调宁蛋白基因siRNA重组腺病毒载体构建 及其对体外子宫平滑肌细胞的作用

目的：构建siRNA重组腺病毒载体,为研究Calponin-1基因在分娩发动中的作用机制提供实验基础。方法：采用消化酶法对足月妊娠人子宫平滑肌细胞原代培养,并用免疫细胞化学方法进行鉴定。构建腺病毒siRNA-Calponin-1质粒转染原代培养的子宫平滑肌细胞,采用RT-PCR和Western印迹检测Calponin-1的表达。结果：构建的Calponin-1 siRNA腺病毒载体可以显著抑制子宫平滑肌细胞中Calponin-1mRNA和蛋白的表达。实验组、空白对照组、空载体组的Calponin-1 mRNA表达的灰度值分别为316.3±39.2,1048.5±126.4,1027.2±127.5,Calponin-1蛋白表达的灰度值分别为323.3±43.2,1021.5±143.4,1019.2±144.5,实验组与空白对照组、空载体组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,空白对照组与空载体组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论：构建的pAdEasy-pShuttle-U6-Calponin-1 siRNA质粒能抑制体外子宫平滑肌细胞Calponin-1的表达,为研究Calponin-1在分娩发动中的作用提供了实验基础。     

大电导钙敏感钾通道在人足月妊娠子宫平滑肌组织中的表达

目的了解大电导钙敏感钾通道（large-conductance calcium-sensitive potassium channel,BKCa）蛋白在人足月妊娠未临产及临产子宫下段平滑肌组织中的表达情况,探讨BKCa在分娩启动中的作用。方法采用Western blot分别测定人足月妊娠未临产及临产子宫下段平滑肌组织中BKCa蛋白α亚单位的表达。结果人足月妊娠未临产子宫下段平滑肌组织中BKCa蛋白α亚单位的相对表达量为1.18＋0.20 （n=9）,足月妊娠临产子宫下段平滑肌组织中BKCa蛋白α亚单位的相对表达量为0.60＋0.08（n=11）,二者统计学差异显著（P=0.009）。结论人足月妊娠未临产子宫下段平滑肌组织BKCa 蛋白的表达高于临产子宫下段平滑肌组织,提示BKCa在宫缩发动中具有一定作用。     

调宁蛋白基因siRNA重组腺病毒载体构建及其对体外子宫平滑肌细胞的作用

目的：构建siRNA重组腺病毒载体,为研究Calponin-1基因在分娩发动中的作用机制提供实验基础。方法：采用消化酶法对足月妊娠人子宫平滑肌细胞原代培养,并用免疫细胞化学方法进行鉴定。构建腺病毒siRNA-Calponin-1质粒转染原代培养的子宫平滑肌细胞,采用RT-PCR和Western印迹检测Calponin-1的表达。结果：构建的Calponin-1siRNA腺病毒载体可以显著抑制子宫平滑肌细胞中Calpo-nin-1mRNA和蛋白的表达。实验组、空白对照组、空载体组的Calponin-1mRNA表达的灰度值分别为316.3±39.2,1048.5±126.4,1027.2±127.5,Calponin-1蛋白表达的灰度值分别为323.3±43.2,1021.5±143.4,1019.2±144.5,实验组与空白对照组、空载体组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,空白对照组与空载体组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：构建的pAdEasy-pShuttle-U6-Calponin-1siRNA质粒能抑制体外子宫平滑肌细胞Calponin-1的表达,为研究Calponin-1在分娩发动中的作用提供了实验基础。     

人子宫体部平滑肌收缩相关蛋白的筛选

目的：筛选与人子宫平滑肌收缩相关的蛋白质以探讨人子宫体部平滑肌收缩及分娩发动的分子机制。方法：应用双向凝胶电泳技术分离人足月自然临产和未临产子宫体部平滑肌组织总蛋白,经考马斯亮蓝染色、图像分析、识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质量指纹图谱,搜索数据库鉴定部分差异表达蛋白质;Westernl印迹对3个差异表达蛋白进行验证。结果：建立了人足月自然临产和未临产子宫体部平滑肌的双向凝胶电泳图谱,质谱鉴定得到自然临产和未临产之间的表达差异大于2倍的蛋白质点20个,其功能涉及细胞骨架、钙结合力、分子伴侣、能量代谢、信号转导和抗氧化能力等;Westernl印迹验证结果与蛋白质组学结果一致。结论：筛选并鉴定了20个子宫体部平滑肌收缩相关蛋白质,提示细胞骨架改变、钙结合能力增强是分娩发动的重要原因。     

