞球诱导分化后形态更趋向神经元,而P2代Müller单层贴壁细胞分化后形态仍趋向于成纤维细胞.随着培养代数的增加,细胞球定向分化Rhodopsin阳性表达程度逐渐减弱,P2、P3和P4 Rhodopsin阳性率分别为(56.23±7.32)％、(35.26±8.55)％和(12.68±3.18)％,差异无统计学意义(F=2.618,P=0.099).同代细胞随着诱导时间的延长,Rhodopsin阳性表达有所减弱,差异无统计学意义(P=0.099),但分化细胞形态更为细长.结论 成年猪Müller细胞离体培养后可定向分化为表达视网膜光感受器样细胞特异标记的细胞.细胞球悬浮培养2～3d,以及延长诱导分化时间都能使得分化细胞形态更为细长.     

脑源性神经营养因子对鼠视网膜Müller细胞GLAST蛋白表达及功能的调控

目的 研究脑源性神经营养因子（BDNF）对鼠视网膜Müller细胞L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体（GLAST）蛋白表达及功能的调控作用.方法 实验研究.取出生3～7 d的新生昆明小鼠视网膜组织进行Müller细胞培养,取传代后第3代Müller细胞进行后续试验.实验分为BDNF干预组和空白对照组：BDNF干预组小鼠视网膜Müller细胞分别加入50、75、100、125和150 ng/ml的BDNF培养24 h：空白对照组培养的Müller细胞不加BDNF.采用Western blot方法检测Müller细胞GLAST蛋白的表达.采用L-[3,4-H3]-谷氨酸检测100 ng/ml的BDNF干预组与空白对照组Müller细胞对谷氨酸的摄取功能的差异.对各组视网膜Müller细胞GLAST蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析,100ng/ml的BDNF干预组与空白对照组对谷氨酸摄取量的比较采用独立样本t检验.结果 Western blot检测结果显示,空白对照组GLAST蛋白的相对表达量为0.151±0.025,50、75、100、125和150 ng/ml的BDNF干预组蛋白相对表达量分别为0.331±0.076、0.413±0.110、0.497±0.080、0.411±0.072、0.319±0.084,不同浓度的BDNF均能上调GLAST蛋白的表达水平（F=6.793,P=0.003）.当BDNF浓度为100 ng/ml时,CLAST蛋白表达量最大.100 ng/ml的BDNF组与空白对照组对谷氨酸的摄取量分别为（81 213±5982）和（68 743±2688）cpm/（mg·ml）,100 ng/ml的BDNF组能够增加Müller细胞对谷氨酸的摄取,两组差异有统计学意义（t=6.462,P=0.023）.结论 BDNF能够上调GLAST蛋白的表达,并增加细胞对谷氨酸的摄取.     

缺氧对视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4表达的影响

目的 利用体外培养的视网膜Müller细胞,研究在缺氧条件下视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4(AQP-4)表达的变化.方法 采用组织块培养法从新西兰大白兔视网膜中获取Müller细胞,在含20%胎牛血清的DMEM培养液中原代培养,培养的细胞通过胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色及透射电子显微镜进行鉴定.取第2代细胞进行实验,将化学缺氧诱导剂CoCl_2联合DMEM培养液培养24h的细胞作为缺氧组;将DMEM培养液单独培养24h的细胞作为对照组.采用免疫细胞化学法及半定量RT-PCR法分别检测2组Müller细胞上AQP-4蛋白及AQP-4 mRNA的表达.结果 Müller细胞(第2代)上GFAP的阳性率为90%以上,细胞质染色呈棕色.细胞内含特征性的中间丝,细胞表面有微绒毛,细胞质内含丰富的细胞器.CoCl_2联合DMEM培养液培养24h后Müller细胞上AQP-4蛋白的表达较对照组明显增加(t=6.74,P＜0.05);AQP-4 mRNA的表达亦明显增加(t=21.79,P＜0.05).结论 缺氧能增强Müller细胞上AQP-4的表达,进而使视网膜内液体的积聚增加.提示Müller细胞在糖尿病视网膜病变(DR)或增生性视网膜病变的视网膜水肿形成过程中起重要作用.     

