MHCII类反式激活蛋白调控肿瘤细胞HLA分子的表达

为研究肿瘤细胞MHCII类分子表达及对IFN γ诱导HLA分子表达的反应性与CIITA表达的关系 ,本文采用Westernblot、免疫组化和流式细胞术检测肿瘤细胞HLA分子表达 ,以RT PCR检测肿瘤细胞CIITA基因表达。肿瘤细胞HLAII类分子表达与CIITA表达一致 ;组成性或诱导性表达CIITA的肿瘤细胞 ,经IFN γ作用后其HLAI、II类分子表达增高 ;IFN γ诱导后仍不表达CIITA的肿瘤细胞 ,其对IFN γ促HLA表达的作用不反应。提示 ,某些肿瘤细胞对IFN γ不能诱导HLA分子表达与CIITA诱导性表达缺陷有关。表面CIITA参与调控肿瘤细胞HLAI、II类分子表达。     

转染MHCII类基因对卵巢癌细胞株免疫特性的影响

建立稳定表达CIITA基因的人卵巢癌细胞株HO CIITA ,分析转染CIITA基因对T细胞体外抗肿瘤免疫应答的影响。以CIITA基因逆转录病毒 (pLXSN/CIITA )转染并筛选获得HO CIITA。用FACS和RT PCR分析HLA以及抗原加工递呈基因表达水平。以磁珠法分离得到正常人外周血CD4 +/CD8+T细胞 ,分别进行混合淋巴细胞反应及细胞因子测定 (ELISA和RT PCR )。结果显示 ,转染CIITA基因后 ,使HO细胞HLAII类分子和LMP7基因表达增高 ,而Ii基因表达由阳性转为阴性 ,未检测到TAP1表达 ;HO和HO CIITA细胞刺激CD4 +T细胞分泌IL 4含量两者有显著差异。刺激 4 8h后达到顶峰 ,前者分泌量约为后者的 1/2 ,但分泌IFN γ无差异 ,RT PCR与ELISA两种测定结果一致。表明转染CIITA基因可增加肿瘤细胞表面MHCII类分子的表达 ,该作用与IFN γ具有协同效应 ;并能诱导CD4 +T细胞表达IL 4。     

CIITA反义RNA抑制MHCII类分子表达

为探索利用CIITA (MHCclassIItransactivator)基因反义RNA抑制MHCII类分子表达的可能性 ,为CIITA的应用研究奠定基础。利用RT PCR扩增能与CIITAcDNA第 95至 5 0 0bp互补的片段 ,并构建成pcDNA3/CIITAa 重组质粒 ,脂质体转染法将其转入人HeLa/Raji细胞和猪PIEC/L2 3细胞 ,流式细胞术动态检测反义RNA对人 /猪MHCII类分子的抑制率和抑制程度。结果显示HeLa、Raji、PIEC和L2 3四种细胞MHCII类分子受抑制率分别为 4 6 7% ( 7/ 15 ) ,4 0 % ( 6 / 15 ) ,4 6 7% ( 7/ 15 )和33 3% ( 5 / 15 )。典型受抑克隆细胞MHCII类分子受抑程度高达 85 % ,反义RNA对MHCII类分子的抑制时间持续 35～ 5 0d。CIITA反义RNA能有效抑制人 /猪MHCII类分子的表达 ,它在自身免疫和移植免疫中有一定的应用前景     

CIITA M1-RNA抑制HeLa细胞表面MHC II类抗原的表达

探讨MHC II类转录激活因子(CIITA)的M1-RNA对细胞表面MHC II类分子表达的抑制。M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CIITA第452、629位点的M1-RNA(分别为M1-452-GS、M1-629-GS)及其相应的CIITA靶基因,分别插入pUC19、pGEM-7zf(+)载体,进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作用明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体(psNAV-M1-629-GS,pA629)并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测经典的MHC II类抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)的表达,RT-PCR检测CIITA的mRNA水平。在重组人γ干扰素诱导下,pA629阳性HeLa细胞株表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了83.03%及89.91%;同时CIITA的mRNA含量明显减少(P<0.05)。CIITA的M1-RNA抑制了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHC II类分子的表达,为移植物抗宿主病的研究提供了一种新方法。     

