慢病毒介导的RNA干扰技术应用于抑制黑色素瘤细胞转移的特异性研究

目的 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,对该技术能特异性的抑制黑色素瘤细胞转移进行研究.方法 以人巢蛋白(Human nestin)的信使RNA编码序列作为干扰靶点,把慢病毒基因PLL3.7作为质粒载体,人巢蛋白的“短发夹”RNA(shRNA)表达质粒和阴性对照shRNA表达质粒(不包含所有已知信使RNA),分别感染黑色素瘤细胞株UACC903细胞并流式分选获得高纯度的巢蛋白干扰或对照组细胞.用划痕法检测评估各组黑色素瘤细胞迁移能力.结果 巢蛋白下调的UACC903细胞侵袭能力和迁移能力均下降(P＜0.05).结论 慢病毒介导的RNA能有效地沉默巢蛋白基因的表达,从而能特异性的抑制黑色素瘤细胞迁移.     

lncRNA4.9干扰慢病毒载体的构建

目的 构建人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)转录的长链非编码RNA4.9(long non-coding RNA4.9,lncRNA4.9)干扰慢病毒载体.方法 设计并合成3条以lncRNA4.9为靶点的干扰序列,构建穿梭质粒GV248和目的干扰序列的重组质粒,测序验证序列,将重组质粒...     

Siglec-1小干扰慢病毒载体的构建和干扰效率验证

目的 构建小干扰唾液酸黏附素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 1,Siglec-1)的慢病毒载体,并体外筛选出具有干扰效果的病毒载体.方法 利用软件设计3条Siglec-1 siRNA片段,并克隆到慢病毒pGCSIL-GFP质粒载体,再与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染293T细胞,培养48 h后,收集并浓缩富含慢病毒颗粒的细胞上清液.逐孔稀释法测定慢病毒滴度并转导原代培养的骨髓巨噬细胞(BMM),流式细胞术和实时荧光定量PCR筛选具有干扰效果的病毒载体.结果 成功构建3个vshRNA质粒载体和一个阴性对照质粒载体,并经测序验证序列正确.包装的慢病毒滴度介于1×108 ～ 1×109 TU/ml之间,适合体外转导及体内试验.体外转导BMM筛选出Lv-1能靶向抑制Siglec-1表达.结论 成功构建并筛选出具有体外干扰效果的小干扰Siglec-1慢病毒载体,为体内应用该病毒载体进行基因敲除实验奠定了基础.     

慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰对PC12细胞的转染效率和对MyD88基因的抑制效率。方法构建针对大鼠MyD88基因3个靶点的ShRNA慢病毒载体,PC12细胞按照不同的转染条件分为正常组(DMEM完全培养液)、DMEM加入polybrene组、EN.iS(Enhance infection solution)组、EN.iS加入polybrene组。荧光显微镜下观察不同组的转染效率,采用Real-timePCR和Western blot检测不同的靶点对MyD88的不同沉默效率。结果病8毒滴度为1×10TU/ml,MOI为100时,PC12细胞在EN.iS组的转染效率最高,转染试剂polybrene对转染效率无明显影响,沉默效率最高的靶点是5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'。结论慢病毒介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段,可以对PC12细胞中MyD88的功能进行长期的研究。     

靶向IL-6慢病毒介导RNA干扰实验性基因治疗类风湿关节炎

目的:探讨靶向小鼠IL-6基因RNA干扰慢病毒载体颗粒(LV-IL-6-RNAi)对小鼠巨噬细胞株J774A.1细胞IL-6表达的影响,及其对胶原诱导性关节炎(CIA)的治疗作用。方法:设计合成3对特异性针对小鼠IL-6基因的小干扰RNA(siRNA)序列,筛选最高效siRNA序,构建高效LV-IL-6-RNAi。LV-IL-6-RNAi感染小鼠巨噬细胞株J774A.1细胞,并设慢病毒阴性对照(LV-NC-RNAi)、培养基空白对照,RT-qPCR检测J774A.1细胞的IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1β mRNA相对表达水平,以检测LV-IL-6-RNAi体外干扰效率。取DBA/小鼠构建CIA模型并随机分为4组:LV-IL-6-RNAi组、LV-NC-RNAi组、甲氨蝶呤(MTX)阳性对照组、PBS空白对照组,分别关节腔注射LV-IL-6-RNAi、LV-NC-RNAi、腹腔注射MTX、PBS溶液,记录CIA小鼠关节炎评分,ELISA检测小鼠IL-6、IL-1β和TNF-α血清水平,组织病理检测炎症关节的炎症细胞浸润数。结果:成功构建了高效LV-IL-6-RNAi。...     