改良的人视网膜Müller细胞的原代培养方法与鉴定

背景 视网膜Müller细胞是视网膜重要的胶质细胞,也是视网膜干细胞的来源之一,研究Müller细胞的生物学行为对研究视网膜的各种生理病理过程和视网膜干细胞治疗研究具有重要意义,而建立稳定的视网膜Müller细胞培养体系是相关研究的基础. 目的 优化分离培养和纯化人视网膜Müller细胞的方法,为相关的实验研究提供良好优质的Müller细胞来源. 方法 分离人供体眼视网膜组织,然后将剪碎的视网膜组织置入质量分数0.25％胰蛋白酶+100 U透明质酸酶混合溶液中进行消化,添加含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液1～2 ml终止消化,然后加入含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液培养72 h,行半量换液,再以含10％胎牛血清的培养液进行传代.光学显微镜下根据细胞的形态特征进行细胞鉴定,并分别采用免疫荧光技术和免疫组织化学法检测胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Müller细胞特异性标志物谷氨酰胺合成酶(GS)的表达,对培养的细胞进行鉴定.结果 应用0.25％胰蛋白酶+100 U(商品单位)透明质酸酶的混合酶消化法可成功获取人视网膜Müller细胞,原代培养后24 h细胞贴壁,培养后9～1Od细胞融合.培养的细胞胞体呈长圆形,细胞质丰富,部分细胞体两端锥状长突起,末端膨隆,细胞核大.传代后的细胞胞体大,呈扁平多角形,符合Müller细胞的形态.细胞免疫组织化学和免疫荧光技术检测显示95％以上的细胞中GFAP呈阳性表达,90％以上的细胞中GS呈强阳性表达. 结论 应用透明质酸酶和胰蛋白酶混合液消化法可以成功分离人视网膜Müller细胞,分别用含20％胎牛血清和含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养和传代的人视网膜Müller细胞产量高且纯度好.     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中TGFβ2、VIP、DA的表达

目的 研究转化生长因子β2(TGFβ2)、血管活性肠肽(VIP)和多巴胺(DA)在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的变化.方法 眼罩遮盖诱导豚鼠近视眼,酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞,GFAP、Vimentin免疫组织化学染色进行细胞鉴定.Westren blotting检测TGFβ2、VIP、酪氨酸羟化酶(TH)蛋白在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况.高效液相色谱-电化学法测定视网膜Müller细胞分泌DA的质量浓度变化.结果 眼罩遮盖14d后,豚鼠遮盖眼眼轴延长,近视形成.酶消化法成功培养出豚鼠视网膜Müller细胞,95%以上的培养细胞阳性表达GFAP和Vimentin.正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达TGFβ2、VIP、TH蛋白,遮盖眼表达TGFβ2和VIP蛋白上调(P＜0.05)、TH蛋白下调(P＜0.05).与正常对照眼、自身对照眼比较,遮盖眼视网膜Müller细分泌DA减少.结论 Müller细胞是视网膜近视信号因子TGFβ2、VIP和DA的一个重要来源.在近视发生过程中Müller细胞可能通过合成、分泌这些近视信号因子,参与近视发生的调控.     