CⅡTA基因编码区不同单倍型cDNA的功能研究

目的 研究MHCⅡ类反式激活因子(cⅡTA)基因编码区非同义单核苷酸多态性(SNP)位点C19170G(Leu45Val)和C30799G(Ala500Gly)构成的4种不同单倍型cDNA的功能.方法 将4种不同单倍型的真核表达载体和卒载体分别转染至HeLa细胞.用RT-PCR和间接细胞免疫荧光技术检测未经转染的HeLa细胞、转染4种真核表达载体及卒载体的HeLa细胞cⅡTA mRNA与3种HLAⅡ类分子(HLA-DR、DP、DQ)的表达,并用流式细胞技术对其表达的3种HLAⅡ类蛋白进行定量分析.结果 未经转染和转染空载体的HeLa细胞均尤CⅡTA mRNA和3种HLAⅡ类分子的表达,而转染4种不同单倍型真核表达载体的HeLa细胞均出现CⅡTA mRNA表达,并表达3种HLAⅡ类分子.证实了转染4种不同单倍型真核表达载体后的HeLa细胞3种HLAⅡ类分子表达水平差异无统计学意义(P均>0.05).结论 中国人CⅡTA基因编码区这两个SNP位点的多态性(2个位点氨基酸的改变)不影响CⅡTA反式激活HLAⅡ类基因表达的能力.     

转染MHCⅡ类基因对卵巢癌细胞株免疫特性的影响

建立稳定表达CIITA基因的人卵巢癌细胞株HO-CIITA，分析转染CIITA基因对T细胞体外抗肿瘤免疫应答的影响。以CIITA基因逆转录病毒(pLXSN/CIITA)转染并筛选获得HO-CIITA。用FACS和RT-PCR分析HLA以及抗原加工递呈基因表达水平。以磁珠法分离得到正常人外周血CD4 ／CD8 T细胞，分别进行混合淋巴细胞反应及细胞因子测定(ELISA和RT-PCR)。结果显示，转染CIITA基因后，使HO细胞HLA Ⅱ类分子和LMP7基因表达增高，而Ⅱ基因表达由阳性转为阴性，未检测到TAP1表达；HO和HO-CIITA细胞刺激CD4 T细胞分泌IL-4含量两者有显著差异。刺激48h后达到顶峰，前者分泌量约为后者的1／2，但分泌IFN-γ无差异，RT-PCR与ELISA两种测定结果一致。表明转染CIITA基因可增加肿瘤细胞表面MHC Ⅱ类分子的表达，该作用与IFN-γ具有协同效应；并能诱导CD4 T细胞表达IL-4。     

MHCⅡ类反式激活因子基因的克隆、鉴定及初步功能测定

目的 克隆MHCⅡ类反式激活因子（class Ⅱ rtansactivator,CⅡTA）基因并进行初步功能测试，为CⅡTA的应用研究奠定基础。方法 RT－PCR扩增CⅡTA基因，将其克隆到pGEM-T载体上并进行酶切和测序鉴定，用EcoRⅡ、XhoⅠ将CⅡTA定向克隆到表达载体pcDNA3上，用脂质体转染法将pcDNA3/CⅡTA转入HeLa细胞；流式细胞术观察细胞表面HLA－DR／DQ的表达变化。结果 成功克隆CⅡTA基因，CⅡTA的转入使HeLa细胞表面表达HLA－DR／DQ分子。结论 转入CⅡTA能使HeLa细胞表面表达MHCⅡ类分子表达，CⅡTA参与调控MHCⅡ类基因的转录和表达。     

CIITA M1-RNA抑制HeLa细胞表面MHC Ⅱ类抗原的表达

探讨MHC Ⅱ类转录激活因子(CIITA)的M1-RNA对细胞表面MHC Ⅱ类分子表达的抑制.M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CIITA第452、629位点的M1-RNA(分别为M1-452-GS、M1-629-GS)及其相应的CIITA靶基因,分别插入pUC19、pGEM-7zf( )载体,进行细胞外切割活性筛选.将细胞外切割作用明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体(psNAV-M1-629-GS,pA629)并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测经典的MHC Ⅱ类抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)的表达,RT-PCR检测CIITA的mRNA水平.在重组人γ干扰素诱导下,pA629阳性HeLa细胞株表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了83.03%及89.91%;同时CIITA的mRNA含量明显减少(P＜0.05).CIITA的M1-RNA抑制了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHC Ⅱ类分子的表达,为移植物抗宿主病的研究提供了一种新方法.     