人EGFL7基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在人喉癌细胞中的表达

摘要目的：构建人表皮生长因子样结构域7（epidermalgrowthfactor-likedomain7,EGFL7）基因RNA干扰（RNAinterference,RNAi）慢病毒表达载体,并建立稳定干扰EGFL7基因表达的喉癌细胞亚系,为研究EGFL7蛋白在喉癌发生发展中的功能奠定基础。方法：针对人EGFL7基因序列,设计特异性RNAi靶序列,与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR线性载体定向连接,得到的阳性重组子再与pLenti6.3-MCS/V5-DEST慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体。在POLOdelivererTM3000介导下将慢病毒包装质粒和EGFL7基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人喉癌细胞HEp-2,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰EGFL7基因的细胞亚系。结果：成功构建EGFL7pLenti6.3-EGFL7-miR真核表达慢病毒干扰载体并获得相应慢病毒,经测定病毒滴度为5×1011TU/L,实时荧光定量PCR证实pLenti6.3-EGFL7-miR慢病毒载体对喉癌细胞HEp-2EGFL7基因的沉默效率为97%。结论：成功构建人EGFL7基因特异性的慢病毒干扰载体,并获得EGFL7基因稳定干扰的喉癌细胞亚系。     

NSBP1基因干扰RNA慢病毒载体的构建及效应检测

目的 构建和鉴定NSBP1基因RNA干扰慢病毒表达载体。 方法 针对NSBP1 mRNA设计了3条siRNA,并构建pGCSIL-GFP-NSBP1慢病毒质粒,测序鉴定。用pGCSIL-GFP-NSBP1 、pHelper1.0和 pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将慢病毒转染前列腺癌DU145细胞,Western-blot检测NSBP1表达, MTT法检测细胞生长活性,用转染细胞种植裸鼠成瘤,观察抑瘤效果。结果 PCR和测序证实,成功构建LV-shNSBP1的慢病毒载体,病毒滴度达2×108TU/ml。转染细胞中NSBP1蛋白表达显著降低,且MTT检测细胞生长活性明显减慢,转染细胞在裸鼠体内成瘤率没有影响,但对肿瘤的生长有明显抑制作用。结论 人NSBP1基因RNA干扰慢病毒载体的成功构建,且NSBP1对前列腺癌激素非依赖DU145细胞的生长具有重要作用。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。 目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶 RNA干扰慢病毒载体。 方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。 结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

双自杀基因慢病毒转移系统的建立及其对T淋巴细胞的体外杀伤作用

目的利用分子生物学方法构建CD和豫双自杀基因慢病毒转移载体。方法将慢病毒基因转移系统中的3种成分质粒（包膜质粒、包装质粒及目的基因转移质粒）用脂质体共转染人病毒包装细胞293T,荧光显微镜下观察;透射电镜下观察病毒颗粒;大量收集病毒上清,浓缩后用之感染T淋巴细胞,荧光显微镜下观察。结果荧光显微镜观察到对照组大量绿色荧光蛋白（GFP）;透射电镜证实有大量病毒颗粒存在。单独使用前体药物5-氟脲嘧啶（5-FC）和／或无环鸟苷（GCV）后,细胞的存活率与未转染T淋巴细胞比较,差异显著（P〈0．01）,与单独使用5-FC或GCV比较,联合使用5-FC和GCV时T细胞的存活率明显降低（P〈0．01）。结论慢病毒基因转移系统可使双自杀基因发挥强大的杀伤作用,为一种有效的基因转移系统。     

兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定*

背景：膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。 目的：针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。 方法：针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI 双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108 TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR 和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

大鼠CD80基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠CD80基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠NRK和IEC6细胞上鉴定其沉默效率.方法:将筛选获得的大鼠CD80基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与pGCSIL-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠NRK细胞、IEC6细胞和大鼠DC细胞(树突状细胞,Dentritic cell),分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率.结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到4×10~8 TU/ml.shRNA慢病毒颗粒感染NRK和IEC6细胞后CD80基因的 mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了66.9%和63.5%.结论:成功构建了大鼠CD80基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在细胞水平有效沉默靶基因.     

