rDNA ITS区间PCR-RFLP在腐霉属11菌株快速鉴别中的应用

目的：将灭蚊腐霉Pythium sp.与从猝倒、茎腐植株分离到的9个病原真菌相鉴别。方法：以瓜果腐霉作阳性对照。以ITS1和ITS4为引物，采用PCR方法对待测菌株的rDNA ITS区进行了扩增，再用4种限制性内切酶（TaqⅠ，HinfⅠ，Hin6Ⅰ，MboⅠ）进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳后得到RFLP图谱，利用Nei et al的片段比较方法计算菌株间相似程度，NTSYS-PC软件包进行聚类分析。结果：对11个菌株进行了快速鉴别，证明从受感染的植物菌株上分离到的真菌主要是瓜果腐霉，与灭蚊腐霉Pythium sp.有明显区别。结论：rDNA ITS区的PCR-RFLP可用于真菌的快速鉴别。     

实验动物皮肤病原真菌核酸鉴定方法的建立

目的选择一种快速、敏感和特异的方法来检测实验动物皮肤病原真菌.方法选取真菌CHS1基因中一段序列设计皮肤真菌通用引物和选取一种随机引物FM1,利用聚合酶链反应（PCR）扩增三种动物皮肤病原真菌标准株：须毛癣菌、石膏样小孢子菌、犬小孢子菌.结果两种引物扩增产物片段大小在三种真菌之间有明显不同.结论本实验方法可快速特异性检测实验动物皮肤病原真菌.     

应用rDNA ITS测序检测海南岛条件致病性真菌

目的:应用内转录间隔区(ITS)引物建立一种较为敏感、特异检测和鉴定条件致病性真菌的方法,为进一步鉴定不同真菌的种、型的亲缘关系提供分子生物学依据。方法:用常规的真菌检验方法对76份口腔标本做初步鉴定,采用通用引物ITS1、ITS4对可疑真菌菌悬液进行PCR扩增,PCR扩增产物纯化、DNA测序,做序列比对分析。结果:ITS-PCR扩增出种特异的DNA条带,检测菌株76株,DNA测序鉴定出白假丝酵母菌53株(69.7%),其他真菌23株(30.3%)。结论:采用ITS引物测序法,可准确地检测出不同种的条件致病性真菌,并为进一步鉴定菌株的变异性,发现亚种提供基础。     

PCR与RFLP相结合检测全血中真菌感染的研究

目的建立从临床可疑真菌感染的全血标本中检测常见真菌基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测方法。方法采用PCR-RFLP检测方法检测临床可疑真菌感染的全血标本。提取DNA,用真菌的通用引物ITS1-ITS4扩增真菌ITS1-5.8SrDNA-ITS2区域,并对扩增产物进行MspI酶切分析鉴定,检测是否有真菌感染,并将真菌定位到种。应用此方法鉴定了100例临床可疑真菌感染全血标本,并与传统血培养方法进行对比。结果 100例疑似标本的真菌培养阳性率为26%,而经PCR扩增阳性率为31%。结论 PCR-RFLP检测全血中真菌基因具有快速、敏感性、特异性,有助于临床真菌感染的快速诊断,有一定的临床应用前景。     

铜绿假单胞菌整合子及其基因盒与耐药性的相关性研究

目的 调查致呼吸系统感染的铜绿假单胞菌中整合子的存在情况,研究整合子中基因盒与耐药表型的关系.方法 测定97株铜绿假单胞菌对抗菌药物的敏感性;应用简并引物PCR方法扩增整合子5'保守区的Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因,对阳性产物用限制性内切酶Hinf Ⅰ作限制片段长度多态性(RFLP)分析,并进行整合子分类;对整合酶阳性标...     

用限制性内切酶多态性分析23SrRNA快速鉴定李斯特菌种

目的为快速鉴定六种李斯特菌。方法用PCR扩增六种参考李斯特菌23SrRNA基因片段S1、S2，再用限制性内切酶S1、S2，用API反应条同时做生化反应。结果S2用XnmⅠ或CfoⅠ酶切，S2用AluⅠ或ClaⅠ酶切，可以分别鉴定出这六种参考李斯特菌，结果与API反应条一致。结论PCR-RFLP能快速、方便地用于李斯特菌的鉴定，且方法可靠、实用，可应用于食品和环境微生物的鉴定。     

PCR与RFLP相结合检测全血中真菌感染的研究

目的 建立从临床可疑真菌感染的全血标本中检测常见真菌基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测方法.方法 采用PCR-RFLP检测方法检测临床可疑真菌感染的全血标本.提取DNA,用真菌的通用引物ITS1-ITS4扩增真菌ITS1-5.8SrDNA-ITS2区域,并对扩增产物进行MspI酶切分析鉴定,检测是否有真菌感染,并将真菌定位到种.应用此方法鉴定了100例临床可疑真菌感染全血标本,并与传统血培养方法进行对比.结果 100例疑似标本的真菌培养阳性率为26%,而经PCR扩增阳性率为31%.结论 PCR-RFLP检测全血中真菌基因具有快速、敏感性、特异性,有助于临床真菌感染的快速诊断,有一定的临床应用前景.     

