聚合酶链反应用于鉴别恶性疟原虫不同分离株的研究

用恶性疟原虫主要裂殖子表面抗原基因序列（ＭＳＡ－１）为引物的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测恶性疟原虫感染。用此方法扩增实验室体外培养的ＦＣＣ１／ＨＮ株恶性疟原虫，显示１条３００ｂｐ的ＤＮＡ片断，而对实验室培养的巴布亚新几内亚ＦＣＱ－２７株则显示１条４４０ｂｐＤＮＡ条带。用此方法检测１５份采自云南中缅边界的恶性疟血样均能扩增出ＤＮＡ条带，但不同血样的ＤＮＡ条带的分子量不同，部分血样还存在１条以上的ＤＮＡ条带。在同时扩增的１０份正常人血样和１０份采自江苏间日疟流行区的现症间日疟血样中均没有发现ＤＮＡ条带。表明此方法具有很高的种和株的特异性。     

间日疟原虫环子孢子蛋白基因片段的扩增应用于诊断间日疟感染的研究

根据间日疟原虫环子孢子蛋白（ＣＳＰ）基因序列，设计并合成间日疟原虫特异性引物一对，采用聚合酶链反应技术，进行间日疟原虫感染的检测。结果：（１）从间日疟原虫患者的全血ＤＮＡ中扩增出约７７２ｂｐ的基因片段，经限制性内切酶切，证实为间日疟原虫ＣＳＰ基因片段；（２）与间日疟原虫亲缘关系相近的三株恶性疟原虫、弓形虫、利什曼原虫和正常人全血核酸抽提物经扩增后均未见特异性的扩增条带；（３）该检测体系可检测出间日疟原虫感染血样中２．８虫／μｌ血的水平；（４）将该检测体系用于深圳地区及湖北随州地区间日疟感染患者血样的检测，１４７份患者的血样中１４４份检出阳性，可见一条特异性扩增带，与镜检的符合率达９８％，而２０正常人血样均为阴性。上述结果表明该法灵敏、特异且稳定性好，适用于间日疟感染的检测。     

基因组、克隆重组DNA探针平行检测恶性疟原虫的初步研究

本文报告实验室制备恶性疟原虫（Ｆｃｃ－１／ＨＮ分离株）基因组ＤＮＡ．酶切冻融回收克隆重组ｐＰＦ１４ＤＮＡ，经３２Ｐ缺口移位法标记作为探针，按ＤＮＡ—ＤＮＡ斑点杂交试验平行检测Ｐ．ｆ．ＤＮＡ及血样中恶性疟原虫的初步结果．两探针检测人工培养的恶性疟原虫（Ｆｃｃ－１／ＨＮ）敏感度，基因组探针为０．０００７８％原虫血症和７．８３ｐｇ原虫ＤＮＡ，ｐＰＦ１４探针为０．００７８％和１５．６３ｐｇ。镜检确诊并复核后的５６例云南恶性疟病人血样，基因组探针检出５３例（９４．６４％），ｐＰＦ１４探针检出５１例（９１．０７％）．９例间日疟病人血样，基因组探针阳性７例，ｐＰＦ１４探针均未显示杂交．２例伯氏鼠疟、１例刚地弓形虫阳性鼠及１０例正常人血样皆为阴性．结果揭示：这两种探针似可用于我国疟疾主要流行区恶性疟原虫检测。与基因组探针相比，ｐＰＦ１４探针似是发展适合于我因恶性疟原虫大规模核酸诊断技术中，比较经济、方便的探针来源。     

间日疟原虫环子孢子蛋白基因片段的扩增应用于诊断间日…

根据间日疟原虫环子孢子蛋白（ＣＳＰ）基因序列，设计并合成间日疟原虫特异性引物一对，采用聚合酶锭反应技术，进行间日疟原虫感染的检测。结果：（１）从间日疟原虫患者的全血ＤＮＡ中扩增出约７７２ｂｐ的基因片段，经限制性内切酶切，证实为间日疟原虫ＣＳＰ基因片段；（２）与间日疟原虫亲缘上近的三株恶性疟原虫，弓形虫，利什曼原虫和正常人全血核酸抽提物经扩增后均未见特异性的扩增条带；（３）该检测体系可检测出间日疟原     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株有性期特异抗原Pfs25基因的克隆和序列分析

