IL-13抑制人肾小球系膜细胞IL-12的表达

为了探讨白细胞介素 13(IL 13)对体外培养的人肾小球系膜细胞产生白细胞介素 12 (IL 12 )的影响。我们用脂多糖(LPS 10 μg/ml) ,不同浓度的IL 13对系膜细胞培养 ,分别采用ELISA法和半定量RT PCR法检测细胞上清液的IL 12和系膜细胞IL 12p4 0mRNA表达。结果提示 5 %NCSRPMI 16 4 0基础培养条件下的系膜细胞未检测到IL 12蛋白分泌及其mRNA表达。在LPS刺激下系膜细胞的IL 12p4 0mRNA表达加强 ,并分泌出大量的IL 12。IL 13在 1～ 10 0ng/ml浓度范围内对LPS诱导的系膜细胞IL 12分泌及IL 12p4 0mRNA表达的抑制作用呈剂量依赖趋势。本研究认为IL 13可能通过抑制IL 12的产生 ,而调整了体内Th1/Th2细胞因子平衡 ,作为抗炎性细胞因子在肾小球肾炎发病机制中发挥一定作用     

重组人IL-11的原核表达、纯化和鉴定

以本实验室构建的pET24a-hrIL-11表达载体为模板,PCR扩增重组人白细胞介素11(hrIL-11)的基因,克隆入pET21a表达载体,转化BL-21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生hrIL-11/His融合蛋白,并经Western blot实验确认。原核表达的hrIL-11/His融合蛋白经变性后,利用亲和层析纯化,目的蛋白纯度达95%以上。纯化后蛋白经尿素梯度复性后,比活达到1×106 IU/mg。研究结果为进一步研究该蛋白在促进血小板增殖等方面的作用奠定了基础。     

小鼠白细胞介素17A的克隆、表达及活性鉴定

目的:克隆小鼠白细胞介素17A(mIL-17A)基因,构建mIL-17A原核表达质粒在E.coil Rosetta(DE3)PlysS表达,得到有活性的mIL-17A蛋白。方法:提取人IL-1β免疫的小鼠胸腺总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-17A序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-17A的编码序列并构建到pMD18-T载体中,再亚克隆至原核表达载体pHisSUMO Express中,经DNA测序鉴定后转化Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,Western blot鉴定。纯化后的蛋白处理3T3-L1前体脂肪细胞,real time PCR鉴定白细胞介素6(IL-6)的表达变化。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致。成功构建了pHisSUMO Express-mIL-17A原核表达质粒以包涵体形式表达了重组mIL-17A蛋白,且Western blot证实为目的蛋白。所得蛋白上调3T3-L1细胞表达IL-6。结论:获得具有生物活性的mIL-17A蛋白,为进一步研究其蛋白特性及其生物活性奠定基础。     

人白介素1受体拮抗剂的cDNA克隆和原核表达

从活化的正常人外周血单核细胞中提取总ＲＮＡ，经逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获得了人白介素１受体拮抗剂（ＩＬ－１Ｒａ）ｃＤＮＡ。经过ＤＮＡ测序分析，发现该片段和国外发表的ＩＬ－１ＲａｃＤＮＡ序列一致，将该目的基因插入ｐＢＶ２２０载体，并转入大肠杆菌ＨＢ１０１中，经热诱导表达重组蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后发现，菌体超声裂解后，在可溶性上清中有一Ｍ１７０００的特异带，约占菌体可溶性总蛋白的８０％以上     

重组人白细胞介素12基因在CHO—dhfr^—细胞的稳定表达

将分别含有重组人ＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）两个亚单位ｃＤＮＡ的真核细胞高效表达载体，通过Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导，共转染至ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞中。经选择性培养基培养、细胞染色体ＤＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ实验、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验鉴定，筛选出能表达ｒｈＩＬ－１２的细胞株，经氨甲喋呤加压诱导，表达量约为１５０ｕ／ｍｌ，且经液氮冻存３ｍｏ以上仍有表达。本实验还研究     

小鼠体内RU486诱导的及肝脏特异性的IL-12基因表达

目的 研究含有RU486调控系统质粒的可诱导能力.方法 通过水流动力学注射的方法,将含有RU486调控系统、肝脏特异性启动子以及转基因IL-12的质粒pRS22注射到小鼠体内,质粒注射后不同时间点腹腔注射RU486.通过ELISA试剂盒检测血清中IL-12表达水平,通过PCR、RT-PCR以及免疫组织化学染色的方法,在DNA、RNA及蛋白质水平测试质粒pRS22在小鼠体内的可诱导性表达.结果 为了确定质粒pRS22活性的持续时间,在水流动力学注射10μg质粒后,每7天给小鼠注射1次RU486(250μg/kg),发现尽管每次诱导后血清中IL-12的水平逐渐下降,但直到质粒注射后第15周,仍然可以被诱导表达.为了测试不同诱导方式对IL-12表达趋势的影响,5μgpRS22被注射到小鼠体内后,在6d内分别每天或每两天给小鼠注射1次RU486.结果每两天诱导1次后IL-12表达呈波浪形,而每天诱导1次则可获得持续的IL-12表达.PCR和RT-PCR结果显示,无论有无RU486诱导,都能在肝脏检测到pRS22质粒及GLp65调节子mRNA的表达,但是仅能够在接受RU486的小鼠肝脏中观察到IL-12 p35亚基mRNA表达.免疫组织化学染色结果提示,IL-12蛋白只有在RU486作用下才会在肝细胞中表达.结论 在肝脏特异性启动子TTR控制下,RU486调控系统能够在时间和空间上精确控制转基因IL-12的表达.     