雷帕霉素对缺氧损伤视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

背景 研究表明雷帕霉素(Rapa)可延缓人大脑细胞的衰老,改善大鼠局灶性脑缺血时脑组织代谢活动,对中枢神经细胞具有保护作用.视神经和视网膜神经节细胞(RGCs)属于中枢神经组织,但Rapa是否可对外伤后RGCs具有保护作用尚不清楚. 目的 探讨Rapa对氯化钴(CoCl2)诱导的缺氧损伤大鼠RGCs的保护作用,并探讨其可能的作用机制,为外伤性视神经病变(TON)的治疗提供新的思路.方法 用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养大鼠RGC-5细胞,倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态学变化.将细胞分为正常对照组及50、100、200、400和600 μmol/L CoCl2组,于细胞培养后24 h和48 h采用细胞生长分析系统检测各组细胞存活率.采用200 μmol/L CoCl2处理细胞以诱导建立RGC-5细胞缺氧损伤模型,然后将培养的细胞分为正常对照组、模型对照组和不同浓度Rapa干预组,Rapa干预组在缺氧模型细胞培养液中添加Rapa使其终浓度分别为0.1、0.4、1.6和6.4μmol/L,处理细胞24 h.采用细胞生长分析系统检测各组细胞的存活率;采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率;采用JC-1染色技术检测各组细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的变化;采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞促凋亡基因bax mRNA的相对表达量. 结果 200 μmol/L CoC12作用RGC-5细胞后24 h细胞相对存活率为(70.51±5.00)％,与正常对照组的(100.00±3.29)％比较,差异有统计学意义(P＜0.01),成功构建细胞缺氧损伤模型.正常对照组、模型对照组和0.1、0.4、1.6、6.4 μmol/L Rapa干预组细胞存活率的总体比较差异有统计学意义(F=167.904,P=0.000),其中0.1μmol/L Rapa干预组细胞存活率明显高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).正常对照组、模型对照组和0.1μmol/L Rapa干预组细胞凋亡率分别为25.4％、37.7％和25.3％,细胞线粒体膜电位分别下降了0.4％、6.3％和1.4％.正常对照组、模型对照组和0.1 μmol/L Rapa干预组细胞中baxmRNA相对表达量分别为1.01±0.21、3.52±0.30和1.66±0.20,总体比较差异有统计学意义(F=88.034,P=0.000),其中模型对照组细胞中bax mRNA相对表达量均明显高于正常对照组和0.1μmol/L Rapa干预组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 Rapa可对CoC12诱导的缺氧RGC-5细胞发挥保护作用,其主要作用机制是下调细胞中促凋亡分子bax的表达,并提高RGC-5细胞存活率.     

U73122和SQ22536对视网膜色素上皮细胞增生及分泌TGF-β_2的影响

目的观察磷脂酶C（PLC）抑制剂U73122和腺苷酸环化酶（AC）抑制剂SQ22536对豚鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞增生及分泌转化生长因子-β2（TGF-β2）的影响。方法胰蛋白酶消化法培养原代豚鼠RPE细胞,角蛋白免疫组织化学染色鉴定为阳性后,传2代细胞用于实验。实验组加入含不同浓度U73122或SQ22536的培养液,设溶剂对照。24h后观察RPE细胞形态,噻唑蓝（MTT）法检测加入不同浓度U73122后RPE细胞的增生情况。酶联免疫吸附实验（ELISA）检测1×10-5mol/LU73122及SQ22536作用2、4、6、8、16h后细胞培养液中TGF-β2的分泌量。结果培养的RPE细胞通过角蛋白染色后呈棕黄色阳性反应。MTT法检测显示,U73122实验组中除5×10-6mol/L浓度组外,其余各浓度组OD值与对照组比较均显著下降,且随着浓度的增加,OD值下降越明显（P〈0.05）;SQ22536各浓度组与对照组OD值相比差异均无统计学意义（F=1.316,P〉0.05）。ELISA结果显示,加入1×10-5mol/LU73122后2h实验组TGF-β2的分泌量与对照组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）,4、6、8、16h后,实验组较对照组及2h组均明显增加（P〈0.05）;而SQ22536组RPE细胞TGF-β2的分泌量在2、4、6、16h比较差异无统计学意义（P〉0.05）,8h时分泌量降低。结论 PLC抑制剂U73122能抑制RPE细胞的增生,并可使RPE细胞分泌TGF-β2增加。AC抑制剂SQ22536对RPE细胞的生长和TGF-β2的分泌无明显影响。提示RPE细胞分泌TGF-β2的调控可能与PLC信号转导途径有关。     