构建MHCⅡ类分子反式激活因子基因突变体抑制转染细胞HLAⅡ类分子的表达

目的：探讨MHCⅡ类分子反式激活因子（CⅡ\TA）突变体抑制HLAⅡ类分子表达的可能性。方法：构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2、含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3的含起始密码子及NLS（nuclear localization signal)的pcDNA3mCⅡTA4突变体。用脂质体转染法将上述3种突变体及pcDNA3空载体转入HeLa细胞和的Raji细胞。用流式细胞术和RT－PCR法观察它们对HeLa/Raji细胞HLA－DR／DQ分子的诱导性和组成性表达的影响。结果：在细胞和基因水平证实pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4对HeLa/Raji细胞HLA－DR／DQ的表达起明显抑制作用，而pcDNA3mCⅡTA2和pcDNA3空载体无此作用。结论：成功构建的pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mⅡTA4能抑制HLAⅡ类分子的表达。     

CIITA锤头状核酶的克隆及其体外活性

通过CIITA核酶抑制HeLa细胞表面MHCⅡ类分子的表达。设计并合成针对人类CIITA的核酶Rz464,通过体外转录和切割实验鉴定其活性。将Rz464亚克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP(pRz464),并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测MHCⅡ类抗原表达,RT-PCR检测CIITA mRNA水平。结果表明,Rz464与CIITA靶序列体外切割产物电泳见预期切割条带。pRz464~+HeLa细胞与对照组比较,HLA-DR、DP、DQ抗原诱导型表达分别降低了79.21%、90.31%及48.30%;同时CIITA的诱导型mRNA含量明显减少。Rz464通过切割CIITA mRNA,进而阻止了后者调控的MHCⅡ类分子的表达。     

PAK2真核表达载体的构建及在胃癌细胞内的表达与定位

目的 构建PAK2真核表达载体及证实在胃癌细胞内的表达与定位.方法 提取HeLa细胞的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增PAK2全长编码基因,克隆至pcDNA3.1A表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,Western blot检测蛋白表达,免疫荧光检测PAK2在胃癌细胞内的定位.结果...     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建peDNA3．1（-）／NNMT（尼克酰胺-N-甲基化酶）真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1／NNMT重组质粒中克隆得到NNMT cDNA全长序列,并将扩增的eDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（-）中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT—PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功．经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达

目的 构建pcDNA3．1介导的诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的基因表达载体和pcDNA3．1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型（CVB3）结构蛋白VP1融和基因的表达载体。方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3．1-iNOS和pcDNA3．1-iNOS—VP1表达载体；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定。结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3．1；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2．1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3．1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iN—OS—VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iNOS．VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。结论 获得含iNOS基因和iNOS—VP1融合基因的真核表达载体，并将重组质粒进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。     

小鼠白细胞介素21 cDNA的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆小鼠自细胞介素2l(IL-21)基因，构建真核表达质粒，用以进行肿瘤的基因治疗。方法：用RT-PCR法。从ConA活化的小鼠T细胞中扩增IL-21 cDNA。克隆人哺乳动物细胞高效表达质粒pcDNA3．1中，构建重组mIL-21真核表达质粒。重组体用载体上的通用引物和PCR下游引物为测序引物，鉴定克隆的正确性。将已鉴定的重组质粒用脂质体法转染Sp2／0细胞，用RT-PCR法鉴定转染细胞中IL-21基因的表达，用MTT比色法检测表达的mIL-21诱导的NK细胞杀伤活性的增强。结果：正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，并在转染的细胞中检测出IL-2l的表达，表达的mIL-21可在体外增强NK细胞的杀伤活性：结论：成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，为进一步在肿瘤动物模型中进行IL-21基因治疗及疗效观察奠定了基础.     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因乳腺定位表达载体的构建及表达