利用ＰＣＲ扩增技术从恶性疟原虫海南ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组中特异扩增编码Ｐｆｓ２５抗原全基因序列，扩增产物经纯化回收后，用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行ＤＮＡ序列测定，结果显示ＦＣＣ１／ＨＮ株Ｐｆｓ２５基因序列与ＮＦ５４株者基本一致，仅在第３９２位碱基存在置换（Ｇ→Ｃ）和该密码子编码的氨基酸的变化（１３ｌａａ：Ｇｌｙ→Ａｌａ），进一步的酶切位点分析显示该位点碱基置换产生新的ＰｓｔⅠ酶切位点（３９３），再用ＰｓｔⅠ消化纯化的ＰＣＲ产物，产生２条大小分别为３９３ｂｐ和２７０ｂｐ的ＤＮＡ片段，测序和酶切结果都证实扩增的目的基因确为编码有性期特异抗原Ｐｆｓ２５基因。另将纯化的ＰＣＲ产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ双酶切后，定向克隆入ｐｃＤＮＡ３载体，转化大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１，随机挑取氨苄青霉素抗性菌落进行ＰＣＲ扩增验证和用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ双酶切鉴定，结果证明重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆｓ２５含有编码Ｐｆｓ２５抗原基因。     

恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ基因片段的体外扩？…

目的 构建恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株红细胞结合抗原（ＥＢＡ－１７５）和富组氨酸蛋白Ⅱ（ＨＲＰ－Ⅱ）抗原的重组质粒并进行初步鉴定。方法 通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）对恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株的ＥＢＡ－１７５和ＨＲＰ－Ⅱ基因进行体外扩增，用ＨｉｎｄⅢ／ＢａｍＨＩ和ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ分别消化扩增产物，定向克隆ｐｃＤＮＡ３载体，转化至感受态大肠杆菌ＴＧ１，经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定，再经ＰＣＲ和     

恶性疟原虫传播阻断抗原pfs25和pfs48／45基因编码序列的体？…

目的：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原ｐｆｓ和ｐｆｓ４８／４５的基因序列，为进一步对其进行克隆和体外高效表达创造条件，方法：特定寡核苷酸引物的设计，合成与纯化；恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株体外培养，利用碱裂解法从培养的恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株提取染色体ＤＮＡ；ＰＣＲ扩增和琼脂糖凝胶电泳分析。结果：从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出编码ｐｆｓ２５和ｐｆｓ４８／４５基因序列，其，中     

用固相聚合酶链反应检测恶性疟原虫DNA特异片段

本文建立了固相聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测恶性疟原虫的方法，并对培养的ＦＣＣｌ／ＨＮ株及西双版纳恶性疟患者进行检测，结果表明该法对ＦＣＣｌ／ＨＮ株ＤＮＡ敏感到０．２ｐｇ，相当于１０个疟原虫，对西双版纳疟疾患者检测恶性疟３０例，间日疟４例，证实ＰＣＲ仅特异扩增恶性疟原虫ＤＮＡ。提示固相ＰＣＲ是早期、敏感、特异检测恶性疟原虫的方法。     

PCR检测蚊体内恶性疟原虫子孢子方法的建立

为建立能检测蚊体内恶性疟原虫的聚合酶链反应技术，根据恶性疟原虫ＣＳＰ基因序列，设计合成１对引物，以Ｃｈｅｌｅｘ－１００煮沸法制备ＤＮＡ模板，采用ＰＣＲ方法，恶性疟原虫子孢模板预期被扩增出２４５ｂｐ的ＤＮＡ条带，并将该法与蚊虫解剖镜检子孢方法相比较。结果经人工感染恶性疟原虫的３１只大劣按蚊中１４只ＰＣＲ阳性，被扩增出预期大小的ＤＮＡ片段，其余１７只ＰＣＲ阴性；以该技术检测野外捕捉的９８只按蚊，结果均     