GDNF家族成员artemin在大鼠视网膜神经节细胞中的表达及其功能

目的观察胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）家族成员artemin在正常大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）中的分布、表达及其功能。方法体外培养出生1～3d SD乳鼠的视网膜神经上皮细胞,免疫荧光染色检测RGCs中artemin的定位及表达,实时定量聚合酶链反应（real—time PCR）对RGCs中artemin进行定量检测。并用40mmol／L葡萄糖处理细胞12h后,再进行上述检测,观察高糖对于RGCs中artemin表达的影响。结果免疫荧光的结果证实了培养的RGCs出现Thy1．1抗体阳性的红色荧光,且多重荧光标记显示RGCs同时存在显示绿色荧光的artelnin抗体和红色荧光的Thy1．1抗体,表明artemin在RGCs中有分布。正常对照组中Thy1．1抗体阳性的细胞为（442±9）个／高倍视野,而40mmol／L高糖培养组中为（263±7）个／高倍视野,差异有统计学意义（P〈0．05）。Real—time PCR对大鼠RGCs中artemin的mRNA水平进行定量分析,40mmol／L葡萄糖处理视网膜神经细胞12h后,artemin在视网膜神经细胞及RGCs的表达明显下降（P〈0．05）。结论研究发现在原代培养的大鼠视网膜神经细胞及RGCs巾均有artemin的表达,并且在高糖作用下表达下降,为进一步研究artemin对受损RGCs的保护作用提供了思路。     

碱性成纤维细胞生长因子在牛晶状体上皮细胞中的表达和调控

目的　探讨牛晶状体上皮细胞 (BLEC)中碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)的表达和胎牛血清对表达的调控作用 ,推测白内障摘除术后血 房水屏障破坏对bFGF的影响。方法　采用免疫组化法和Westernblot法检测体外培养的BLEC中bFGF的表达 ,以及不同浓度胎牛血清 (0 1%、1 0 %及 10 0 % )作用 2 4h、10 0 %胎牛血清作用不同时间 (4、8、12及 2 4h)对bFGF相对表达量的影响。结果　免疫组化法检测显示绝大部分BLEC胞浆中可见bFGF表达。Westernblot法检测显示BLEC中表达的bFGF相对分子质量为 180 0 0 ;bFGF的表达随胎牛血清浓度的增加而增强 ,差异有显著意义 (P <0 0 5 ) ;随胎牛血清作用时间的延长而增强 ,差异有显著意义 (P <0 0 5 )。结论　BLEC中可见低相对分子质量bFGF的表达 ;胎牛血清可诱导BLEC中bFGF表达 ;白内障摘除术后血 房水屏障的破坏可导致房水中血清浓度改变 ,引起晶状体上皮细胞中bFGF表达增强。     

EGF诱导人RPE细胞表达整合素α5过程中丝裂原激活的蛋白激酶的作用

目的探讨表皮生长因子（EGF）诱导人视网膜色素上皮（RPE）细胞表达整合素α5过程中丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）的作用。方法将人RPE细胞分为对照组、EGF组和PD98059组,RT—PCR及流式细胞术观察各组整合素α5mRNA和蛋白的表达;Westernblot法检测各组人RPE细胞中MAPK的磷酸化水平。结果对照组的整合素α5mRNA／β-actinmRNA像素值的比值为0．93±0．06,PD98059组为1．06±0．07,EGF组为1．97±0．09,EGF组与其他2组相比,差异有统计学意义（P〈0．01）;流式细胞术检测显示,24h后整合素α5的荧光强度分别为1．94±0．22、4．56±0．25、2．39±0．104,差异有统计学意义（P〈0．05）。Westernblot检测显示,30min后EGF组细胞外信号调节激酶（ERK）1／2的磷酸化激活水平最高,PD98059组抑制ERK1／2的磷酸化激活,对照组ERK1／2的磷酸化激活作用很弱。结论ERK1／2的磷酸化激活参与EGF诱导人RPE表达整合素α5的过程。EGF激活ERK1／2通路刺激人RPE细胞整合素α5mRNA的表达。     