人CDK2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建人细胞周期素依赖蛋白激酶2(CDK2)基因RNA干扰慢病毒载体。〖HJ1.8mm〗方法:利用Invitrogen公司在线软件设计人CDK2（NM001798）shRNA序列,退火形成dsoligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序,再与慢病毒载体重组,测序鉴定,在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和CDK2基因重组慢病毒载体转染293FT细胞,包装成病毒后,收集细胞培养上清液,测定病毒滴度。结果:测序证实pENTRTM/U6-CDK2-shRNA为阳性克隆,与慢病毒载体重组后测序结果显示也为阳性克隆,CDK2基因重组慢病毒载体传染293FT细胞后48h,细胞培养上清液,病毒的滴度为6×108TU/L。结论:成功构建人CDK2基因RNAi慢病毒载体,为研究CDK2在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。     

B7H1在胰腺癌panc-1细胞的表达及其功能研究

目的:探讨胰腺癌细胞株panc-1中B7同源物1(B7H1)的表达及其对T细胞增殖活化的调节作用。方法:分别应用RT-PCR和流式细胞术检测B7H1在γ-干扰素(IFN-γ)处理或B7H1小干扰RNA(siRNA)转染前后panc-1细胞中的表达。采用植物血凝素(PHA)刺激人外周血T细胞体外增殖,加入IFN-γ处理或B7H1-siRNA转染前后panc-1细胞混合培养72h,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测T细胞的增殖,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测共培养上清中的IFN-γ、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-10(IL-10)的分泌。结果:panc-1细胞组成性表达B7H1。IFN-γ处理可以显著上调B7H1表达,抑制共培养T细胞的增殖和IFN-γ、IL-2分泌,但是促进IL-10的分泌。相反,应用B7H1-siRNA阻断B7H1表达后则显著促进T细胞增殖和IFN-γ、IL-2的分泌,但下调IL-10的分泌。结论:B7H1分子在体外通过抑制T细胞增殖和Th1类细胞因子分泌来下调T细胞功能。应用siRNA技术阻断B7H1有望成为治疗胰腺癌的新途径。     

ADAM10基因RNA干扰重组慢病毒的转导对H9C2细胞N型钙粘蛋白的解整合素金属蛋白酶10加工途径的影响

目的 构建ADAM10基因RNA干扰重组慢病毒,观察其在N型钙粘蛋白底物加工过程中的重要性,为探求该加工途径在维持心肌组织结构形态和完整性中的作用打下基础.方法 筛选确定ADAM10基因RNA干扰有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与LentiLox 3.7载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用重组慢病毒转导心肌细胞(H9C2),通过Western blotting检测心肌细胞N型钙粘蛋白及其C-端的CTF1片段的蛋白表达,流式细胞学实验检测N型钙粘蛋白在心肌细胞表面的表达,利用黏附实验检测转染前后心肌细胞黏附能力的变化.结果 成功构建ADAM10 shRNA慢病毒载体,包装慢病毒,转导心肌细胞.与阴性对照组相比,转染组心肌细胞N型钙粘蛋白表达提高,CTF1片段表达减少;细胞表面N型钙粘蛋白的表达增多;心肌细胞黏附能力提高.结论 初步证明心肌细胞中ADAM10在N型钙粘蛋白的加工水解过程中发挥重要作用,为进一步明确该水解途径在维持心肌细胞形态结构和完整性方面所起的作用打下了实验基础.     