目的:将人α-防御素-1(α-HNP-1)基因与山羊β-乳球蛋白(Beta-Lac-toglobulin,BLG)基因5’调控区序列融合,构建α-HNP-1基因的乳腺定位表达载体并对其进行检测。方法:用PCR方法获得α-HNP-1基因片断并克隆于pMD18-T载体,经DNA测序证实α-HNP-1基因序列无误后,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1-HNP-1重组质粒。用PCR方法扩增出BLG基因5’区调控序列并克隆到pcD-NA3.1-HNP-1中,构建乳腺定位表达载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1,该载体经脂质体包裹后,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠乳腺中进行表达。结果:经酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1构建正确,经ELISA检测,大鼠乳汁中有α-HNP-1表达,其48h表达量为27.67ng/ml,72h表达量为49.00ng/ml。结论:成功构建了α-HNP-1基因乳腺定位表达载体并最终在乳腺获得一定量表达,说明乳腺导管注入法是一种较理想的评价乳腺特异表达载体的可行性方法。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于?-淀粉样多肽的异常。  目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。 方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0 kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。 结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的：构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（alllastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin，并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法：提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3．1（＋）中，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin。以pcDNA3．1-amastin转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3．1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果：在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光，表明pcDNA3．1-amastin成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后，用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因，表明获得了稳定表达。结论：成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒，并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。     

人CD81的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 从人外周血淋巴细胞中克隆出CD81基因，构建真核表达质粒，并在COS－7细胞中进行表达。方法 分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，采用RT－PCR扩增CD81基因。将CD81基因克隆至载体pcDNA3.1( )中，进行酶切及测序鉴定。以质粒pcDNA3.1-CD81转染COS－7细胞进行瞬时表达，并用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测蛋白的表达。结果 RT－PCR产物已插入载体pcDNA3.1( )构建成真核表达质粒pcDNA3.1-CD81。经双酶切和测序鉴定表明，克隆出的人CD81全长编码序列同GenBank收录的序列一致，并且真核表达质粒的构建正确。以脂质体转染COS－7细胞后，用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测表明，细胞可表达人CD81。结论 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-CD81，为进一步研究HCV和CD81的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型打下了基础。     

MMP-13基因真核表达载体的构建及其功能研究

目的为了研究MMP-13蛋白在瘢痕形成的作用,我们构建MMP-13基因真核重组表达质粒,检测并鉴定了MMP-13基因在转染了重组质粒的皮肤角质形成细胞HaCat中的表达。方法通过RT-PCR方法将MMP-13基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建其真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)/MMP-13,基因测序鉴定。重组质粒以阳离子脂质体2000介导转染HaCat细胞,RT-PCR检测外源基因的表达,间接免疫荧光和Western blot检测外源蛋白的表达。以明胶酶谱法和MTT法分别检测MMP-13的活性以及其对HaCat细胞增殖的影响。结果通过RT-PCR检测到MMP-13基因在重组质粒转染后的HaCat细胞中大量表达,以间接免疫荧光反应和Western blot可检测到MMP-13蛋白在在重组质粒转染后的HaCat细胞中呈阳性,明胶酶谱法和MTT法检测显示真核表达质粒pcDNA3.1(+)/MMP-13表达的MMP-13蛋白具有活性,并且可以抑制HaCat细胞的增殖。结论构建的重组质粒pcDNA3.1(+)/MMP-13能在Hacat细胞中表达活性蛋白MMP-13,并可以抑制HaCat细胞的增殖,这为研究MMP-13在瘢痕形成中的作用奠定了基础,从而为瘢痕治疗提供有效靶标。     

β-淀粉样蛋白真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建β-淀粉样蛋白真核表达质粒,为进一步开展老年性痴呆DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR扩增β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)基因,用限制性内切酶KpnⅠ/XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3.1酶切,将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切初步鉴定后进行序列测定。结果特异扩增出Aβ1-42片段,大小为126bp,片段成功插入pcDNA3.1载体中。经双酶切及序列测定结果表明Aβ1-42目的基因正确重组入pcDNA3.1载体中。结论成功构建Aβ1-42真核表达质粒。