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1.
目的:探讨人剪切修复基因着色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D, XPD)对肝癌细胞鼠双微体2(murine double minute 2,Mdm2)和鼠双微体4(murine double minute 4,Mdm4)表达的影响。方法:用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染进入人肝癌细胞株HepG2,实验分为3组:(1)空白对照组;(2)pEGFP-N2组;(3)pEGFP-N2/XPD组。用MTT法观察细胞的增殖活力;用流式细胞术检测细胞周期和凋亡率;用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Mdm2、Mdm4和P53表达量的变化。结果:MTT结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了肝癌细胞的增殖活力;流式细胞术结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起了G 1期细胞增加,S期减少,凋亡率增加。RT-PCR和Western blotting检测发现,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高,同时使得Mdm2和Mdm4表达降低,P53表达增高。结论:XPD能下调肝癌细胞中Mdm2和Mdm4的表达,上调P53表达,并能抑制肝癌细胞增殖及诱导其凋亡。 相似文献
2.
目的: 探讨人着色性干皮病D组基因(XPD)对白细胞介素-6(IL-6)促进人血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖作用的影响。方法: 用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空质粒pEGFP-N2稳定转染VSMCs,然后给予1×105 U/L IL-6孵育48 h。实验分为6组:(1)空白对照组;(2)pEGFP-N2组;(3)pEGFP-N2/XPD组;(4)IL-6组;(5)IL-6 + pEGFP-N2组;(6)IL-6 + pEGFP-N2/XPD组。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况;用MTT法观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Bcl-2、Bax和野生型P53(wt-P53)表达量的变化。结果: 在荧光显微镜下,可在转染了重组质粒pEGFP-N2/XPD或空质粒pEGFP-N2的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;MTT结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了细胞增殖活力(P<0.05),并能抑制IL-6促进VSMCs增殖的作用(P<0.05);流式细胞仪结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起了细胞G0/G1期增加(P<0.05)、S期减少(P<0.05)、凋亡率增加(P<0.01),并能抑制IL-6促进VSMCs G0/G1期减少、S期增加、凋亡率降低的作用(P<0.01);RT-PCR和Western blotting检测发现,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高(P<0.05或P<0.01),同时Bcl-2表达降低,Bax和wt-P53表达增高(P<0.05或P<0.01),并能抑制IL-6促进VSMCs的Bcl-2表达增高、Bax和wt-P53表达降低的作用(P<0.05或P<0.01)。结论: XPD能抑制VSMCs增殖并促进其凋亡,并能抑制IL-6促进VSMCs增殖和降低其凋亡的作用,有望成为治疗动脉粥样硬化的靶点。 相似文献
3.
目的:探讨人剪切修复基因着色性干皮病D组基因(xeroderma pigmentosum group D, XPD)转染人肝癌HepG2细胞后视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb)和有丝分裂阻滞缺陷蛋白 2(mitotic arrest deficient 2, MAD2)表达的变化及对细胞增殖的影响。方法:将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过LipofectamineTM 2000转染HepG2细胞。实验分为4组,分别为无转染HepG2细胞组(空白对照组)、脂质体转染HepG2细胞组(脂质体组)、空载质粒pEGFP-N2转染细胞组(N2 组)和重组质粒pEGFP-N2-XPD转染细胞组(XPD组)。分别用RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中XPD、Rb及MAD2 mRNA和蛋白的表达量,用MTT法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组的细胞凋亡情况及细胞周期。结果:与其它3组相比,XPD组XPD mRNA及蛋白表达量明显升高(P<0.05),Rb mRNA及蛋白表达量明显升高(P<0.05),而MAD2 mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.05)。XPD组细胞增殖活力显著降低,细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。XPD组细胞停滞在G1期,难以进入S期。结论:XPD可以抑制MAD2的表达和肝癌细胞的增殖,促进Rb的表达。 相似文献
4.
