受体介导甲胎蛋白对NIH3T3细胞增殖的促进作用

目的:探讨甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)促新生细胞增殖作用的分子机理。方法:从人脐带血中提取的AFP作用于体外培养的NIH3T3细胞;用3H-TdR参入法观察AFP对细胞DNA合成的影响以及放射受体分析法分析NIH3T3细胞膜表面AFP受体分布;观察在AFP作用下细胞内的第二信使物质环磷酸腺苷(cAMP)浓度及依赖cAMP激活的蛋白激酶A(PKA)活性的改变;Westernblot分析AFP对增殖相关的P21ras表达的影响。结果:10～80mg/L的AFP对NIH3T3细胞的DNA合成有明显的促进作用,与对照组比较最大增幅为121.9%;在NIH3T3细胞膜表面存在2种不同解离平衡常数(KD)的AFP受体,KD1=2.722nmol/L(12810位点/细胞);KD2=89.305nmol/L(119700位点/细胞);AFP能显著提高NIH3T3细胞内的cAMP浓度及PKA活性;对P21ras的表达也有明显的促进作用。结论:AFP促NIH3T3细胞增殖是通过细胞膜表面受体介导,经跨膜cAMP-PKA信号转导途径,影响基因表达来实现的。     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建及对NIH3T3细胞的转染

目的: 构建pcDNA3. 1( )-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞.方法: 提取大肠癌细胞株(SW480,Lovo,HT29)mtDNA,扩增D-loop区,产物用DNA自动测序法进行序列分析.利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3. 1( ),并用脂质体法导入NIH3T3细胞.结果: 大肠癌细胞株SW480,Lovo,HT29细胞mtDNA D-loop分别有10,9,8个突变位点.成功克隆1119 kb的mtDNA D-loop区至表达质粒pcDNA3. 1( ),并导入NIH3T3细胞中.结论: 成功构建了pcDNA3. 1( )-mtDNA真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中.     

大肠癌线粒体DNA诱导NIH3T3细胞D-环突变

目的 观察突变的大肠癌细胞线粒体DNA(mtDNA)转染 NIH3T3 细胞后转染细胞mtDNA D-环突变特性.方法 通过脂质体法(Lipofection 2000TM) 将大肠癌细胞突变的 mtDNA 真核表达载体转染 NIH3T3细胞,利用 G418 抗性筛选克隆细胞;用PCR法检测转染细胞线粒体突变情况.结果 ...     

人野生型DNA聚合酶β在NIH3T3细胞中的定位

目的：研究人野生型DNA聚合酶β(wtDNA polβ)在NIH3T3细胞内的定位。方法：将携带人wtDNA polβ的真核绿色荧光表达载体pEGFP—C3—polβ,用脂质体介导的方法转染NIH3T3细胞株,用荧光倒置显微镜观察转染细胞,观察wtpEGFP—C3—polβ融合基因表达。以转染空质粒pEGFP—C3的NIH3T3细胞为对照。结果：转染细胞均有GFP表达,说明转染成功,转染pEGFP—C3—polβ的细胞胞核荧光强度较胞浆强,而空质粒转染细胞胞浆胞核荧光强度无差别。结论：wtDNA polβ在NIH3T3细胞中定位于胞核内。     

大肠癌线粒体DNA诱导NIH3T3细胞D-环突变的研究

目的 观察突变的大肠癌细胞线粒体DNA（mtDNA）转染 NIH3T3 细胞后转染细胞mtDNA D-环突变特性。方法 通过脂质体法( Lipofection2000TM) 将大肠癌细胞突变的 mtDNA 真核表达载体转染 NIH3T3细胞,利用 G418 抗性筛选克隆细胞;用PCR法检测转染细胞线粒体突变情况。结果 突变mtDNA 导致转染细胞 mtDNA 的突变和多态性变化。 结论　突变的大肠癌 mtDNA可致NIH3T3细胞mtDNA位点变化,但具体的机制和过程有待于进一步研究。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