子宫平滑肌和胎膜内皮素受体-1表达与分娩发动的关系

目的：探讨子宫平滑肌和胎膜内皮素受体-1（ETa—R）表达水平与分娩发动的关系。方法：分别于术中取正常晚孕临产组和未临产组（各30例）孕妇子宫平滑肌及胎膜,采用免疫组化SABC法测定子宫平滑肌和胎膜ETa—R的表达,并通过计算机图像分析系统进行定量分析。结果：正常妊娠临产前后子宫平滑肌细胞胞膜、胞质均有ETa—R表达,且临产后其表达范围及强度均较临产前增强,差异均有统计学意义（P〈0．01）;胎膜组织中ETa—R主要定位于合体滋养细胞和中间滋养细胞,ETa-R表达强度在临产前后没有明显变化（P〉0．05）,但临产后其阳性细胞率较临产前增强（P〈0．01）。结论：分娩发动前、后子宫平滑肌及胎膜组织中ETa—R表达水平升高,并与分娩发动有密切关系,是诱发子宫收缩的重要因素。     

不同临产状态的子宫平滑肌组织中与#br# NF-κB相互作用差异蛋白质的分析

目的：分析不同临产状态子宫下段平滑肌组织中与NF-κB相互作用的差异蛋白质,为分娩机制的研究提供新的实验及理论依据。方法：分别采集足月未临产、自然临产和前列腺素E2栓诱导临产(药物临产组)的孕妇子宫下段平滑肌组织。Western印迹验证NF-κB P65表达;联合免疫共沉淀、SDS-PAGE、电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)和蛋白质生物信息分析等技术,分析不同临产状态子宫平滑肌组织中与NF-κB相互作用的差异蛋白质,并利用Western印迹进行验证。结果：人类临产前后子宫下段平滑肌组织中NF-κB表达均为阳性,与NF-κB P65相互作用的差异蛋白,自然临产前后鉴定出9个,药物临产前后鉴定出5个,其中不同临产状态共同差异表达的蛋白3个,分别为热休克蛋白70(heat shock 70 kD protein,HSP70)、膜联蛋白A6和结蛋白,经Western印迹验证与蛋白表达相符。这些差异蛋白分别属于分子伴侣、信号转导、细胞骨架和能量代谢相关的蛋白质。结论：子宫平滑肌细胞中NF-κB通过与分子伴侣、信号传导、细胞骨架和能量代谢等相关的多种蛋白质相互作用,参与分娩的启动或调节。     

临产前后妊娠组织MMP-9、TGF-β1表达变化意义的研究

目的 研究临产前后妊娠组织MMP-9、TGF-β1表达的变化，探讨它们在分娩发动中的作用。方法 应用免疫组化法检测子宫平滑肌、胎盘、蜕膜组织MMP-9和TGF-β1的表达。结果 临产组妊娠组织MMP-9的表达明显强于未临产组，而TGF-β1的表达明显弱于未临产组。TGF-β1与MMP-9的表达负相关。结论 （1）MMP-9、TGF-β1表达的变化在宫颈成熟中发挥重要作用。临产前后TGF-β1表达下降，解除对MMP-9的抑制，从而宫颈细胞外基质降解，宫颈成熟而临产。     