目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA(siRNA)表达载体质粒pGenesil-siHBV X 对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil- siHBV X。分别用培养液(空白对照)、脂质体Metafectene、pGenesil 空载体、pGenesil-siHK(阴性对照)、pGenesil-siAFP(特异性对照)、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24 h,取各组细胞培养上清液,用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量,用化学发光法检测AFP含量,用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。
结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达,且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后,pGenesil-siHBV X组细胞上清液中 HBsAg、 HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为(6.26 ± 1.07)ng/ml 、(0.13 ± 0.05)Ncu/ml和(3.01 ± 0.40)×107拷贝/ml,与空白对照组的(22.50 ± 1.39)ng/ml、(1.12 ± 0.11)Ncu/ml和(12.33 ± 1.28)×107拷贝/ml比较,差异有统计学意义(t值分别为12.80、12.21、9.71,P < 0.05);pGenesil-siHBV X 转染不影响细胞对AFP的表达(t = 0.18,P = 0.86)。结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2. 15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。 相似文献
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目的:探讨剪切修复基因——着色性干皮病D组基因(XPD)在氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)促血管平滑肌细胞增殖中的作用及机制。方法:将重组质粒pEGFP-N2/XPD利用脂质体转染人脐动脉平滑肌细胞(HUASMCs),实验分为空白对照组、空载质粒pEGFP-N2组、重组质粒pEGFP-N2/XPD组、Ox-LDL组、Ox-LDL+pEGFP-N2组和Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组。用MTT法和Ed U法测定各组细胞的增殖率;流式细胞术检测各组细胞周期分布;利用Western blot法检测XPD、caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白水平。结果:Western blot实验结果发现,与空白对照组相比,pEGFP-N2/XPD组的XPD表达增加(P0.05),表明转染成功;MTT和Ed U检测结果显示,pEGFP-N2/XPD组的细胞增殖率较空白对照组降低(P0.05);与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组细胞增殖明显被抑制(P0.05)。流式细胞术的检测结果显示,与空白对照组比较,pEGFP-N2/XPD组的S期细胞比例明显减少(P0.05),G0/G1期细胞比例明显增多(P0.05);与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组的S期细胞比例减少(P0.05),G0/G1期细胞比例明显增多(P0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,pEGFP-N2/XPD组的cleaved caspase-3和Bax蛋白水平增加(P0.05),Bcl-2蛋白表达降低(P0.05);与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组的cleaved caspase-3和Bax蛋白水平增加(P0.01),Bcl-2蛋白表达降低(P0.05)。结论:XPD能抑制HUASMCs的增殖并促其凋亡,还能抑制Ox-LDL的促HUASMCs增殖作用,有可能成为抗动脉粥样硬化治疗的靶点。 相似文献
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目的 研究e抗原阳性慢性乙型肝炎患者外周血中HBV-DNA载量与乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的相关性,及其在不同性别、年龄群体中的差异.方法 收集319例e抗原阳性慢性乙肝患者血清,采用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA载量,用时间分辨免疫荧光法检测HBsAg和HBeAg的浓度,利用SPSS软件做统计分析.结果 HBV-DNA载量与HBsAg含量有良好的相关性(r=0.514,P〈0.001);与HBeAg含量有相关(r=0.337,P〈0.001);女性的HBeAg水平要高于男性患者(P〈0.05);年龄(31~50)岁组、〉50岁组的HBV-DNA、HBsAg 及HBeAg值皆高于年龄 〈30岁组 (P〈0.001).结论 e抗原阳性慢性乙型肝炎患者血清中HBV-DNA载量与HBsAg、HBeAg定量水平皆有相关性,其中与HBsAg相关性更佳. 相似文献
8.
