一种简便且灵敏的核酸杂交新方法——地高辛配基标记探针细胞原位杂交法应用于癌基因表达研究

肿瘤细胞由多聚甲醛直接固定在硝酸纤维素膜上,经蛋白酶消化后与地高辛配基(di-goxigenin)标记的癌基因探针进行DNA-RNA杂交,洗膜后用酶联免疫法显色,可以半定量的确定癌基因在肿瘤细胞中的表达状况。该方法不需提取RNA,因此操作简便易行。由于利用地高辛配基标记探针,克服了同位素放射性和蜕变带来的诸多不便。实验将此法用于肺癌细胞经诱导分化后癌基因表达改变以及白血病细胞中癌基因表达情况研究,5×10~3个细胞即可获得阳性杂交信号。     

PCR制备地高辛配基标记的探针检测登革病毒核酸

用聚合酶链反应(PCR)技术,以重组质粒PDEⅡ305 DNA为模板,在底物中补充标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(DIG-dUTP),经扩增反应制备了地高辛配基标记的登革病毒2型(DEN_2)cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针有DEN_2型特异性,可检出0.1Pg DEN_2-RNA。PCR扩增标记只用10 ng模板DNA,数小时内可制备约Iug标记的cDNA探针,而用六聚核苷酸随机引物(RHP)标记,从质粒DNA酶切、片段回收到标记获得探针,至少需数10 h。可见PCR技术直接制备地高辛配基标记的cDNA探针较方便,快速、标记率高、特异性强,具有一定的应用前景。     

地高辛配基标记HBV DNA探针的制备和应用研究

应用随机引物法制备地高辛配基标记的 HBV DNA 探针,其检测灵敏度为0.1pg;以~(32)P-HBV DNA 探针为金标准,地高辛配基标记探针的敏感性、特异性和准确度分别为96.2％、98.7％和98.1％;在一20℃贮存,地高辛配基标记探针的灵敏度在12月内不变;探针回收重复使用4次效果不受影响;应用于斑点杂交检测1400余份血清标本及原位杂交检测200余份肝组织标本均取得满意效果。     

PCR制备地高辛配基标记的探针检测登革病毒核酸

用聚合酶链反应(PCR)技术，以重组质粒PDEⅡ305 DNA为模板．在底物中补充标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(DIG-dUTP)，经扩增反应制备了地高辛配基标记的登革病毒2型(DEN2)cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针有DEN2型特异性，可检出0．1pgDEN2-RNA。PCR扩增标记只用10ng模板DNA，数小时内可制备约1ug标记的cDNA探针，而用六聚棱苷酸随机引物(RHP)标记，从质粒DNA酶切、片段回收到标记获得探针，至少需数10h。可见PCR技术直接制各地高辛配基标记的cDNA探针较方便，快速、标记率高、特异性强，具有一定的应用前景。     

地高辛配基标记HBV DNA探针与生物素标记探针用于肝组织原位杂交的探讨

作者应用地高辛配基标记HBV DNA探针进行原位杂交,检测16例(重症肝炎10例、HBsAg阳性3例、非肝脏疾病3例)肝组织标本内HBV DNA。结果表明:HBV DNA阳性物质在肝细胞内的分布有全胞浆型、包涵体型、全胞核型及核仁-核膜型4种方式。进一步说明地高辛配基标记探针原位杂交可以在一定程度上反映HBV DNA在细胞内的存在状态。作者将地高辛配基标记HBV DNA探针原位杂交与生物素标记探针进行比较,结果前者较后者灵敏度高、特异性强、实用性好,是理想的检测HBV DNA的新一代非同位素探针。     

P~(53)、mdm2和neo基因探针的制备与应用

为研究P~(53),mdm2基因在肿瘤细胞中的表达与调控作用,将克隆于质粒载体中的P~(53),mdm2和neo基因分别用双酶切得到P~(53),mdm2,cDNA和neo基因片段,采用地高辛随机引物法标记探针,用于转染含P~(53)和mdm2基因的肺腺癌GLC-82细胞中DNA和RNA斑点杂交,以及肿瘤细胞中P~(53)和mdm2基因的检测。结果显示,以neo基因为探针的DNA斑点杂交中转染P~(53)和mdm2的细胞出现阳性信号,GLC-82亲本细胞为阴性,表明转染成功。以P~(53),mdm2,cDNA为探针的RNA斑点杂交中转染P~(53)和mdm2的细胞出现阳性信号,提示P~(53)和mdm2在细胞中获得表达。地高辛标记探针具有简单、快速、特异性强、灵敏度高、无污染等特点,有推广应用价值。     