通用引物检测登革热病毒NS1基因及其酶切分型

目的：利用通用引物经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测登革病毒RNA，并经限制性内切酶酶切鉴定病毒型别。方法：用C6／36细胞培养登革病毒，碘化钠法提取病毒RNA，利用通用引物进行RT-PCR，对PCR产物用Mav I限制性内切酶酶切鉴定。结果：应用通用引物RT-PCR方法可检测到含量为0．212ng／L的病毒RNA，扩增的产物及酶切片段与预期的靶序列长度和限制酶谱分析相一致。结论：用登革病毒NS1区通用引物通过RT-PCR并经酶切分型，是诊断登革病毒感染的一种简易快速的方法。     

临床难鉴定细菌和真菌核糖体基因扩增及序列分析

目的建立核糖体测序方法鉴定临床难鉴定的细菌和真菌。方法分别利用通用引物扩增细菌16S rRNA基因和真菌核糖体转录间隔区2（ITS2）,对PCR产物进行测序,在GenBank中对测序结果进行Blastn等分析。结果21株临床常见细菌和8株真菌测序结果与表型鉴定符合,检测出6株临床难鉴定细菌和真菌。结论核糖体测序可以作为临床难鉴定细菌和真菌的分子生物学诊断方法。     

泌尿道致病性大肠埃希菌Ⅰ型PapG黏附素基因的扩增与分析

目的获得Ⅰ型黏附素代表菌株-泌尿道致病性大肠埃希菌（UPEC）J96 PapG全基因扩增片段并进行克隆子分析.方法设计合成一对可扩增Ⅰ型papG全长基因的PCR引物,采用长片段PCR扩增法获得该基因的扩增片段,以限制性内切酶酶解后克隆pUC18质粒载体.结果限制性酶谱、PCR和序列分析表明,所获得重组质粒pJG29中已带有Ⅰ型papG全长基因片段的克隆.结论所设计合成的引物和建立的PCR扩增法可用于大量获取并分析UPECⅠ型黏附素基因.     

rDNA ITS序列在鉴定尖端赛多孢子菌中的应用

为探明一例眼外伤摘除的眼球活组织中培养分离出的一株形态特异的尖端赛多孢子菌的分子生物学特征及其与波氏假阿利什菌、一般尖端赛多孢子菌标准株的亲缘关系,采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增其ｒＤＮＡ中基因间转录区（ＩＴＳ）,并对ＰＣＲ产物进行限制性片段长度多态性分析（ＲＦＬＰ）。结果发现,形态特异的尖端赛多孢子菌株与标准株及其它同种菌株具有相同的酶切图谱,而与顶孢霉和烟曲霉则不一致,表明该菌株就是波氏假阿利什菌的无性期。该标准菌株的ＩＴＳ序列酶切图谱可供快速、准确地鉴定尖端赛多孢子菌及其有性期,以便于临床早期诊断和及时治疗。     

PCR/RFLP对临床标本沙眼衣原体直接基因分型

建立泌尿生殖系统沙眼衣原体感染阳性标本直接基因分型方法。先用敏感的扩增沙眼衣原体特异质粒的引物扩增５００份临床标本，初筛选出１００份阳性标本再用扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）基因的引物扩增，并用嵌套式ＰＣＲ使阳性标本能扩增出ＭＯＭＰ基因，对获得的ＭＯＭＰ基因用限制性酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）方法进行基因分型，并用银染观察结果。其中Ｅ型比例最高，占４７％；Ｆ型为１６％；Ｄａ、Ｇ型均为６％；Ｂａ、Ｄ型各占５％；Ｈ型及Ｋ型均为１％，混合型Ｋ／Ｆ型２％；混合型Ｄ／Ｊ、Ｅ／Ｇ均为１％；未能分型有９％。     

Establishment and analysis of specific DNA patterns in 16S-23S rRNA gene spac er regions for differentiating different bacteria

