恶性疟原虫AMA-1多态性及其在疫苗研制中的意义

恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原1(AMA-1)是一种主要的无性血液期疟疾疫苗候选抗 原。本文简述了AMA-1的生物学特性、结构及其在裂殖子入侵过程中的作用,对AMA-1的多态 性特点和分布规律以及近期在疟疾复合多价疫苗研制中的应用情况进行了综合分析。     

恶性疟原虫AMA-1(Ⅲ)基因在毕赤酵母系统中的高效表达

目的　利用毕赤酵母高效表达系统表达用于下游实验的恶性疟原虫AMA - 1(Ⅲ )重组蛋白。方法　将测序正确的AMA - 1(Ⅲ )基因插入毕赤酵母分泌型表达载体 pPIC9k中 ,用高压电穿孔转化法将目的基因转化入酵母感受态细胞GS115 ,筛选高拷贝转化子 ,利用甲醇进行诱导表达。表达产物用SDS -PAGE和免疫印迹进行检测。结果　AMA - 1(Ⅲ )蛋白表达于培养上清 ,蛋白的相对分子质量分别为 16 .3ku ,免疫印迹结果表明AMA - 1(Ⅲ )基因表达蛋白能被抗AMA - 1(Ⅲ )的单抗所识别 ,出现特异条带 ,推算AMA - 1(Ⅲ )蛋白的表达量为 0 .8g/L。 结论　酵母细胞表达系统可高效表达在构象方面接近天然蛋白的AMA - 1(Ⅲ )重组蛋白     

恶性疟原虫中国海南株裂殖子表面蛋白1 基因的序列分析

目的:测定恶性疟原虫中国海南分离株MSP1 基因的全序列,并进行多态性分析。方法:来自海南省保亭县2 例恶性疟患者的血样(分别滴在滤纸上)直接制备基因组DNA 后,用MSP1 基因特异的5 对寡核苷酸引物在体外扩增目的基因,用ABIPRISMTM末端标记循环测序试剂盒进行直接测序,并将测序结果与已知的等位基因型进行比较分析。结果:获得了2 个恶性疟原虫中国分离株MSP1 基因的全序列,与已知的MSP1 等位基因型进行序列比较,证实其属于MAD20 型。推导其氨基酸序列除了第2 区、第4 区和第8 区以外,其余序列完全一致。其中HN2 的第4 区含K1 型序列。结论:两株恶性疟原虫海南株的MSP1 基因属于MAD20 型,与MAD20 等位基因比较,其推导的氨基酸序列存在一些小差异。本文首次提供了恶性疟原虫中国(海南)分离株MSP1 基因多态性的依据     

恶性疟原虫AMA—1多态性及其在疫苗研制中的意义

恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原1（AMA－1）是一种主要的无性血液期疟疾疫苗候选抗原。本简述了AMA－1的生物学特性、结构及其在裂殖子入侵过程中的作用,对AMA－1的多态性特点和分布规律以及近期在疟疾复合多价疫苗研制中的应用情况进行了综合分析。     

恶性疟原虫云南勐捧分离株裂殖子顶端膜抗原Ⅰ序列分析

根据文献报道的恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原IDNA序列的保守区，设计并合成两对20聚寡核苷酸作引物，对恶性疟原虫勐捧分离株DNA进行PCR扩增。扩增产物经BamHI和EcoRI双酶解后，克隆入具有相应末端的M13mp8和M13mp8载体，转化JPA101，生长于含X－gal的培基上，抽提无色噬菌斑DNA，以DNA序列测定仪进行DNA序列测定，并自动翻释成氨基酸序列。用双脱氧终止法测定部分DNA序列，并与DNA序列测定仪测定的序列进行比较。结果表明，扩增的序列长度为1773个碱基，编码591个氨基酸。与参照序列比较，有17个点突变，引起15个密码子的取代，其中，除1个密码子为同义取代外，其余密码子均为非同义取代，造成14个氨基酸的取代。点突变在序列中呈散在分布，但在氨基酸序列中第160－210位相对较集中。     

恶性疟原虫中国海南株裂殖子表面蛋白1 基因的序列分析(英文)

