丙型肝炎病毒山东分离侏核衣壳蛋白区cDNA的序列测定

①目的 通过核衣壳蛋白区（Ｃ区）基因序列分析，对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）山东分离株进行定型。②方法 应用反康 套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）方法，从山东省ＨＣＶ抗体阳性血清听主增出ＨＣＶ Ｃ区基因的一个片段（４３２ｂｐ），对其进行ＴＡ克隆及测序，并通过ＤＮＡＳＩＳ软件和Ｇｅｎｅｂａｎｋ进行序列分析。③结果此分离株与基因型１ｂ的ＨＣＶ分离株同源性最高，与４个已知１ｂ型分离株的核苷酸相应     

丙型肝炎病毒山东分离株核衣壳蛋白区cDNA的序列测定

①目的　通过核衣壳蛋白区（ Ｃ区）基因序列分析,对丙型肝炎病毒（ Ｈ Ｃ Ｖ）山东分离株进行定型。②方法　应用反转录套式聚合酶链反应（ Ｒ Ｔｎｅｓｔｅｄ Ｐ Ｃ Ｒ）方法,从山东省 Ｈ Ｃ Ｖ 抗体阳性血清中扩增出 Ｈ Ｃ Ｖ Ｃ区基因的一个片段（４３２ｂｐ）,对其进行 Ｔ Ａ 克隆及测序,并通过 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ软件和 Ｇｅｎｅｂａｎｋ 进行序列分析。③结果　此分离株与基因型１ｂ 的 Ｈ Ｃ Ｖ 分离株同源性最高,与４ 个已知 １ｂ 型分离株的核苷酸相应序列同源性为 ９６．５２８％ ～９８．１４４％ ,其推导的氨基酸同源性为９４．４４４％ ～９６．０３２％ ．④结论　此分离株归为 １ｂ 型。     

庚型肝炎病毒非结构基因（NS）5区部分序列的一级结构及其变异

测定庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）非结构基因５（ＮＳ５）区部分基因序列。方法从３例献血员，２例肝硬化患者及１例非甲－戊型肝炎患者血清中通过逆转录－套式－聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长９９４ｂｐ的ｃＤＮＡ序列，ＰＣＲ产物纯化后以双脱氧末端终止法测定其序列。结果所分离的６株ＨＧＶＮＳ５区部分核苷酸序列与国外报道的３株（ＧＢＶ－Ｃ、ＰＮＦ２１６１、Ｒ１０２９１）比较，同源性为８７．２％～９３．９％；６株间同源性为９０．１％～９３．８％。根据所测得的６株ｃＤＮＡ序列推导出其编码的氨基酸序列，与国外发表的３株序列相比，同源性在９３．６％～９８．７％，６株之间为９３．６％～９８．４％。在此区内发现有１６个保守的脯氨酸残基及８个保守的半胱氨酸残基。结论从不同慢性肝脏疾病患者及献血员血清中分离出６株ＨＧＶ，其ＮＳ５区部分序列在核苷酸水平及氨基酸水平均较保守。可依赖此区序列设计诊断试剂     

庚型肝炎病毒不同地理株5‘端非编码区序列的变异性分析

目的：为明确了解中国不同地区（广东，云南，香港）庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）株５‘端非编码区（ＮＣＲ）序列的差异。方法：采用逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，从广东省２例，云南省１例，香港３例共６例ＨＧＶ感染者血浆中扩增ＨＧＶ５’ＮＣＲ ｃＤＮＡ片段，为２３８ｂｐ，ＰＣＲ产物纯化后直接经对脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。结果：中国ＨＧＶ株间５‘ＮＣＲ相应序列的同源性介乎９２．９３％￣９７．９８     

庚型肝炎病毒不同地理株5'端非编码区序列的变异性分析

目的：为明确了解中国不同地区（广东、云南、香港）庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）株５′端非编码区（ＮＣＲ）序列的差异。方法：采用逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术,从广东省２例、云南省１例、香港３例共６例ＨＧＶ感染者血浆中扩增ＨＧＶ５′ＮＣＲｃＤＮＡ片段,为２３８ｂｐ,ＰＣＲ产物纯化后直接经双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。结果：中国ＨＧＶ株间５′ＮＣＲ相应序列的同源性介乎９２９３％～９７９８％,与国外分离株比较,同源性介乎８６３６％～９１９２％。结论：中国ＨＧＶ株间５′ＮＣＲ相应序列的同源性较大,与国外分离株的同源性较小;碱基变异在序列中呈散在分布,部分区段变异较大;ＨＧＶ核酸变异与地域因素有关。     