PCR法快速制作地高辛配基标记的人型结核杆菌DNA探针

该文探索了用PCR法快速制作地高辛配基标记的DNA探针的方法．证明可靠、安全、快速。对结核病防治而言，找到了一种优于结核培养的查菌方法；对其他需DNA探针的情况而言，该文探索到一种快速制作法。     

DNA探针的PCR标记法

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ片段进行地高辛配基标记制备探针，与经典的随机引物标记法相比较，ＰＣＲ标记法能使探针产量明显提高，而且快速、经济，值得进一步应用和探讨。     

DNA探针的PCR标记法

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ片段进行地高辛配基标记制备探针，与经典的随机引物标记法相比较，ＰＣＲ标记法能使探针产量明显提高，而且快速、经济，值得进一步应用和探讨。     

地高辛配基标记HPV6、11、16、18型探针的制备和鉴定

地高辛配基标记ＨＰＶ６、１１、１６、１８型探针的制备和鉴定王云飞，刘佩莉，俞顺章，林玉纯（上海医科大学公共卫生学院流行病学教研室，中国医学科学院肿瘤研究所病毒室）随着分子生物学技术的发展，用特定的探针直接检测组织核酸中病毒的存在已成为可能。目前探针的...     

用地高辛配基标记DNA探针及其应用

核酸杂交技术中,同位素标记DNA探针是最常用的技术,其优越性是检测灵敏度高,但同时有很多缺点。80年代初,Langer等开始用生物素标记多核苷酸探针。随着方法的不断完善,近年来已用于基因诊断、定位及表达等研究。本文报道一种新的非同位素标记技术,即用地高辛配基(digoxigenin-dUTP)标记DNA探针,其原理是具有类固醇半抗原性质的地高辛配基,通过随机引物(random pr-imer法)掺入到DNA上,与靶DNA进行碱基互补同源序列结合形成杂交产物,然后通过酶联免疫法与     

地高辛配基标记的DNA探针在武汉（Wu）T系列单抗制剂质量控制中的应用

地高辛配基标记的ＤＮＡ探针在武汉（Ｗｕ）Ｔ系列单抗制剂质量控制中的应用邬义安，陈群，陈善华卫生部武汉生物制品研究所武汉４３００６０关键词地高辛配基；限制性内切酶；ＤＮＡ分子杂交；单克隆抗体中图法分类号Ｒ９７２，Ｒ３９２．１１武汉（Ｗｕ）Ｔ系列单克隆抗...     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒DNA方法的建立及应用

目的 :建立碱性磷酸酶直接 (AlkPhosDirec)标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸 (DHBVDNA)方法。方法 :应用AlkPhosDirec[TM] 将碱性磷酸酶直接标记纯化的DHBVDNA全基因制备探针 ,与目标核酸杂交后加入CDP -Star化学发光试剂 ,用胶片放射自显影检测DHBVDNA。同时检测了探针的灵敏度和特异性。比较了AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针与地高辛标记的DHBVDNA探针检测鸭血清标本 10 0份结果。并用AlkPhosDirec标记探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸的方法考核了活性肽类物质保尔佳 (Polyerga)及其 8种单体体内抗鸭乙型肝炎病毒作用。 结果 :探针灵敏度为10 pg ,无非特异性的结果出现 ,与地高辛探针比较 ,用AlkPhosDirect标记探针检测方法的敏感性为 10 0 % ,特异性为 10 0 % ,符合率为 10 0 % ;抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验表明 ,保尔佳 0 0 1号单体 (CMS0 0 1)能使血清中DHBVDNA明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸方法灵敏、特异 ,与地高辛标记的DHBVDNA探针检测结果完全相符合 ,可作为药物抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验疗效评价的手段。     

地高辛配基标记DNA探针检测HLAⅡ类基因技术的建立

本文报道了采用序列特异性寡核苷酸探针杂交(SSOPH)检测HLAⅡ类基因(DRB、DQB)多态性的方法。实验包括少量全血提取模板DNA、PCR基因扩增基因多态性区域片断、尼龙膜点样、特异性寡核苷酸探针合成及地高辛配基(DIG-11-ddUTP)标记、探针杂交;条件洗涤、化学发光显影等一系列步骤。该实验方法具有用血量少、结果精确稳定、操作简便安全、不污染环境等优点。作者对模板DNA的提取、杂交缓冲液制备、标记探针的使用剂量以及条件洗涤等多个环节作了改良,使实验方法和结果进一步优化。     