目的:测定恶性疟原虫中国海南分离株MSP1 基因的全序列,并进行多态性分析。方法:来自海南省保亭县2 例恶性疟患者的血样(分别滴在滤纸上)直接制备基因组DNA 后,用MSP1 基因特异的5 对寡核苷酸引物在体外扩增目的基因,用ABIPRISMTM末端标记循环测序试剂盒进行直接测序,并将测序结果与已知的等位基因型进行比较分析。结果:获得了2 个恶性疟原虫中国分离株MSP1 基因的全序列,与已知的MSP1 等位基因型进行序列比较,证实其属于MAD20 型。推导其氨基酸序列除了第2 区、第4 区和第8 区以外,其余序列完全一致。其中HN2 的第4 区含K1 型序列。结论:两株恶性疟原虫海南株的MSP1 基因属于MAD20 型,与MAD20 等位基因比较,其推导的氨基酸序列存在一些小差异。本文首次提供了恶性疟原虫中国(海南)分离株MSP1 基因多态性的依据     

我国云南、海南恶性疟原虫顶端膜抗原1基因结构域Ⅲ多态性分析

目的 分析中国云南、海南两省恶性疟原虫顶端膜抗原1(apical membrane antigen 1,AMA-1)(Ⅲ)多态性.方法 收集海南、云南感染恶性疟原虫患者的血液187份,提取血样基因组DNA.设计两对引物扩增AMA-1(Ⅲ)基因,将PCR产物进行测序,分析其单倍型多样性.结果 187份样品中的AMA-1(Ⅲ)基因有23种单倍型,云南株有21种,海南株7种,海南有2种单倍型未在云南株中发现,云南株单倍型多样性高于海南株.AMA-1(Ⅲ)基因有9个多态位点,云南株有3份样品451位氨基酸残基的同义突变,云南、海南这些位点每种突变出现的比例不同.结论 恶性疟原虫AMA-1(Ⅲ)基因多态性在云南、海南两省各有其特点,对此结构域的群体遗传多样性分析可为针对此区域疟疾疫苗的设计提供有价值的信息.     

恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48/45基因编码序列的体外扩增

目的：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs和Pfs48／45的基因序列,为进一步对其进行克隆和体外高效表达创造条件。方法：特定寡核苷酸引物的设计、合成与纯化;恶性疟原虫FCC1／HN株体外培养;利用碱裂解法从培养的恶性疟原虫FCC1／HN株提取染色体DNA;PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析。结果：从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中特异扩增出编码Pfs25和Pfs48／45基因序列,其片段大小分别为657bp和1,359bp。而用间日疟原虫基因组DNA为模板作对照,无扩增条带出现。结论：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48／45基因序列与预期长度相符合,从而,为该基因的克隆、测序和表达奠定基础。     

恶性疟原虫海南株CTP基因的克隆测序及序列分析

目的 测定恶性疟原虫（P.f）海南株CTP基因序列,了解该虫株CTP基因序列与其它种类的CTP基因序列的差异,用于药物靶位的筛选。方法 用PCR的方法特异性的扩增CTP基因,并将此基因克隆于测序载体pUC19,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序。结果 我国海南株的CTP基因序列与其它的CTP基因有不同程度的差异。结论 P.f CTP作为潜在的抗疟药物靶值得进一步深入研究。     

恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)乳酸脱氢酶基因的分子克隆及序列分析

目的　了解恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)乳酸脱氢酶基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法　PCR扩增恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)LDH基因全编码区 ,产物经EcoRⅠ +SalⅠ酶切后 ,定向克隆至pGEX - 4T - 1表达质粒 ,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序 ,与其它生物LDH进行同源性分析。 结果　成功地扩增了恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)LDH编码基因 ,大小为 95 1bp ,无内含子 ,与Honduras株LDH基因相比 ,两者有 5个碱基不同 ,推导的氨基酸序列有 4个氨基酸残基不同 ,与刚地弓形虫、隐孢子虫和芽孢杆菌的同源性分别为 49.0 6 % (15 6 / 318)、42 .5 8% (132 / 310 )、31.6 1% (98/310 )。与人的LDH -A、LDH -B和LDH -C的同源性分别为 30 .19% (93/ 30 8)、2 9.5 5 % (91/ 30 8)和 33.44 % (10 4/ 311)。结论　FCC1/HN株与Honduras株LDH高度同源 ,疟原虫LDH明显不同于其它生物LDH     