目的探讨慢性乙型肝炎患者肝组织抑癌基因p53的表达及其影响因素。方法符合诊断标准的HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者17例、HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者31例。行血清学标志物及肝组织病理学检查。结果(1)HBeAg阴性组患者年龄较大、男性居多、HBVDNA水平偏低,三项指标均与HBeAg阳性组有统计学差异。血清学指标除Glo外,均无统计学差异。(2)两组患者肝脏病理学炎症及纤维化分期差异均无统计学意义;肝组织中p53阳性率及p53计分无统计学差异。(3)Logisticregression分析表明,只有肝脏纤维化分期(s)是p53阳性表达的危险因素,与S0-1相比,S≥2患者出现p53阳性的风险增高3.9倍。结论慢性乙型肝炎患者肝脏纤维化分期是其肝组织p53阳性表达的危险因素。 相似文献
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乙型肝炎病毒X蛋白转录抑制抑癌基因p53表达的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对抑癌基因p53基因表达的调节作用。方法 以寡核苷酸芯片技术筛选的HBx反式调节基因结果为基础,利用生物信息学技术确定抑癌基因p53的启动子区域(p53p),构建真核报告基因表达载体pCAT3-p53p;以该质粒单独及与pcDNA3.1(-)-X共转染HepG2细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。进一步采用半定量RT-PCR技术检测HBV X蛋白对p53基因表达的调节。结果 成功构建报告载体pCAT3-p53p,克隆的p53启动于有顺式激活下游基因的活性;pCAT3-p53p与pcDNA3+1(-)-X共转染时CAT的表达活性明显下降,说明HBVX蛋白抑制p53基因启动子的转录。RT-PCR结果表明,转染了pcDNA3.1(-)-X的HepG2细胞中p53基因mRNA表达减少。结论 HBV X蛋白在转录水平上反式抑制抑癌基因p53的表达,本实验不仅验证了基因芯片的筛选结果.而且为HBx在致肝细胞癌发生中的作用提供分子基础。 相似文献
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目的:设计特异性结合乙肝病毒核心启动子(HBVCp)的锌指蛋白(ZFP),观察ZFP在体外对HBV转录的抑制情况。方法:利用Zinc finger tools设计特异性结合HBV Cp的ZFP。将ZFP核苷酸序列人工合成后克隆至pEGFP-N1和pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pEGFP-N1/ZFP-Flag和pcDNA3.1(+)/ZFP。通过倒置荧光显微镜、RT-PCR和Western blot鉴定pEGFP-N1/ZFP-Flag在COS-7中的表达情况;将pcDNA3.1(+)/ZFP转入HepG2.2.15细胞后24 h,采用ELISA和FQ-PCR检测上清液中HBeAg和HBV DNA含量,RT-PCR检测细胞内HBV mRNA水平。结果:ZFP在COS-7细胞中能正常表达。与空质粒组相比,ZFP组细胞培养上清液中HBV DNA拷贝量和HBeAg含量明显降低(P<0.05),细胞内HBV mRNA也显著减少。结论:人工设计的ZFP可以在真核细胞内正常表达,并能有效抑制HBV的转录。 相似文献
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荧光定量PCR法检测乙型肝炎病毒DNA 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:了解不同乙型肝炎病毒(HBV)感染患者血清HBV-DNA含量与乙肝血清免疫标志物的关系并探讨其临床意义。方法:用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法定量检测375例不同临床类型HBV感染者及70例正常人血清HBV-DNA含量。结果:血清HBsAg阳性组与HBeAg阳性组HBV-DNA的检出率及含量均明显高于HBsAg阴性组和HBeAg阴性组,且HBeAg即使阴性,不论HBeAb阳性组或阴性组均仍有较高的HBV-DNA检出率。不同临床类型HBV感染者中均有HBV-DNA的检出。结论:定量PCR可真实反映HBV感染、复制及病程变化,对乙型肝炎临床诊断及治疗均有一定的临床意义。 相似文献
13.
乙肝患者血清标志物和病毒含量的相关性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
林琳 《标记免疫分析与临床》2011,18(2):70-72
为探讨乙肝患者血清病毒标志物(HBV-M)和乙肝病毒DNA(HBV-DNA)含量之间的关系,分离618例乙肝患者血清标本,采用电化学发光免疫分析法检测乙肝两对半(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb),实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法检测HBV-DNA含量.结果显示,618例患者血清中,HB... 相似文献
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T Moestrup B G Hansson A Widell J Blomberg E Nordenfelt 《Journal of medical virology》1985,17(4):337-344
Sera from 79 patients with acute self-limiting hepatitis, 17 patients with acute hepatitis B evolving into chronic HBsAg carriership, and 43 chronic HBsAg carriers without a history of acute hepatitis were analyzed for presence of hepatitis B virus (HBV)-DNA by a molecular hybridization technique. In acute self-limiting hepatitis, HBV-DNA was cleared within a few weeks after the onset of clinical symptoms. The longest period of DNA positivity observed in this group was 42 days. In 29 of 52 patients HBV-DNA was cleared before HBeAg disappeared. Among 17 patients who became chronic HBsAg carriers, HBV-DNA was present for more than 6 months in all but one. Most of the HBsAg carriers eventually cleared HBV-DNA. The DNA clearance frequently preceeded the conversion of HBeAg to anti-HBe. Thus, in many patients there was a transitional period with HBeAg but without HBV-DNA. HBV-DNA was found to be a better index of impending chronicity than HBeAg since persistence of HBeAg for more than 42 days was noted in 10% of the patients who nevertheless cleared HBsAg within 6 months. By that time all those patients had turned negative for HBV-DNA. On the other hand, in 16 of the 17 patients who became chronic carriers of HBsAg, HBV-DNA as well as HBeAg persisted for more than 6 months. The present results also suggest that infectivity in acute hepatitis B is a feature mainly of the presymptomatic and early symptomatic period. 相似文献
15.