HCV广东株5‘NCRcDNA的克隆及序列测定

从广东省１例慢性丙型肝炎病人血清中提取ＨＣＶＲＮＡ，随机引物逆转录为ｃＤＮＡ后用ＨＣＶ５’端非编码区（５’ＮＣＲ）特异引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ），扩增产物３０２ｂｐ，经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒，获得的重组质粒ｐＵＮ采用双脱氧链终止法测定核苷酸序列，与国内外多相株比较，核苷酸同源性介乎９２．６９％～１００％，其中与ＨＣＶⅡ（１ｂ）型的同源性最大，本文的测序结果可为引物设计提供依据，获得的Ｈ     

一株庚型肝炎病毒NS3区和NS5区部分基因序列的分析

用ＲＴ－ＰＣＲ的方法从非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病人血清中检测到一株庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）。其中扩增ＮＳ３区基因采用５６例循环周期减温ＰＣＲ方法；扩增ＮＳ５区基因采用３５个循环周期的正常ＰＣＲ方法。并对其ＰＣＲ产物进行了克隆测序。在ＮＳ３区，样品与ＧＢＶ－Ｃ和ＨＧＶ的核苷酸序列同源性分别为８４．２％和８９．９％；而在ＮＳ５区样品与ＨＢＶ－Ｖ和ＨＧＶ的核苷酸同源性分别为９４．９％和９８．     

抗HCV NS3抗原单克隆抗体的研制与初步鉴

目的：为研制抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ３抗原单克隆抗体,用于检测丙肝患者血清中的ＨＣＶＮＳ３抗原。方法：用基因工程表达的ＨＣＶ非结构区ＮＳ３蛋白与鼠血清白蛋白交联后,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,用杂交瘤技术获得能分泌单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的细胞株。结果：获得有实用价值的两株ＭｃＡｂ。两株ＭｃＡｂ与免疫抗原有较强的抗原－抗体反应,与ＨＣＶＮＳ４、ＮＳ５及核心区Ｃ３３肽、ＣＰ９、ＣＰ１０抗原无反应性,在竞争ＥＬＩＳＡ中,对ＨＣＶ－ＩｇＧ阳性血清有较好的抑制作用。结论：用基因工程表达的ＨＣＶ非结构区ＮＳ３蛋白,能够制备出有实用价值的单克隆抗体。     

丙型肝炎病毒NS_5区基因片段的克隆与表达

应用ＲＴ一ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区ＨＣＶ感染者血清中获得ＨＣＶＮＳ＿５区的基因克隆。经核苷酸序列的比较分析，此克隆片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。应用ＰＭＡＬ－ＣＲＩ质粒在大肠杆菌中高效表达了此基因片段，并获融合蛋白ＭＢＰ－ＨＣＶ·ＮＳ＿５，经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析证实该融合蛋白有较特异的ＨＣＶ抗原性，可用于ＨＣＶ感染的临床诊断和发病机制的研究。     

庚型肝炎病毒RNA NS3区基因分型

目的：探讨ＨＧＶ ＮＳ３区基因变异与基因型的关系。方法：对３２株ＮＳ３区序列进行酶切位点分析，比较中国株与ＧＢＶ－Ｃ株与已发表的ＨＧＶ ＮＳ３区酶切位点，选择特异性内切酶切点。结果：３２株ＮＳ３序列酶切位点分析表明存在５种基因型。１组：在４３３８位元ＨｈａＩ切点，而在４３６０位有ＨｈａＩ切点；２组，４３３８位及４３６０位均无ＨｈａＩ切点；３组：仅在４３３８位有ＨｈａＩ切点；４组：４３３８位及４３５     

丙型肝炎病毒2a型E2区基因cDNA的变异分析

目的 了解丙型肝炎病毒2a型基因组E2区序列的一级结构及变异特征，为进一步研究HCV包膜蛋白的生物学功能打下基础。方法 用逆转录套式多聚酶链反应(RT-nPR)法从1例NANB型肝炎患者血清中扩增出一条约1100bp的片段，以限制性内切酶EcoRI、HindⅢ双酶切后连入pUC19载体中，转化感受态细胞，经限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)和PCR法证实为阳性克隆后，用全自动序列分析仪测序。结果 测得约1100bp的核苷酸序列，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别与HCV-1、HC-C2、HCV-BK、HC-J6、HC-J8相应序列作比较，显示分离株HCV在核苷酸水平上与以上分离株的同源性分别为63．1％、64．2％、64．1％、86．9％、69．3％，在氨基酸水平上的同源性分别为69．6％、70．7％、69．6％、86．2％、83．1％。结论 分离株(HCV-JF)与HC-J6同属2a型。     