恶性转化NIH3T3细胞中NFκB的表达

目的 探讨c-met突变体（Tpr-Met）诱导NIH3T3细胞恶性转化中的NFκB表达及意义。方法以空载体pcDNA3．1做对照,用表达Tpr-Met的重组质粒转染NIH3T3细胞,筛选阳性克隆。做软琼脂集落实验,并提取细胞核蛋白做电泳迁移率改变分析（Eleetrophoretic mobility shift assay。EMSA）,以检测NFKB与DNA结合活性。结果 发现转染Tpr-Met后的NIH3T3细胞表型改变,并可在软琼脂中形成集落,EMSA结果发现DNA与NFKB结合能力增强。结论 Tpr-Met可能激活了NFKB信号途径,提示此信号途径可作为抗肿瘤生长和转移的一个新的治疗靶点。     

稳定表达野生型和突变型DNA聚合酶β的NIH3 T3细胞系的建立及其生长特性

目的：建立稳定表达野生型及突变型DNA聚合酶β（polβ）的NIH3T3细胞系。方法：用脂质体转染法分别将野生型和突变型polβ真核表达载体pcDNA3．1-PW和pcDNA3．1-PM3转染入NIH3T3细胞,经G418筛选得到稳定转染细胞系。用RT—PCR、免疫印迹法检测转染细胞polβmRNA和POLB蛋白的表达水平．MTT法测转染细胞生长曲线,免疫组化法测增殖细胞核抗原（PCNA）,并用流式细胞仪测细胞周期。结果与结论：成功建立了稳定表达野生型及突变型polβ的NIH3T3细胞系。野生型polβ对NIH3T3细胞生长无明显影响,突变型polβ则使NIH3T3细胞生长速度加快,细胞周期发生改变,细胞多被阻滞在S期。     

DJ-1L166P与DJ-1M26I基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的 在细胞学水平比较DJ、DJ-1M261、DJ-1L166P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础.方法 分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500 μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166P和DJ-1M261组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166P和DJ-1M261基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166P和D J-1M261基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P＜0.05).结论 DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的.     

大肠癌细胞线粒体DNA与NIH3T3细胞核基因组整合的荧光原位杂交分析

目的:观察大肠癌细胞突变的线粒体DNA(mtDNA)转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,mtDNA与转染细胞核内基因组的整合情况.方法:将携带大肠癌细胞突变mtDNA的重组质粒pcDNA3.1( )-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1( )-NHWBC mtDNA及空质粒pcDNA3.1( )通过脂质体法转染NIH3T3细胞.同时用PCR法制备3条相应的绿色荧光蛋白标记的mtDNA探针.分离转染的NIH3T3细胞核内染色体,用荧光原位杂交(FISH)法检测mtDNA探针与核内基因组的整合情况.结果与结论:瞬时转染的NIH3T3细胞核基因组上存在mtDNA的同源序列.外源肿瘤细胞mtDNA与NIH3T3细胞核内基因组发生整合.     

食管癌组织中人乳头瘤病毒的PCR检测

应用ＰＣＲ对汕头地区６０例食管癌石蜡包埋标本进行人乳砂瘤病毒ＤＮＡ序列检测。结果：ＨＰＶ－ＤＮＡ总检出率为６３．３％，ＨＰＶ－６、１１、１６、１８型的检出率分别为３０．０％，４０．０％，３０．０％和１０．０％，其中多重感染占阳性例数的６０．５％。初步结果表明，汕头地区食管癌组织中有较高的ＨＰＶ感染率，此与食管癌的发生可能有密切关系。     