Objective To establish the specific 16S-23S rRNA gene spacer regions in different bacteri a using polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphis m (RFLP), DNA cloning and sequences analysis. Methods A pair of primers were selected from highly conserved sequences adjacent to the 16S-23S rRNA spacer region. Bacterial DNA from sixty-one strains of standard bacteria and corresponding clinical isolates representative of 20 genera and 26 species was amplified by PCR, and further analyzed by RFLP, DNA cloning and se quences analysis. Furthermore, all specimens were examined by bacterial cultur ing and PCR-RFLP analysis. The evaluation of these assays in practical clinic practice was also discussed. Results Restriction enzyme analysis revealed one, two or three bands or more observed am ong the 26 different standard strains. The sensitivity of PCR reached 2.5 colony-forming unit (CFU), and there was no cross reaction with human genomic DNA, fungus or virus. Fourt ee n species could be distinguished immediately by PCR, while another 10 species we re further identified by Hinf Ⅰ or Alu Ⅰ digestion. The only difference betwe en K.pneumoniae and E.durans was located at the site of the 779th nucleot ide according to the sequence analysis and only XmaⅢ digestion could distingui sh one from another. Of 42 specimens from septicemic neonates, 15 were identifi e d as positive by blood culture at a rate of 35.7%. However, 27 specimens ident ified as positive by PCR, with a rate of 64.2%, a method significantly more eff ective than blood culture (P＜0.01). Of 6 cerebrospinal fluid (CSF) specim ens, one tested positi ve for S.epidermidis was also positive by PCR, two culture negative were po sitive by PCR and diagnosed as S.epidermidis according to the DNA pattern. One positive for C.neoformans was negative by PCR. The other two specimen s were negative by both PCR and culture. Conclusions The method of detecting bacterial 16S-23S rRNA spacer regions using PCR-RFLP t echniques was specific, sensitive, rapid and accurate in providing a new techniq ue for detecting pathogens in clinical bacterial infections.     

43例广东汉族单纯性腭裂患者转化生长因子α基因多态性的研究

目的探讨广东汉族单纯性腭裂患者转化生长因子α（TGF-α）基因多态性。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性核苷酸分型技术。以ToqI限制性内切酶消化PCR扩增产物,对43例单纯性腭裂（CPO）患者、68例正常人的TGF-α／ToqI等位基因进行分析。结果单纯性腭裂患者的C2等位基因频率比正常对照组明显增高,差异有统计学意义（P〈0．05）。单纯性完全腭裂患者的TGF-α/ToqI基因型与单纯性部分腭裂患者差异无统计学意义（P〉0．05）。结论TGF-α基因多态性与广东汉族人的单纯性腭裂的发生有关。     

2种制备Taq DNA聚合酶方法的比较

目的比较2种制备纯化Taq DNA聚合酶的方法,为PCR提供实验用酶。方法Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coli菌株,IPTG诱导12 h后收集菌体,分别用硫酸铵沉淀法和冻融法进行纯化,SDS-PAGE电泳和PCR扩增分析比较其纯度和活性。结果硫酸铵沉淀法制备的Taq DNA聚合酶活性能可有效扩增DNA片段;冻融法制备的Taq DNA聚合酶活性较低。结论硫酸铵沉淀法制备的Taq DNA聚合酶优于冻融法,能够达到分子生物学实验中基因扩增的要求。     

广东人群CYP3A4＊1G等位基因分布频率调查

目的 探讨CYP3A4＊ 1G等位基因在广东人群中的分布特征,为广东患者使用CYP3A4底物药提供参考依据.方法 提取192例广东人外周血DNA,分别用PCR扩增其CYP3A4基因跨越第10内含子20230G＞A位点的DNA片段,PCR产物用AfaⅠ酶切,通过酶切产物的电泳图谱判断基因型.结果 GG、GA、AA3种基因型的频率分别为63.5％、30.7％、5.7％.等位基因20230A即CYP3A4＊1G的频率为21.1％.结论 广东人群存在较高频率的CYP3A4＊1G等位基因,在使用CYP3 A4底物药时应密切关注患者是否存在该突变位点.     

核酸序列水平定位DNA损伤的实验研究

目的 研究在核酸序列水平定位DNA损伤的方法.方法 培养TK6细胞,抽提基因组DNA,制备k-ras基因外显子2的单链探针.酶切基因组DNA构建损伤模型,应用依赖随机化末端连接物PCR(RDPCR)进行Southern blot,对产物进行测序.结果 酶切DNA的RDPCR产物在相应位置出现杂交条带,测序证实损伤位于HinfⅠ在k-ras外显子2的酶切位点.结论 将RDPCR和测序技术结合在一起,可在核酸水平上准确定位DNA损伤的碱基位置.     

天麻ITS序列的聚合酶链反应扩增

目的:为天麻核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer ,ITS)序列分析提供可靠、特异的聚合酶链反应(PCR)条件.方法:选择ITS序列通用引物对天麻ITS序列进行PCR扩增,对一系列PCR条件参数进行摸索,同时对PCR产物进行纯化后直接测序.结果:天麻ITS序列PCR扩增产物约为750 bp,不同来源样本存在有一定的差异.经测序后与Genebank中相关序列比对,天麻ITS序列总长度为598 bp,其中ITS1为235 bp,ITS2为209 bp,5.8S为154 bp,G C(%)为52%.结论:扩增天麻ITS序列的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果.