恶性疟原虫疫苗研究：IX.主要裂殖子表面蛋白1C端类表皮…

恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白１（ＭＳＰ１）在其分子Ｃ－端ＭＰＳ－１１９具有两个类ＥＧＦ结构，其中类ＥＧＦ－１为特异性抗体抑制原虫侵入细胞的靶位之一。本文通过酚－氯仿抽提，乙醇沉淀法提取恶性疟原虫（ＦＣＣ－１ＨＮ株）基因组ＤＮＡ，再用ＰＣＲ扩增类ＥＧＦ－１基因，经酶切纯化后插入质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）中，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，经ＰＣＲ筛选及双酶切鉴定，筛选出含类ＥＧＦ－１基因的阳性克隆子。     

聚合酶链反应检测恶性疟原虫的研究

通过５ 对根据恶性疟原虫不同基因序列设计的引物筛选及７ 种从滤纸干血滴中快速制备疟原虫ＤＮＡ模板的方法的比较,以建立一种敏感、特异、简便、快速的聚合酶链反应（ＰＣＲ） 检测恶性疟原虫的方法。结果表明,根据恶性疟原虫中度重复基因序列ｐＢＲＫ１１４ 设计的引物,可从恶性疟原虫ＤＮＡ 中扩增出２０６ ｂｐ 大小的ＤＮＡ片段,而间日疟原虫、人白细胞ＤＮＡ均无此扩增带出现,并至少可检测出原虫血症为５ ×１０－ ７ 的感染水平,且适用于我国不同地理株恶性疟原虫的检测;滤纸干血滴样本经生理盐水溶血煮沸法处理的ＰＣＲ 扩增效果最为理想,且简易、经济、重复性好;在云南疟疾流行区采集的３６０ 份血样中,ＰＣＲ 法与镜检法符合率为９７ ．５％ 。本研究建立的ＰＣＲ 检测恶性疟原虫方法具有敏感、特异、简易和快速的特点,便于现场推广应用。     

套式PCR扩增特定SSrRNA基因片段诊断间日疟及混合感染的研究

根据间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）小亚单位核糖体核糖核酸（ＳＳｒＲＮＡ）基因序列，设计并合成两对特异引物，采用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增出一条长１２０个碱基对（ｂｐ）的间日疟原虫ＳＳｒＲＮＡ基因特定片段，并并用于云南间日疟患者的血样检测，结果表明，该系统特异性强，除间日疟原虫外，恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）三日疟原虫（Ｐ．ｍ．）及正常人血ＤＮＡ样本均无此扩增带出现，该系统检测原虫的敏感度为０．１个疟原     

恶性疟原虫疫苗研究──Ⅸ．主要裂殖子表面蛋白1C端类表皮生长因子1的体外扩增及克隆

恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白１（ＭＳＰ１）在其分子Ｃ－端ＭＰＳ－１１９具有两个类ＥＧＦ结构,其中类ＥＧＦ－１为特异性抗体抑制疟原虫侵入红细胞的靶位之一。本文通过酚－氯仿抽提,乙醇沉淀法提取恶性疟原虫（ＦＣＣ－１ＨＮ株）基因组ＤＮＡ,再用ＰＣＲ扩增类ＥＧＦ－１基因,经酶切纯化后插入质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）中,转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,经ＰＣＲ筛选及双酶切鉴定,筛选出含类ＥＧＦ－１基因的阳性克隆子。     

恶性疟原虫SSUrDNA特定片段的体外扩增及鉴定

根据已知疟原虫、其它寄生人体原虫及人的小亚单位核糖体核糖核酸基因（ＳＳＵｒＤＮＡ）编码区序列，借助计算机核酸序列软件分析，设计出一对用于恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）ＳＳＵｒＤＮＡ特定片段扩增的引物。采用双温度点聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，从我国Ｐ．ｆ．ＦＣＣ／ＹＮ茅芽株红内期基因组ＤＮＡ中，扩增出约５７０个碱基对（ｂｐ）的ＤＮＡ片段，与预期长度相符；而间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）、利什曼原虫（Ｌ．ｄ．）、弓形虫（Ｔ．ｇ．）及人白细胞ＤＮＡ样本均无此扩增带出现。扩增片段经限制性内切酶消化和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交分析，证实为Ｐ．ｆ．ＳＳＵｒＤＮＡ目的片段。     