恶性疟原虫FCC1/HN(CQS)株Pfmdr1、Cg1基因T-A克隆及序列分析

目的　将恶性疟原虫FCC1/HN株 (CQS)Pfmdr1和Cg1全基因编码区克隆入测序载体 ,测定其序列 ,为以后研究其与疟原虫耐药性的关系奠定基础。方法　利用PCR扩增技术 ,分 3个片段从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中 ,特异扩增Pfmdr1全基因编码序列 ;分 2个片段特异扩增Cg1全基因编码序列。扩增产物经纯化回收后 ,T -A克隆入测序载体 pMD18-T ,转化大肠杆菌 (E coli)JM 10 9,筛选阳性克隆 ,并进行双酶切及PCR扩增鉴定 ,获得阳性重组质粒 ,用Sanger双脱氧链终止法进行DNA测定。结果　CQSFCC1/HN株Pfmdr1基因序列与CQSFc2 7株同源性高 ,全长 4 2 4 8bp ,编码 14 15个氨基酸 ;测得Cg1基因全长为 2 82 0bp ,编码 939个氨基酸 ,存在串联α重复序列。 结论　恶性疟原虫FCC1/HN(CQS)株Pfmdr1和Cg1全基因编码序列的测定 ,为以后研究耐药性虫株的上述基因以及它们与疟原虫耐药性的关系奠定基础。     

Differential ability of specific regions of Plasmodium falciparum sexual-stage antigen, Pfs230, to induce malaria transmission-blocking immunity

Antibodies raised against an Escherichia coli-produced recombinant protein encoding a 76-kDa section (region C) of malaria transmission-blocking vaccine candidate, Pfs230, have previously been shown to significantly reduce the ability of Plasmodium falciparum parasites to infect mosquitoes (71.2-89.8%). To further define the region of the Pfs230 required for transmission-blocking activity, four recombinant proteins each encoding a section of region C (Pfs230 amino acids 443-1132) were produced using the same E. coli expression system and tested for immunogenicity in mice: (i) r230/MBP.C5' encodes the first half of region C (amino acids 443-791, six cysteines); (ii) r230/MBP.CM1 encodes only cysteine motif (CM) 1 (amino acids 583-913, eight cysteines); (iii) r230/MBP.C1.6 (amino acids 453-913, eight cysteines) also includes all of CM1; and (iv) r230/MBP.C2 encodes only CM2 (amino acids 914-1268, 11 cysteines). All the recombinant proteins induced antibodies that recognized parasite-produced Pfs230, but the titre of the Pfs230 specific-antibodies generated varied, C = C1.6 = C5' > CM1 > CM2. Two recombinants, r230/MBP.C5' and r230/MBP.C1.6, induced antibody titres that were equivalent to or greater than the titre generated by r230/MBP.C. However, in contrast to r230/MBP.C, none of the recombinants induced antibodies that effectively blocked parasite infectivity to mosquitoes. This suggests that the inclusion of amino acids 914-1132 is important for the production of the transmission-blocking epitope present in region C.     

恶性疟原虫海南株CTP基因测序重组质粒及真核表达重组质粒的构建

目的　构建恶性疟原虫CTP基因的测序重组质粒和真核表达重组质粒 ,以便进一步研究CTP基因的结构与功能。方法　根据已发表恶性疟原虫CTP基因的序列〔1〕,设计并合成一对引物。将扩增的CTP基因的PCR产物连接于测序载体pUC19上 ,经测序反应确定无误。用HindⅢ和BamHⅠ双酶切将CTP基因从测序载体中切下 ,构建于真核表达载体pcDNA3上。 结果　构建了恶性疟原虫CTP基因的测序重组质粒 ,并对其进行了测序。并将恶性疟原虫的CTP基因从测序重组质粒中切下 ,克隆进真核表达重组质粒 pcDNA3。 结论　成功地构建了恶性疟原虫CTP基因的测序重组质粒和真核表达重组质粒 ,为进一步研究其结构与功能奠定了基础     

Human immune recognition of recombinant proteins representing discrete domains of the Plasmodium falciparum gamete surface protein, Pfs230

The 230 kD gamelocyte/gamete-specific surface protein of Plasmodium falciparum, Pfs230, is a target of antibodies which inhibit the development of the parasite inside the mosquito vector. A transmission blocking vaccine based on Pfs230 may be a powerful tool for malaria control. As a first step, Pfs230 has been expressed in E. coli as a series of recombinant proteins, fused to maltose binding protein. We have used the fusion proteins to assess cellular and humoral immune responses to Pfs230 in malaria-immune adult Gambian blood donors; responses to the fusion proteins have been compared with responses to native Pfs230. The tetrapeptide repeat region of the molecule appears to be immunodominant for both antibody-producing cells and peripheral blood T cells. We postulate that this may represent a mechanism for immune evasion since the N-terminal repeat region of the molecule is cleaved from the mature protein and shed into the plasma. Responses to fusion proteins representing the seven-cysteine motifs were correlated within individual donors, suggesting that cross-reactive epitopes occur within the motifs. Antibody responses to recombinant proteins were poorly correlated with responses to native Pfs230 suggesting that dominant epitopes of the native protein are not adequately represented in the recombinant proteins. Although prokaryotic expression products may be suitable for induction of cellular immune responses to Pfs230, alternative expression systems may be needed for creation of appropriate B cell epitopes.     