非同位素标记pAW101探针作人流胚胎组织的亲权鉴定

DNA限制性片段长度多态性(RFLPs)技术的经典方法是用酚抽提DNA,同位素标记探针。本文研究选用N_aCI盐析分离DNA的技术,结合地高辛配基标记pAW101探针方法,作了11例无争议的胚胎组织的亲权鉴定,同时测定4种同Ⅰ酶型,在不违反孟德尔遗规律的前提下,按Essen-Moller公式计算父权概率(均>99.73％),达到确定亲生关系的标准。本方法简单、易于掌握,结果稳定可靠,适宜于一般实验室开展工作。     

用地高辛配基标记DNA探针及其应用(简报)

近年来,非同位素标记技术已广泛用于基因诊断、定位等领域.国内也已开展了本项工作.本文采用国内尚未见报道的一种新的标记法,即用随机引物(random primer)法将地高辛配基标记到DNA上.可提高标记效果及检测灵敏度.本法最小检测灵敏度和最小杂交检出量分别为50fg和0.78Pg.并具有专一的特异性.本法标记3’HVR多拷贝探针和βIVSⅡ单拷贝探针分别检测不同浓度人基因组DNA.经     

地高辛标记核酸病理形态学检测方法的建立及应用

目的建立地高辛标记原位杂交(ISH)和原位PCR(ISP)方法,探讨其在病理形态学检测中的应用。方法以细胞cDNA或质粒DNA为模板制备地高辛探针,ISH检测肺癌、胃癌或结直肠癌切片上JCV T抗原DNA、beclin 1和SERCA3 mRNA表达水平。在肺癌和胃癌切片上扩增地高辛标记的JCV T抗原DNA。杂交或标记后,进行抗地高辛碱性磷酸酶反应并行NBT/BCIP或Fuchsin显色。结果 PCR扩增获得高纯度地高辛标记DNA探针,甲酰胺杂交液杂交显示JCV T抗原存在于JCI细胞的细胞核中,beclin 1和SERCA3 mRNA阳性信号见于结肠癌和癌旁黏膜上皮细胞质中。ISP扩增了地高辛标记的JCV T抗原DNA,显色后发现JCV T抗原主要定位在JCI细胞、肺泡上皮细胞和肺癌细胞核、胃癌及癌旁黏膜细胞核中。NBT/BCIP显色比Fuchsin显色更为敏感,甲基绿复染使得上述2种显色更加清晰。结论地高辛标记的ISH和ISP操作简便,敏感度高,NBT/BCIP显色和甲基绿复染图像美观。     

地高辛标记探针检测卫氏并殖吸虫的方法

目的 制备卫氏并殖吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I(COI)基因和核糖体DNA第二间隔区(ITS2)地高辛标记探针,探讨其对并殖吸虫的种别鉴定和诊断的作用. 方法 利用引物分别体外扩增获得卫氏并殖吸虫目的基因后凝胶电泳鉴定并且胶回收纯化上述两个基因片段.将酶切后的COI基因和ITS2基因回收,地高辛标记成探针,尼龙膜上行斑点杂交观察. 结果 COI探针有较好的特异性和敏感性.ITS2探针缺乏特异性. 结论 尼龙膜斑点杂交结果显示卫氏并殖吸虫的COI基因片段可以作为种群鉴定的后备探针.     

DIG—DNA探针检测宫颈癌组织中HPV—16的E7转化基因

应用地高辛配基（Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ标记人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ－１６）Ｅ７转化基因作探针，分别检测了宫颈癌活检组织、宫颈炎及正常宫颈脱落细胞ＮＤＡ。其检率为：宫颈癌中４２．１％（２４／５７）、宫颈为中２．５％（１／３９）、正常宫颈中５．５％（１／１８）。宫颈组织中ＨＰＶ－１６Ｅ７转化基因的检出率较高，提示该转化基因与宫颈癌的发生可能密切相关。本研究也证实ＤＩＧ配基标记的Ｅ７基因探针具有特异、     

小鼠性决定基因SRY探针的制备

目的 研究制备地高辛标记的小鼠性决定基因SRY探针,用于检测小鼠体内SRY基因表达的研究。方法 按已知的雄性小鼠Y染色体上性决定蛋白基因(SRY)的序列,请上海博亚公司合成四条oligoDNA,采用PCR技术连接并扩增,地高辛标记的方法制备基因探针。结果 用细胞原位杂交方法证实这种探针具有较高的敏感性和特异性。结论 小鼠性决定基因SRY探针的制备成功为进一步研究异体雄性小鼠骨髓移植到雌性小鼠体内后的分布和表达提供了实验基础。