缺氧对视网膜色素上皮细胞基质细胞衍生因子-1和整合素连接激酶表达的影响

背景 缺氧是诱导新生血管形成的主要因素,近年来越来越多的研究证实基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和整合素连接激酶(ILK)在新生血管性疾病中发挥着重要作用,而缺氧对视网膜色素上皮(RPE)细胞SDF-1和ILK表达的影响尚未阐明. 目的 探讨缺氧对体外培养RPE细胞中SDF-1和ILK表达的影响.方法 从4周龄SPF级健康C57BL/6小鼠眼球中获取RPE组织并进行消化和培养,将达到80％融合的细胞进行传代.取第3代细胞制作细胞爬片后用细胞角蛋白18(CK18)抗体进行免疫组织化学检测和鉴定,以5×104个/ml密度将RPE细胞接种于含胎牛血清的DMEM/F12培养液的培养瓶中,无血清饥饿培养24 h后常氧组在常规培养基中进行培养,缺氧组在CoCl2浓度为200 μmol/L的含胎牛血清的DMEM/F12培养液中进行培养,2个组根据培养时间的不同再亚分为1、3、6、12、24、48、72h组.采用逆转录PCR(RT-PCR)检测RPE细胞中SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达,采用Western blot检测RPE细胞中SDF-1蛋白和ILK蛋白的表达,均以目的基因A值/β-actin A值表示.结果 培养的RPE细胞呈不规则多边形,细胞质内布满黑色素颗粒,90％以上的细胞对CK18呈阳性反应.随着CoCl2培养时间的延长,SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达量逐渐增加,总体比较差异均有统计学意义(SDF-1 mRNA:F=281.875,P=0.000;ILK mRNA:F=187.566,P=0.000),12h达高峰,之后略有降低,但仍高于常氧组,缺氧1h组SDF-1 mRNA及蛋白表达无明显变化;缺氧培养3、6、12、24、48、72 h组SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达量均明显高于常氧培养组,差异均有统计学意义(P＜0.01).随着CoCl2培养时间的延长,SDF-1蛋白和ILK蛋白的表达量逐渐增加,差异均有统计学意义(SDF-1:F=44.719,P=0.000; ILK:F=144.481,P=0.000).缺氧1h组SDF-1及ILK蛋白表达无明显变化;缺氧3、6、12、24、48、72 h组SDF-1蛋白、ILK蛋白表达明显升高,与常氧组比较差异均有统计学意义(P＜0.01). 结论 SDF-1和ILK参与了RPE细胞的缺氧反应,并且在缺血缺氧性视网膜病变的发生发展过程中可能发挥一定的作用.     

茄病镰刀菌对体外培养小鼠角膜基质细胞TLR4表达的影响

目的通过检测茄病镰刀菌刺激小鼠角膜基质细胞后Toll样受体4（TLR4）的表达分布,探讨TLR4在角膜真菌感染中的作用。方法体外培养小鼠角膜基质细胞,采用茄病镰刀菌液（孢子密度为1×10^6CFU／mL）来刺激传3代的小鼠角膜基质细胞,于刺激0h（即未刺激）以及3、6、12h后应用免疫细胞化学染色、RT—PCR法测定各组细胞TLR4蛋白及mRNA的表达,ELISA法测定各组细胞上清液中肿瘤坏死因子α（TNF—α）的分泌水平。结果培养的角膜基质细胞1周后融合,波形蛋白荧光染色阳性。TLR4蛋白及mRNA在未刺激角膜基质细胞呈微弱表达,3h较前明显升高,6h达到高峰,12h开始减弱,但与0h相比,差异均有统计学意义（蛋白：t3h=0．031,t6h=0．097,t12h=0．069,P〈0．05;mRNA：t3h=0．367,t6h=0．422,t12h=0．078,P〈0．05）。TNF-α分泌量随着刺激时间的延长呈上升趋势,6h达到高峰,然后逐渐下降,3、6、12h组与0h组比较差异均有统计学意义（t3h=21．152,t6h=40．854,t12h=27．713,P〈0．05）。TLR4 mRNA及蛋白的表达与TNF-α的分泌间均呈正相关（r=0．729,0．751,P〈0．05）。结论TLR4可能在角膜识别真菌感染、介导炎性防御反应过程中起到重要的作用。     

TGF-β2作用于人晶状体上皮细胞后Smad 4与p-Smad2／3的动态表达

目的观察转化生长因子β2（TGF-β2）作用于人晶状体上皮细胞（LECs）后2类通路转导蛋白Smad4和p-Smad2／3的动态表达变化。方法体外培养的人LECs中添加10ng／mL人TGF—β2,RT-PCR方法测定不同时间点Smadg mRNA的表达,Western blot观察p-Smad2／3的表达,免疫组织化学法观察p-Smad2／3在LECs表达的特点。结果人LECs添加了外源性人TGF-β2,后1h,可出现Smad 4 mRNA表达增高,16h时达峰值（0．72±0．07）,并持续至24h。与对照组比较差异无统计学意义（P〈0．05）。p-Smad2／3在2h后逐渐增强,与对照组比较差异明显,16h达到峰值（2．53g／L）。16h有p-Smad2／3颗粒胞浆表达,24b向核内聚集。结论TGF-β2刺激LECs后,可激活膜受体激活型Smad和通用型Smad,TGF-β2对Smad通路蛋白的激活存在时效关系。TGF—β2可通过特异性激活Smad通路,将信号转导至细胞核内。     