ATP敏感性钾通道在人类妊娠不同状态的子宫平滑肌的表达

目的:探讨ATP敏感性钾通道(KATP )亚基在人类2种不同功能状态下(临产和未临产)子宫平滑肌中的表达情况。方法:实验分为足月临产组(TL组)和足月未临产组(TNL组),均12例。采用RT-PCR和实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测了人类2种妊娠状态下子宫平滑肌KATP 3种亚基mRNA的表达,并用免疫组织化学法检测KATP 3种亚基蛋白表达情况。结果:Kir6.1、Kir6.2、SUR2B mRNA在临产和未临产子宫平滑肌上均有表达,TNL组SUR2B mRNA的含量高于TL组(P<0.05);3种亚基的受体蛋白在人未临产和临产的子宫平滑肌细胞胞质中都有表达。结论:KATP在子宫平滑肌上有表达;在人类的妊娠子宫平滑肌上可能是通过SUR2B水平的改变起到调节平滑肌收缩的作用。     

B超测量子宫肌层厚度预测未足月胎膜早破临产时间的研究

目的 探讨B超测量子宫肌层厚度能否预测未足月胎膜早破（PPROM）的临产时间。方法 选择2005年9月至2006年1月成都市妇幼保健院住院治疗的PPROM孕妇共28例，破膜后1d内B超测量子宫底部、子宫体前中壁、子宫体后壁和子宫下段肌层的厚度。同期选择相应孕周胎膜完整且未临产的孕妇29例作为对照组。结果 PPROM组子宫体肌层显示出相似的厚度，子宫底部、子宫体前中壁、子宫体后壁组间无差异性（P〉0.05）。PPROM组子宫底部、子宫体前中壁、子宫体后壁和子宫下段肌层的厚度较对照组明显变厚，差异有显著性（P〈0.05）。PPROM组子宫底部肌层厚度与临产明显相关，厚度越厚，临产时间越早，子宫底部肌层厚度〉11mm，5d内临产的敏感性及特异性分别为92.7％，62.0％。结论 B超测量子宫肌层厚度有助于预测未足月胎膜早破的临产时间。     

妊娠和分娩中子宫平滑肌及胎盘内皮素受体A表达的初步探讨

目的探讨临产前、后子宫平滑肌细胞及胎盘滋养细胞内皮素受体A(ETA)的表达变化.方法应用免疫组化方法结合计算机图像分析技术分析60例足月妊娠剖宫产产妇子宫下段平滑肌细胞及胎盘滋养细胞ETA的表达,观察临产前、后两组的表达强度.结果临产组子宫平滑肌细胞及胎盘滋养细胞ETA的表达显著强于未临产组,差异有显著意义(P＜0.01).结论ETA可能通过参与调节子宫平滑肌收缩和局部前列腺素的合成参与分娩发动.     

基于RhoA/Rho信号通路探讨产妇子宫平滑肌组织 Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平与产后出血的关系

目的：基于RhoA/Rho信号通路探讨产妇子宫平滑肌组织CPI-17(Thr38)、KCa3.1、Krüppel样因子4(KLF4)表达水平与产后出血的关系。方法：选择80例宫缩乏力性产后出血产妇为观察组,选择同期80例无产后出血产妇为对照组。采用肌条等长张力测定法检测离体子宫平滑肌的自发收缩活动力,以及加入Rho激酶抑制剂(Y-27632)后的子宫平滑肌收缩活动力。采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应法检测子宫平滑肌组织中RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡmRNA表达水平,采用蛋白质印迹法检测RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡ以及Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平。采用Pearson相关分析RhoA蛋白以及子宫平滑肌收缩活动力与Thr38、KCa3.1、KLF4的关系。结果：观察组的子宫平滑肌收缩活动力、收缩频率以及收缩幅度均低于对照组(P<0.05～P<0.01),加入Y-27632后,2组子宫平滑肌收缩活动力均低于加入前(P<0.05)。观察组RhoA/Rho信号通路相关mRNA以及蛋白(RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ)表达水平均低于对照组(P<0...     