恶性疟原虫FCC1/HN株嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因的克隆和原核表达

目的 从恶性疟原虫基因组中扩增、克隆恶性疟原虫嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因,并进行原核表达产物。方法根据恶性疟原虫FCB株嘌呤核酸磷酸化酶基因编码序列,设计一对引物,引入EcoR I和Xho I。采用PCR技术从恶性疟原虫FCC/HN株基因组DNA中特异扩增PNP基因。纯化后扩增产物用EcoR I和Xho I双酶切后,定向克隆入原核质粒pET30a( )和真核质粒pcDNA3,重组质粒pET30a( )-PNP转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组子后,用PCR、EcoRI Xho I双酶切和DNA序列测定鉴定。用IPTG诱导重组质粒pET30a( )-PNP表达融合蛋白。结果 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组中特异扩增出PNP基因,将扩增的目的基因亚向插入pET30a( )和pcDNA3表达质粒的EcoR I和XhoI位点;重组子pET30a( )-PNP在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达中表达,表达融合蛋白分子量为31.4kDa。结论 从恶性疟原虫基因组中获取PNP基因,并成功构建pET30a( )-PNP和pcDNA3-PNP重组质粒,获得PNP原核表达产物。     

恶性疟原虫AMA-1基因变异区在大肠杆菌中的诱导表达

目的　恶性疟原虫 (P.f .) AMA- 1蛋白抗原在大肠杆菌中的表达。　方法　以 FCC1/ HN基因组DNA作为模板 PCR扩增 AMA- 1基因变异区 ,扩增产物以 Bam H 和 H ind 双酶酶切后作为插入片段 ,与具有相同粘性末端的表达质粒 p QE- 40连接 ,并用 DNA自动测序仪测定 AMA- 1DNA片段的序列。取含重组表达质粒的重组菌株以 IPTG进行诱导表达 ,表达产物以 SDS- PAGE电泳和以兔抗 AMA- 1抗血清进行 Western blotting分析鉴定。　结果　 FCC1/ HN AMA- 1基因变异区 DNA序列长度为 5 0 6 bp,预计编码 16 8个氨基酸。 Westernblotting分析确认诱导后的 SG130 0 9/ AMA- 1表达产物在分子量约 2 3.0 k Da处出现 1条与兔抗 AMA - 1抗血清特异反应的条带。　结论　 FCC1/ HN AMA- 1基因变异区在大肠杆菌中获得表达 ,Western blotting分析表明该蛋白片段含有特异抗原表位     

对恶性疟原虫FCC1/HN分离株AMA-1序列变异的见解

恶性疟原虫FCC1/HN分离株 (FCC1/HN )是 1977年 6月由北京生物制品研究所在海南省昌江县采集并建立体外培养 ,现已被我国多个研究室体外传代培养、广泛使用。本文通过FCC1/HN裂殖子顶端膜抗原 (AMA 1)序列变异 ,讨论其存在的不同克隆问题。1　恶性疟原虫AMA 1第 1区域序列FCC1/HN的AMA 1第 1区域第 1种序列引自文献 [1](本文称为FCC1 )。用PCR 克隆测序法测序 :提取FCC1/HN染色体DNA ,PCR扩增AMA 1第 1区域的DNA片段 ,克隆入测序质粒 ,转化大肠埃希菌 ,挑选 3个有插入片段的阳性菌落进行测序。FCC1/HN分离株AMA 1第…     

恶性疟原虫FCC1/HN株醛缩酶编码区基因的克隆及表达

目的　克隆恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)株糖酵解醛缩酶 (ALD)编码区基因。　方法　利用已知ALD基因序列设计一对特异性引物,从基因组DNA中用PCR扩增ALD基因,将其克隆入pQE30载体,阳性克隆经酶切鉴定后测序,在此基础上将重组质粒转化大肠埃希菌M15进行表达。　结果　PCR扩增后获得特异性扩增片段,测序结果显示我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与恶性疟原虫3D7株ALD基因序列完全相同。重组融合蛋白通过镍 次氮基三乙酸(NiNTA)亲和层析及阳离子交换层析进行纯化。　结论　我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与文献报道的恶性疟原虫3D7株ALD编码区基因序列相同,该融合蛋白在大肠埃希菌中获得表达