培养的兔羊膜上皮细胞构建角膜表层移植片的研究

目的应用培养的兔羊膜上皮细胞（AECs）体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,探讨利用AECs重建角膜表层的可行性。方法取妊娠晚期新西兰大白兔（27～28孕周）的羊膜,制成AECs单细胞悬液,用含血清和表皮生长因子（EGF）的DMEM／F12培养液培养、传代,利用免疫组织化学单克隆抗体AE1／AE3、AE5检测培养的AECs中细胞角蛋白ck3／12的表达;将体外培养的2～3代兔AECs种植在新鲜兔角膜基质上,利用气-液界面培养法使之复层化,体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,进行光学显微镜和扫描电镜观察,并进行免疫组织化学测定。结果体外培养的兔AECs呈现单克隆抗体AE1／AE3、AE5表达阳性,AECs在新鲜兔角膜基质上能形成形态类似于正常角膜上皮细胞的3～5层复层结构,且复层化后的上皮细胞单克隆抗体AE5表达阳性。结论应用培养的AECs能成功构建类似角膜表层的复层上皮细胞-角膜基质移植材料,AECs可能成为重建角膜表层的一种新的细胞来源。     

应用反义寡核苷酸沉默PDGFR-α表达对RPE细胞增生和凋亡的影响

背景 视网膜色素上皮( RPE)细胞能分泌血小板源性生长因子(PDGF),又具有PDGF受体(PDGFR),已有研究表明PDGF对增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的形成起着关键性作用. 目的 应用反义寡核苷酸( ASODN)技术抑制血小板源性生长因子受体-α(PDGFR-α)基因的表达,观察其对RPE细胞增生和凋亡的影响.方法 将人RPE细胞株在含质量分数10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中进行培养,取对数生长期细胞调节细胞密度为5×105个/孔,接种于96孔板,待细胞生长至80％～90％融合时进行转染.空白对照组不加PDGFR-α ASODN及阳离子脂质体Lipofectamine 2000,1.0μmol/L Lipo-ASODN组、2.0μmol/LLipo-ASODN组使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至RPE细胞株.细胞转染48 h后,MTT法检测各组细胞的吸光度(A)值并以A490表示,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PDGFR-α mRNA在RPE细胞中表达的变化;hoechst 33258荧光染色观察培养细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测RPE细胞的细胞周期和凋亡率. 结果 空白对照组、1.0 μmol/L Lipo-ASODN组及2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞的A490值分别为1.45±0.12、1.07±0.06、0.65±0.05,差异有统计学意义(F=97.72,P=0.00),1.0μmol/L Lipo-ASODN组和2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于空白对照组,差异均有统计学意义( P=0.00、0.00);2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于1.0 μmol/L Lipo-ASODN组,差异有统计学意义(P=0.00).Hoechst 33258荧光染色显示,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞凋亡数量多于空白对照组.流式细胞仪检测表明,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞阻滞于G0/G1期(F=206.70,P=0.00),1.0 μmol/L Lipo-ASODN组和2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞凋亡率均明显高于空白对照组(37.8±1.3 vs 10.5±0.1,61.2±1.9 vs 10.5±0.1)(F=1808.90,P=0.00).PDGFR-α在RPE细胞中的表达随PDGFR-α ASODN浓度的升高有降低的趋势. 结论 利用ASODN技术沉默PDGFR-α基因表达可以显著抑制PVR过程中RPE细胞的增生,并能诱导其凋亡,不同浓度PDGFR-α ASODN转染后能下调PDGFR-α mRNA的表达,PDGFR-α基因的ASODN靶向技术为PVR的基因治疗提供了实验依据.