LPS和IL-13影响系膜细胞表达IL-12的研究

目的：探讨脂多糖（LPS）及IL-13对系膜细胞表达IL-12的影响作用。方法：用酶联免疫吸附（ELISA）法检测LPS对系膜细胞分泌IL-12的影响，实验分组：①LPS（20μg／ml）对系膜细胞刺激不同时间；②不同剂量LPS刺激系膜细胞24小时。用ELISA法和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法分别检测IL-13对系膜细胞IL-12蛋白和IL-12p40 mRNA表达的影响，分空白对照组，LPS（10μg／ml）刺激组及实验组（LPS 10μg／ml＋不同浓度的IL-13）。结果：未受LPS刺激的系膜细胞几乎不分泌IL-12，在一定的剂量范围内，LPS诱导系膜细胞显著表达IL-12，但随着LPS刺激时间及浓度的增加，IL-12的表达量反而减少。IL-13在1。100μg／ml浓度范围内呈剂量依赖性抑制LPS诱导的系膜细胞IL-12分泌及其mRNA表达（P〈0．01）。结论：LPS可诱导系膜细胞表达IL-12，但系膜细胞在表达IL-12时对LPS的长期及高浓度刺激产生耐受性。IL-13可能通过抑制LPS诱导系膜细胞分泌IL-12，作为抗炎性细胞因子在肾小球肾炎发病机制中发挥一定作用。 12；系膜细胞     

IL-12双亚基共表达载体的构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

 目的 构建人 IL-12（hIL-12）p40 和 p35 双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）。方法 根据 hIL-12 p40 和 p35 亚基全长 cDNA 序列分别设计合成引物行 PCR 扩增，将扩增所得 p40 和 p35 片段采用 overlap PCR 法拼接，获得的 rhIL-12 融合基因与 pGEM-T Easy 质粒连接，将鉴定正确的 pGEM-T/rhIL-12 重组质粒克隆至 pcDNA3.1（+）真核表达质粒中，构建 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 真核表达载体，并进行测序鉴定。将鉴定正确的 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 经脂质体介导转染 hMSC，同时以转染 pcDNA3.1（+）空质粒作为对照组，在倒置显微镜下观察细胞生长形态；在转染后第 4 天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中 rhIL-12 融合基因的表达；另分别在转染后第 2、4、6、8、10、12、14 天，采用 ELISA 方法检测细胞培养上清液中 rhIL-12 融合基因的表达水平。 结果 PCR 扩增结果显示特异性扩增出 p40（1000 bp）、p35（600 bp）、rhIL-12（1600 bp）片段，均与预期 DNA 表达片段大小一致。pcDNA3.1（+）/rhIL-12 测序显示克隆的 rhIL-12 基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察，可见转染 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 的 hMSC 生长形态和生长速度与对照组 hMSC 相比均无明显差异。蛋白质印迹和 ELISA 检测显示，转染 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 的 hMSC 培养上清液中可见 rhIL-12 融合蛋白的持续表达；而对照组中均未检测到 rhIL-12 融合蛋白表达。 结论 成功构建了 hIL-12 p40 和 p35 双亚基真核共表达载体 pcDNA3.1（+）/rhIL-12，为利用 hIL-12 进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。     

IL-12基因不同亚基真核表达载体的构建及表达

目的:克隆并构建含人白介素12(hIL-12)基因p35、p40不同亚基的真核表达载体,瞬时转染真核细胞并诱导IL-12的表达。方法:人单核细胞白血病细胞株(THP-1)和人白血病细胞株(HL-60),经DMSO、IFN-γ和LPS诱导后,用RT-PCR及SOEPCR扩增IL-12p40、p35及p40-p35融合基因;并构建pcDNA-p35、pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达载体。以3种重组质粒分别瞬时转染COS-7细胞后,通过RT-PCR及ELISA法检测目的基因的表达。结果:经诱导后,从HL-60细胞中扩增到IL-12p40和p35基因片段;但从THP-1细胞中只扩增到p35基因片段,未能扩增到p40基因片段;经酶切鉴定、PCR扩增及序列测定表明pcDNA-p35、pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达质粒构建成功;并在COS-7细胞中可检测到IL-12的表达。结论:含hIL-12基因不同亚基的真核表达质粒的成功构建,对进一步研究IL-12在免疫应答中的调节作用以及作为免疫佐剂改善BCG免疫保护效果的研究奠定了基础。     