恶性疟原虫海南FCC1／HN株有性期特异抗原Pfs25基因的 …

利用ＰＣＲ扩增技术从恶性疟原虫海南ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组中特异扩增编码Ｐｆｓ２５抗原全基因序列，扩增产物经纯化回收后，用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行ＤＮＡ序列测定，结果显示ＦＣＣ１／ＨＮ株Ｐｆｓ２５基因序列与ＮＦ５４株者基本一致，仅在第３９２位碱基存在置换（Ｇ→Ｃ）和该密码子编码的氨基酸的变化（１３１ａａ：Ｇｌｙ→Ａｌａ），进一步的酶切位点分析显示该位点碱基置换产生新的ＰｓｔⅠ酶切位点（３９３）     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３     

聚合酶链反应检测恶性疟原虫的研究

根据编码恶性疟原虫红细胞结合抗原（ＥＢＡ－１７５）的部分ＤＮＡ片段而设计合成寡核苷酸引物并进行多聚酶链反应（ＰＣＲ）以检测体外培养的恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见扩增出了特异的４９２ｂｐ大小的ＤＮＡ片段，而对间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）、食蟹猴疟原虫（Ｐ．ｃ．）、约氏鼠疟原虫（Ｐ．ｙ．）、伯氏鼠疟原虫（Ｐ．ｂ．）及正常人血白细胞ＤＮＡ不能扩增出此片段。本法可检原虫密度下限为２０μｌ血中仅含１０个原虫，具有高敏感性和特异性。     

恶性疟原虫云南株丝氨酸重复抗原部分基因的克隆和序列分析

用ＰＣＲ方法特异性扩增ＳＥＲＡ基因片段，并将该基因片段克隆于Ｍ１３噬菌体，用双脱氧链末端终止法进行测序，应用ＰＣＧＥＮＥ软件对该基因序列进行了分析，结果显示该基因片段长度为４５３ｂｐ，Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ为２．６∶１，符合恶性疟原虫结构基因的特点。同源性分析显示该基因在不同虫株间高度保守，我国ＰＦＤ－３／ＹＮ虫株ＳＥＲＡ基因片段仅与Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３（巴西）株及Ｓ１６（塞内加尔）株在第６６７位氨基酸有不同，与ＦＣＲ３（冈比亚）、ＦＣＢＲ（哥化比亚）、及Ｓ１４、Ｓ１５（塞内加尔）等其它虫株ＳＥＲＡ基因序列完全一致。抗原表位预测分析显示该多肽Ｎ端和Ｃ端可能有抗原表位存在。     

恶性疟原虫云南株丝氨酸重复抗原部分基因的克隆和序列 …

用ＰＣＲ方法特异性扩增ＳＥＲＡ基因片段，并将该基因片段克隆于Ｍ１３噬菌体，用双脱氧链末端终止法进行测定，应用ＰＣＧＥＮＥ软件对该基因序列进行了分析，结果显示该基因片段长度为４５３ｂｐ，Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ为２．６：１，符合恶性疟原虫结构基因的特点。同源性分析显示该基因在不同虫株间高度保守，我国ＰＦＤ－３／ＹＮ虫株ＳＥＲＡ基因片段仅及Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３（巴西）株及Ｓ１６（塞内加尔）株在第６６７位氨基酸有不同     

中国恶性疟原虫MSP1第13～17区基因和MSP2基因的研究

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１（ＭＳＰ１）和２（ＭＳＰ２）是恶性疟虫无性红内期重要的候选疫苗组分，为设计制作安全有效的恶性疟虫疫苗提供理论依据，根据文献报道的恶性疟原虫ＭＡＤ２０ＭＳＰ１和ＦＣ２７ＭＳＰ２ＤＮＡ序列设计并合成两对引物，对中国恶性疟虫云南省勐腊县勐罕分离株ＣＭＨ１／ＹＮ和海南省昌江县ＦＣＣ１／ＨＮ分离株ＭＳＰ１第１３～１７区基因和ＭＳＰ２基因进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增及鉴定，ＰＣＲ产