以HPV基因通用引物行PCR检测阴茎肿瘤组织中HPV.DNA

为了探讨人乳头瘤病毒感染与阴茎肿瘤的关系。用人乳头瘤病毒基因通用引物行聚合酶链反应,检测５２例阴茎鳞癌。ＨＰＶ阳性率为６７％,３１例为ＨＰＶ－１６,３例为ＨＰＶ１６／１８,１例为ＨＰＶ１１／１８。４例阴茎淋巴结转移灶标本,３例检出与原发癌一致的ＨＰＶ．ＤＮＡ。６例阴茎乳头状瘤标本,４例检出ＨＰＶ－６或１１。２０例正常阴茎包皮均阴性。提示ＨＰＶ有阴茎肿瘤的发生发展中有一定的作用,但与肿瘤的病理分级无     

人乳头瘤病毒DNA载量与尖锐湿疣复发的相关性

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)DNA载量与尖锐湿疣(CA)复发的关系.方法采用实时荧光定量PCR技术,对31例初发性和32例复发性CA患者的疣体组织进行HPV6/11和HPV16/18 DNA的定量检测.结果 63例CA中,62例HPV6/11DNA阳性,阳性率98.4%.初发性CA HPV 6/11DNA载量为1.4×103～6.7×107copies/ml,平均(8.4×106±1.7×107)copies/nl;复发性CA HPV 6/11DNA载量为1.2×104～3.6×108copies/ml,平均(2.9×107±6.7×107)copies/ml.在62例HPV6/11阳性中,有7例HPV16/18 DNA同时阳性,占11.3%,其中初发性CA 2例,复发性CA 5例,初发性CA HPV 16/18 DNA载量为1.9×103～1.6×104copies/ml,平均(8.7×103±9.6×103)copies/ml,复发性CA HPV 16/18 DNA载量为1.4×105～1.7×107copies/ml,平均(5.7×106±7.1×106)copies/ml.复发性CA的HPV6/11和HPV16/18 DNA载量高于初发性CA,差异均具有显著性(P＜0.05).HPV6/11 DNA的载量随着复发次数以及病程的增加而升高,呈正相关,相关系数r分别为0.37和0.30.结论 HPV DNA病毒载量与CA复发之间存在着一定的相关性.     

下咽癌及其颈部转移淋巴结人乳头瘤病毒16／18的表达

目的：探讨人乳头瘤病毒（ HPV）16/18与下咽鳞癌及其颈部淋巴结转移的关系。方法应用原位杂交（ ISH）技术检测20例下咽癌组织及其颈部淋巴结组织中HPV16/18 DNA的表达情况,并结合病人临床资料进行回顾性分析。结果20例下咽组织中检出HPV16/18 DNA阳性2例占10．0％,12例转移性颈部淋巴结标本中检出 HPV16/18 DNA 阳性1例占8．3％,颈部正常淋巴结中均未检出 HPV16/18 DNA。3例HPV16/18阳性病例均为临床Ⅳ期下咽鳞癌病例。结论 HPV16/18在下咽鳞癌及其颈部转移性淋巴结中的检出率较低。     

DNA sequences of human papillomavirus types 11, 16, and 18 in lesions of the uterine cervix in the west of Scotland

Punch biopsy specimens of the cervix were examined both histologically and for the presence of human papillomavirus (HPV) DNA sequences. The presence of HPV DNA sequences was sought with the Southern blot technique using radioactively labelled HPV-6, 11, 16, and 18 DNA probes, both together and separately. Twenty six biopsy specimens were examined. Histological examination showed cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 in 16 specimens, viral changes (koilocytosis) in four, and inflammation or a normal appearance in three. Eleven specimens were negative for HPV DNA sequences, 10 contained HPV-16 DNA, four contained HPV-18 DNA, and one contained both HPV-18 and HPV-11 DNA. Episomal HPV-16 DNA was detected in one case of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 and in five cases of cervical intraepithelial neoplasia grade 2/3 with koilocytosis; and episomal HPV-18 DNA was found in two specimens classed as cervical intraepithelial neoplasia grade 2/3, one of which also contained HPV-11 DNA, and in one specimen that showed viral changes alone. Integrated HPV DNA was found in six specimens (four with HPV-16 DNA and two with HPV-18 DNA), including two cases of chronically inflamed cervix with no histological evidence of viral infection or cervical intraepithelial neoplasia. Detection of viral DNA in early lesions may identify patients at risk of malignant progression. This is the first report of HPV-18 DNA in cervical intraepithelial neoplasia in Scotland.     