平滑肌可收缩蛋白在人子宫肌及子宫平滑肌瘤中的差异表达研究

目的:探讨平滑肌可收缩蛋白SM-α-actin、Calponin和SM22在人类子宫肌及子宫平滑肌瘤中的差异表达.方法:采用Western blot检测人子宫肌及子宫平滑肌瘤组织中平滑肌可收缩蛋白SM-α-actin,Calponin和SM22的表达情况.进一步采用酶消化法分离培养人子宫平滑肌细胞(HM-SMCs)及子宫平滑肌瘤平滑肌细胞(HL-SMCs),并采用免疫荧光、Western blot检测HM-和HL-SMCs中SM-α-actin、Calponin、SM22的表达.结果:Western blot结果显示平滑肌可收缩蛋白SM-α-actin、Calponin、SM22在人子宫平滑肌瘤组织中表达下降,差异有统计学意义(P＜0.05);免疫荧光对原代培养的HM-和HL-SMCs中SM-αactin,Calponin和SM22的表达进行检测,结果均呈阳性,但与HM-SMCs相比,在HL-SMCs中表达水平下降.进一步的Westem blot结果也显示HL-SMCs中SM-α-actin,Calponin和SM22-α表达下降,差异有统计学意义(P＜0.05).绘制生长曲线显示子宫平滑肌瘤细胞生长缓慢.结论:子宫平滑肌瘤细胞的分化程度较低,在子宫平滑肌瘤病变中可能存在着平滑肌的去分化现象.SM-α-actin、Calponin和SM22可能在子宫平滑肌瘤的发生、发展过程中起着重要作用.     

TLR4表达水平与COPD大鼠肺动脉平滑肌细胞合成分泌功能的关系

目的 探讨Toll样受体4(TLR4)表达水平与慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)合成分泌功能的关系.方法 建立大鼠COPD模型,HE染色判定模型建立,免疫组织化学染色观察对照组与COPD模型组肺组织动脉平滑肌层TLR4的表达.分离培养鉴定原代PASMCs,脂多糖(LPS)、TLR4的特异性抑制剂TAK-242干预细胞,实验分组:空白组、LPS组、TAK-242组、LPS+ TAK-242组,Western blot检测各组PASMCs中TLR4的表达,ELISA法检测各组细胞培养上清液中Th1细胞因子干扰素(IFN)-γ、Th2细胞因子白介素(IL)-6及血小板衍化生长因子(PDGF)的浓度;并将TLR4的表达水平与上清液中炎性因子的分泌水平进行相关性分析.结果 COPD模型组大鼠肺组织动脉平滑肌层TLR4的表达明显高于正常大鼠;与空白组比较,LPS组PASMCs中TLR4的表达明显升高(P＜0.05);LPS组PASMCs中合成分泌IFN-γ、IL-6、PDGF的水平较对照组明显升高,TAK-242阻断TLR4,PASMCs中TLR4的表达明显降低(P＜0.05);细胞培养上清液中IFN-γ、IL-6、PDGF的表达水平较空白组明显降低(P＜0.05);TLR4表达水平与细胞培养上清液IFN-γ、IL-6及PDGF的浓度呈显著正相关性(r =0.95、0.87、0.83,P ＜0.05).结论 TLR4可能参与调控PASMCs的合成分泌功能.     

PRKG1在前列腺癌中的表达及其机制

目的：研究cGMP依赖蛋白激酶1（PRKG1）在前列腺癌组织中的表达及其作用机制。方法：Western blot法检测前列腺癌的PRKG1表达。CRISPR/Cas9敲除22RV1细胞系的PRKG1基因，观察其对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，并用Western blot法检测相关凋亡蛋白。结果：与正常前列腺组织组比，前列腺癌组织的PRKG1阳性率低（42.7% vs. 13.3%，P＜0.05），且不同肿瘤临床分期、Gleason评分阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。敲除PRKG1基因明显加强22RV1细胞系增殖、迁移和侵袭能力（P＜0.05）并导致Ezrin、MMP9、CDH-1、Bax水平显著降低（P＜0.05），CDH-2、Bcl-2水平升高（P＜0.05）。结论：PRKG1可能通过MMP9、CDH-2、Bax、Bcl-2和CDH-1蛋白抑制前列腺癌发生发展。     