Li MH Xie Y Qiu GH Lu Y Zhao H Yang M Son SJ Liu F Zhang SF Chen LJ Cheng J Xu DZ 《中华实验和临床病毒学杂志》2011,25(1):26-28
目的探讨HBeAg阳性慢性乙型肝炎IFN-a治疗中HBsAg、HBeAg和HBV—DNA含量变化的相关性。方法对HBeAg阳性慢性乙型患者,在人组后进行IFN-a3MU-5MU隔日皮下注射一次的抗病毒治疗,于治疗前和治疗中的每间隔3个月收集血清,用实时荧光定量PCR进行HBV-DNA含量检测,血清HBsAg、HBeAg含量采用美国Abbott微粒化学发光法检测试剂,ARCHITECHi2000检测。HBV-DNA含量的检测下线为5×10^2拷贝/ml。分析IFN治疗过程中血清HBV—DNA、HBeAg和HBsAg含量变化的相关性。结果人组患者228例,男性162例,女性66例,年龄14~60岁,平均30.94岁;治疗过程中HBV—DNA、HBeAg和HBsAg的含量均逐渐下降干扰素治疗前以及治疗期间HBsAg与HBeAg、HBsAg与HBV—DNA含量变化间无相关性(P〉0.05);而血清HBeAg与HBV—DNA含量变化相关性有统计学意义(P〈0.05);随着干扰素治疗时间的延长,HBeAg与HBV—DNA含量逐渐下降,二者变化趋势一致。结论干扰素治疗前及治疗期间,HBeAg与HBV—DNA含量变化密切相关,而HBsAg含量变化与HBeAg和HBV—DNA含量变化无相关性,干扰素治疗期间需对三指标同时检测。 相似文献
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FQ—PCR检测乙型肝炎HBVM和前S1抗原不同模式的HBV—DNA含量及意义 总被引:1,自引:0,他引:1
目的评价实时荧光定量PCR(FQ—PCR)技术在乙型肝炎诊断和治疗中的应用价值。方法用FQ-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)同时检测693份初诊标本和治疗3个月前后231份复诊病人标本的HBVM和HBV-DNA。结果HBVM模式共16组,其中HBeAg(+)组HBV-DNA检出率98.3%,定量对数值均在6.49以上;HBeAg(-)但前S1抗原(+)组HBV-DNA检出率93.6%,定量对数值为4.48±1.40;HBsAg(+)HBcAb(+)前S1抗原(-)组HBV-DNA检出率51.6%,定量对数值为4.46±1.43;HB-sAg(+)HBeAg(-)HBcAb(-)组HBV—DNA检出率16.7%,定量对数值为4.29±0.43;HBsAg、HBeAg、前S1抗原同为(-)组HBV-DNA检出率很低且定量对数值也低。大、小三阳患者治疗3个月后HBV—DNA定量对数值改变1.5以上者,分别为50.0%、31.4%。结论FQ-PCR定量检测HBV-DNA对乙型肝炎诊断、治疗、预后判断具有重要的指导意义。 相似文献
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目的探讨HBV感染者血清中PreS1与HBV-DNA、HBeAg三者间的关系,进而评估PreS1在HBV感染、复制、诊断中的作用。方法收集1750例乙型肝炎患者血清,按不同HBV-M进行分组:HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)为A组,HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)为B组,HBsAg(+)、HBcAb(+)为C组,HBsAg(+)为D组,采用酶联免疫法(ELISA)检测乙肝病毒PreS1与HBV血清标志物,荧光定量PCR法检测HBV-DNA。结果以HBV-DNA&gt;5×102拷贝/mL为阳性诊断标准,不同HBV-M模式中,PreS1与HBV-DNA的检出率无显著差异(P&gt;0.01),PreS1与HBV-DNA的总符合率高于HBeAg与HBV-DNA的符合率,在HBeAg(-)患者中仍可不同程度地检出PreS1与HBV-DNA。结论PreS1可作为HBV感染、复制的一项新指标,在乙型肝炎诊断中具有很大的应用价值。 相似文献