人可溶性IL-6R及其突变体基因在COS7细胞中的表达及活性分析

目的 研究人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｈｓＩＬ－６Ｒ）的空间构效关系，为小分子拮抗设计提供理论依据。方法：首先利用ＰＣＲ技术扩增天然人ｓＩＬ－６Ｒ基因片段，然后将第２８０位Ｈｉｓ残基突变成Ｉｌｅ。天然基因和突变体基因分别转染ＣＯＳ７细胞，经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｂｌｏｔ检测证实转染细胞上清中的表达产物，并利用ＢｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙＥＬＩＳＡ和生物学功能分析法检测表达产物与ＩＬ－６的结合能力以及它们所介     

IL—12以及IL—12P40对子宫内异症患者NK细胞功能的免疫调节

目的通过观察正常人及子宫内膜异位症(EM)患者外周血及腹腔液中IL-12、IL-12P40含量变化,分析其分子诱导NK细胞对子宫内膜细胞的细胞毒效应的影响,探讨IL-12、IL-12P40分子与EM患者NK细胞功能低下的相关性.方法ELISA酶联免疫检测IL-12、IL-12P40含量以及MTT释放法检测NK细胞毒活性.结果①EM患者腹腔上清液可使正常人外周血NK细胞杀伤活性(16.80%±3.6%)明显下降(8.37%±4.5% )(P＜0.05).② EM患者IL-12含量血清为66.38±12.6 pg/ml,低于对照组84.97±13.7 pg/ml(P＜0.05);腹腔液中为77.76±14.6 pg/ml,低于对照组106.92±10.7 pg/ml(P＜0.05).③EM患者IL-12P40含量血清为35.64±10.6 pg/ml, 与对照组无明显差异;腹腔液含量为79.76±12.6 pg/ml, 高于对照组40.54±10.0 pg/ml(P＜0.05), 并与疾病的程度呈负相关.④IL-12能增强NK细胞对子宫内膜细胞的杀伤,并呈剂量依赖.在10 ng/ml浓度诱导后杀伤率为31.90%,高于对照组的16.80%.⑤IL-12P40能拮抗IL-12对NK细胞活性的诱导,当加入IL-12P40后,使IL-12诱导的活性(29.3%)下降为19.36%.结论子宫内膜异位症患者腹腔液中IL-12P40含量的增高可能与NK细胞功能下降有关.     

IL-4对DC产生IL-12影响的研究

为了研究白细胞介素 4 (IL 4 )对树突状细胞 (dendriticcell,DC )产生白细胞介素 1 2 (IL 1 2 )p70的调节作用及其机制 ,将小鼠骨髓细胞在含GM CSF和IL 4的培养液中培养 6d ,加入成熟诱导剂脂多糖 (LPS )或TNF α、CpG ODN继续培养 2d以获得成熟DC。流式细胞仪检测DC表面CD80和MHCII类分子 ,混合淋巴细胞反应检测DC促进同种异体T细胞增殖的能力 ,ELISA法检测不同诱导剂诱导DC产生IL 1 2p70的能力 ,RT PCR和荧光定量PCR检测IL 1 2p35和p4 0mRNA的表达及其变化。结果显示小鼠骨髓细胞在含GM CSF、IL 4和成熟诱导剂的培养液中培养后可以获得成熟的DC ,成熟DC高表达CD80和MHCII类分子 ,具有较强的刺激同种异体T细胞增殖的能力 ,LPS、CpG ODN、TNF α、PolyI:C在促进DC成熟的同时能诱导DC产生有活性的IL 1 2 ,IL 4对IL 1 2的产生具有明显的促进作用 ,RT PCR和荧光定量PCR结果显示LPS诱导IL 1 2产生以及IL 4对其的促进作用与IL 1 2p35基因的转录水平增高有关     

CD40L-expressing CD8 T cells prime CD8alpha(+) DC for IL-12p70 production

CD8alpha(+) DC are implicated as the principle DC subset for cross-presentation and cross-priming of cytotoxic CD8 T cell responses. In this study, we demonstrate another unique facet of the CD8alpha(+) DC and CD8 T cell relationship, by showing that CD8 T cells reciprocally activate CD8alpha(+) DC, but not CD8alpha(-) DC, for IL-12p70 production, the key Th1-promoting cytokine. This effect was observed during an antigen-specific interaction between DC and activated CD8 T cells, along with secondary TLR stimulation of DC by LPS. Activated CD8 T cells use a combination of IFN-gamma and CD40L, which is rapidly up-regulated post-stimulation, to prime DC for IL-12p70 production during an antigen-specific response. Our results suggest that the interaction between CD8alpha(+) DC and antigen-primed CD8 T cells may form an important component of Th1-mediated immunity through the induction of IL-12p70.     

Triptolide inhibits IL-12 production and T cell-stimulatory capacity of dendritic cells

Extracts of Tripterygium wilfordii Hook F.(TWHF ) are effective in traditional Chinesemedicine for treatment of autoimmune diseasessuch as rheumatoid arthritis, systemic lupus ery thematosus, nephritis and asthma [1, 2]. Trip tolide, a diterpenoid triepoxide, is derived fromTWHF and is responsible for most of the immuno suppressive and anti inflammatory effects ofTWHF. Triptolide has been shown to be effectivein the treatment of autoimmune diseases, …