平喘宁调节ERK信号通路干预哮喘气道重塑的机制

目的 通过观察平喘宁干预后哮喘模型大鼠ERK信号转导通路相关蛋白以及基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）、金属蛋白酶组织抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1）的表达,探讨平喘宁调节寒性哮喘大鼠气道重塑的机制。方法 采用SPF级雄性SD大鼠复制寒性哮喘模型。将大鼠随机分成正常对照组,模型组,地塞米松组,桂龙咳喘宁组以及平喘宁高、中、低剂量组。连续给药4周后,光镜下观察肺组织病理形态学变化,采用免疫组织化学法检测肺组织中TIMP-1、MMP-9表达水平;采用Western blot法检测大鼠肺组织血小板源性生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）、细胞外信号调节激酶-1（extracellular signal-regulated kinase 1,ERK1）、磷酸化细胞外信号调节激酶-1（phosphorylated ERK1, p-ERK1）的表达水平。结果 与正常对照组比较,模型组有明显炎性细胞浸润、气管上皮脱落增多、气管平滑肌增厚等气道重塑现象;与模型组比较,各治疗组炎性细胞浸润减少,气管上皮脱落减少,平滑肌增厚情况改善,气道重塑均得到适当缓解。与正常对照组比较,模型组MMP-9、TIMP-1的表达水平显著升高（P<0.05）;而与模型组比较,平喘宁各剂量组MMP-9、TIMP-1表达水平均显著下降（P<0.05）,尤其是平喘宁高剂量组下降最为明显。与正常对照组比较,模型组PDGF以及ERK1、p-ERK1蛋白的表达水平显著升高（P<0.05）;而与模型组比较,药物治疗组PDGF以及ERK1、p-ERK1蛋白的表达水平均显著下降（P<0.05）。结论 平喘宁可通过调节ERK信号通路减轻哮喘大鼠气道炎性反应,延缓气道重塑。     

女性压力性尿失禁患者盆底结构的雌激素受体

目的 探讨女性盆底支持结构雌激素受体（ER）α和β与压力性尿失禁（SUI）发生的关系。方法 免疫组织化学及蛋白免疫印迹法检测绝经前后SUI患者肛提肌及周围组织中ERα和ERβ的表达。结果 绝经前、后SUI组肛提肌活检阳性率分别为11％、0,对照组分别为35％、33％。肛提肌未见ERα和ERβ表达,ERα和ERβ分布于肛提肌周围筋膜组织。ERβ在部分盆底筋膜组织切片标本染色呈阴性,绝经前、后SUI组盆底筋膜组织ERβ染色阳性率分别为57％、33％,显著低于对照组（P〈0．05）;绝经后各组盆底筋膜组织ERβ染色阳性率较绝经前显著降低（P〈0．05）。绝经前、后SUI组盆底筋膜组织ERα测定值分别为（4．43±2．64）％和（5．14±1．79）％,均显著低于相应对照组的（9．61±5．48）％和（10．88±2．90）％（P〈0．05）。蛋白免疫印迹法检测结果表明,盆底筋膜组织的ERβ表达低于ERα,SUI组ERα和ERβ表达较对照组降低。结论女性肛提肌未检测到ERα和ERβ。妇女绝经前SUI的发生与低雌激素水平有关。盆底筋膜组织ERα表达减少和ERβ表达阳性率降低与SUI发生有关。     

牛蒡子对糖尿病大鼠肾组织基质细胞衍生因子1表达的影响

目的:研究牛蒡子对糖尿病大鼠肾脏基质细胞衍生因子1(SDF-1)表达的影响。方法:建立糖尿病大鼠模型,利用荧光实时定量PCR和Western blot检测经牛蒡子治疗后糖尿病大鼠肾脏组织中SDF-1mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:荧光实时定量PCR结果显示糖尿病大鼠组肾脏组织中SDF-1mRNA(1.499±0.03)明显较正常大鼠组(1.231±0.02)升高,而牛蒡子治疗组大鼠肾脏SDF-1的mRNA(1.27±0.01)较糖尿病大鼠组明显降低,组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示牛蒡子治疗组大鼠肾脏中SDF-1蛋白的相对表达量为0.93±0.22,明显低于糖尿病模型组1.60±0.21(P<0.05),与正常组大鼠肾脏表达量接近(0.80±0.13)。结论:牛蒡子能够下调糖尿病大鼠肾脏组织中SDF-1的表达。