用生物素标记的DNA探针检测尖锐湿疣和宫颈癌中的人类乳头瘤病毒DNA序列

用生物素标记的HPV6/11DNA和HPV16/18DNA探针,对尖锐湿疣和宫颈癌标本进行原位杂交。结果大多数尖锐湿疣含HPV6/11DNA,所以尖锐湿疣的主要致病因子是H2V6/11.HPV6/11DNA阳性细胞主要位于上皮的表层,少数位于深层。个别合并HPV16/18感染,或仅为HPV16/18所感染的病人恶变的可能性大。大多数宫颈癌病人含HPV16/18DNA,提示宫颈癌的主要致病因子为HPV16/18。一些病人合并HPV6/11感染。在未找见HPV16/18DNA的病例中,可能存在其它致癌因子。     

用生物素标记的DNA探针检测尖锐湿疣和宫颈癌中的人类乳头瘤病毒DNA序列

用生物素标记的HPV6/11DNA和HPV16/18DNA探针,对尖锐湿疣和宫颈癌标本进行原位杂交。结果大多数尖锐湿疣含HPV6/11DNA,所以尖锐湿疣的主要致病因子是H2V6/11.HPV6/11DNA阳性细胞主要位于上皮的表层,少数位于深层。个别合并HPV16/18感染,或仅为HPV16/18所感染的病人恶变的可能性大。大多数宫颈癌病人含HPV16/18DNA,提示宫颈癌的主要致病因子为HPV16/18。一些病人合并HPV6/11感染。在未找见HPV16/18DNA的病例中,可能存在其它致癌因子。     

人乳头瘤病毒感染与膀胱肿瘤关系的探讨

本研究旨在探讨人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染与膀胱肿瘤发生发展之间的关系。用体外基因扩增技术，即聚合酶链反应，使用人乳头瘤病毒１６和１８型引物序列，对３４例膀胱癌新鲜手术切除标本、３０例正常膀胱粘膜作对照，进行人乳头瘤病毒基因检测，肿瘤标本ＨＰＶＤＮＡ总阳性率为４１．１８％；其中ＨＰＶ１６型阳性率为２０．６０％，ＨＰＶ１８型阳性率为２６．４７％，合并感染阳性率为５．８８％。３０例正常对照标本未检出ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８型ＤＮＡ序列。研究初步表明，高危类ＨＰＶ１６型、ＨＰＶ１８型在膀胱癌的病因中有一定的影响     

宫颈癌患者石蜡标本中人乳头瘤病毒的检测与分型

采用非放射性同位素检测技术，对来源于子宫颈癌患者的石蜡包埋组织标本进行四种常见生殖道HPV（HPV6，11，16，18）的检测和分型。结果表明，在受检的10例宫颈癌患者石蜡标本中，HPV阳性检出率为100%，其中HPV16型3例（30%），和HPV18例6例（60%），HPV6和HPV11型未检测到，表明宫颈癌感染HPV主要为HPV16及18型。     

人乳头瘤病毒在人大肠癌中检出

用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)法对28例大肠癌(均为分化程度不同的腺癌)及18例相应癌旁组织中人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16和18型DNA分别进行检测。在28例大肠癌组织中分别检测到3例(10.8％)呈HPV16DNA阳性和18例(64.5％)呈HPV18DNA阳性。而相应的18例癌旁组织中仅检测到3例(16.7％)呈HPV18DNA阳性,未检测到HPV16DNA。为了证实扩增产物的特异性,我们用限制性内切酶对PCR产物分别进行了酶切分析,结果与预期的完全相符。本文提示HPV感染可能是大肠癌的发病因素之一。