小鼠肝癌总RNA转染的树突状细胞体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞的研究

目的 :探讨小鼠骨髓树突状细胞 (dendriticcell,DC)体外经Hepa 1 6肝癌细胞株总RNA转染后 ,对特异性细胞毒T淋巴细胞 (CTL)的诱导作用。方法 :自小鼠骨髓分离DC前体细胞 ,经GM CSF IL 4培养、扩增 ;制备Hepa 1 6小鼠肝癌细胞株总RNA ,体外转染DC ,检测DC诱导同基因型小鼠T细胞增殖及其特异性CTL的反应能力。结果 :经Hepa 1 6肝癌细胞总RNA转染的DC ,其组织相容性分子 (MHC I、II)及共刺激分子 (B7 1 、B7 2 )表达明显增高 ,刺激同基因型小鼠T细胞增殖能力增强 ,且能诱导Hepa 1 6特异性CTL。结论 :以肝癌总RNA转染DC ,构造肝癌疫苗为肝癌的临床治疗提供了新的策略。     

shRNA抑制淋巴细胞TNFα的表达

目的观察RNA干扰技术是否有效抑制原代培养的脾淋巴细胞肿瘤坏死因子α(TNFα)的表达。方法体外合成针对TNFα基因序列的特异性发夹状双链RNA(shRNA)的表达载体,与L ipofectam ine2000结合后转染原代培养的由脂多糖(LPS)激活的脾淋巴细胞,用ELISA和RT-PCR法检测TNFα表达的变化。结果ELISA检测结果表明,特异性RNA干扰组TNFα蛋白表达较对照组下降34.2%,而非特异性干扰组TNFα表达与对照组无明显差异;RT-PCR检测结果表明,特异性RNA干扰组TNFαmRNA表达较对照组下降61.3%。结论RNA干扰可以有效抑制原代培养的淋巴细胞TNFα的表达,该过程具有严格的基因序列特异性,为TNFα相关疾病的基因治疗提供了新策略。     

携带甲胎蛋白基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对靶基因的沉默效率

目的构建携带甲胎蛋白（AFP）基因小干扰RNA（siRNA）的慢病毒载体并转染肝癌细胞,评价其对AFP基因的沉默效率。方法设计和构建针对AFP基因的阳性siRNA及不针对任何已知基因的阴性siRNA,将其分别插入携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组慢病毒载体,然后转染到表达AFP基因的人肝癌细胞HepG2并筛选阳性表达细胞株,分别为慢病毒转染阳性siRNA组和慢病毒转染阴性siRNA组。同时设立脂质体转染阳性siRNA组、脂质体转染阴性siRNA组以及加AFPsiRNA而未用转染试剂的siRNA组、空白对照组。荧光显微镜观察评估转染效率,荧光定量PCR和免疫印迹法检测各组HepG2细胞APFmRNA及蛋白的相对表达量,比较不同转染方法对AFP基因表达的抑制率。结果慢病毒能够有效地转染siRNA到HepG2细胞内。荧光定量PCR显示慢病毒转染siRNA对AFPmRNA表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（92．1％比74．3％,P〈0．05）。免疫印迹亦显示慢病毒转染siRNA对AFP蛋白表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（88．2％比63．7％,P〈0．05）。结论慢病毒转染AFPsiRNA能够更有效地抑制HepG2细胞内AFP基因表达。     

siRNA对Hela细胞表达VEGF的干涉作用

目的：研究体外转录合成的siRNA对Hela细胞中VEGF表达的干涉作用。方法：根据人VEGF 1～5外显子序列进行siRNA设计，应用T7 RNA聚合酶体外转录合成3条siRNA。并利用siPORT Lipid将siRNA转染人Hela细胞中，通过半定量RT-PCR和免疫荧光方法检测Hela细胞VEGF表达情况，评价不同序列siRNA对VEGF基因表达的干涉作用。结果：体外转录合成的3条siRNA均能高效地抑制Hela细胞中VEGF的表达，干涉效率分别为88．7％、94．2％和80．3％，而1个错配碱基的siRNA及ssRNA（＋）未显现明显干涉作用。另外实验显示在5～10 pmol范围内，TV-siRNA对VEGF表达的抑制作用具有剂量依赖性。结论：利用T7 RNA聚合酶体外转录合成的siRNA可以高效干涉Hela细胞中VEGF的表达且具有良好的序列特异性，为肿瘤的基因治疗提供了新方法。