首例中国株乙型肝炎病毒D基因型全序列测定及分析

目的　测定并分析１例中国慢性无症状携带者感染的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｄ基因型的全基因序列。方法　用聚合 酶链式反应（ＰＣＲ）扩增ＨＢＶ全基因,将ＰＣＲ产物克隆后对其进行核酸序列分析并与已发表的ＨＢＶ毒株全序列进行 同源性比较;对 ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的３０株ＨＢＶ Ｄ基因型毒株的全序列进行系统进化树分析。结果　该病毒全基因长 ３１８２ｂｐ,为ａｙｗ亚型,Ｄ基因型;此毒株全基因ＧｅｎＢａｎｋ　ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ为ＡＦ２８０８１７;与ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的ＨＢＶＤ 基因型全序列同源性为９８．３％～９４．5％,与已发表的 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ和Ｇ基因型全序列同源性均小于８９．５％。结论　首例中 国株 ＨＢＶ Ｄ 基因型全序列与源于瑞典的四株 ＨＢＶ Ｄ 基因型全基因的进化距离最近。     

丙型肝炎病毒6a型感染的状态与分析

目的:初步探讨丙型肝炎病毒6a型感染的状态.方法:对经HCV 5'非编码区(5'NCR)复合酶切分型结果为6a的3例样本(95,126,150)进行5'NCR和NS5B区的扩增、测序,然后将5'NCR和NS5B区序列与24个HCV全基因参考序列(均来自GenBank)比对并构建遗传进化树.结果:对3例分型结果为6a型的样品进行5'NCR序列分析发现,这3例样品都具有6a型特征性的第-145位的CA碱基插入,且与6a型参考序列Y12083的同源性最高,分别为0.993,0.987,0.993;进化树分析表明,3例样本都属于6a型.然而NS5B区的序列分析结果表明,95,126,150在NS5B区与1b型参考序列HC-J4的同源性最高,分别为0.934,0.930,0.926;进化树分析结果也显示它们都属于1b型,两个区的分型结果完全不同.为排除引物扩增效率的问题,使用6a型特异的引物对3例样品进行NS5B区扩增,3例样本扩增结果均为阴性.结论:我们发现的HCV 6a型的感染中,存在3例样品5'NCR和NS5B区的分型结果不一致,尚无直接证据证明其是否发生了基因重组.但是,我们的结果提示,在两个或两个以上区域进行HCV分型是非常重要的,且HCV基因型之间的重组必须纳入到HCV分型的考虑中来.     

Comparison between homologies of E2/NS1 gene from genotype III Chinese isolates of hepatitis C virus and that from reported isolates

ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）ｉｓｔｈｅｍａｊｏｒｃａｕｓａｔｉｖｅａｇｅｎｔｏｆｎｏｎＡ,ｎｏｎＢｈｅｐａｔｉｔｉｓｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔｔｈｅｗｏｒｌｄ．１Ｒｅｃｅｎｔｌｙ,ｉｔｗａｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｐｒｏｄｕｃｔｅｎｃｏｄ...     

山东省HIV-1分离株env基因C2-V3区序列测定

①目的 了解山东省1型人类免疫缺陷病毒（HIV－1）的分子流行病学特征。②方法 应用套式聚合酶链反应扩增8例HIV－1前病毒基因组的env基因C2－V3区,扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接,克隆于大肠杆菌中,提取阳性克隆的重组质粒进行测序,用PHYLIP软件分析核苷酸及氨基酸序列。③结果 8株HIV－1毒株V3环顶端的四肽基序均为GPGR,氨基酸变异不显著,各株间基因离散率为1.0%-5.2%,侧翼区碱基的变异频率明显高于V3区,并发现1例毒株出现双V3环现象。④结论 山东省的HIV－1分离株以B亚型HIV－1毒株为主,同时发现的双V3环变异现象,可能是HIV－1毒株逃避宿主免疫系统攻击的一种新模式。     

对比分析5'-UTR和NS5b区序列确定广东地区HCV基因亚型

［摘要］ 目的 对比丙型肝炎病毒（HCV）不同区段系统进化分析法基因分型的差异,探讨广东地区丙型肝炎患者的HCV基因亚型分布。方法 RT-PCR分别扩增HCV5'-UTR（71nt-311nt）共241bp和NS5b区（8249nt-8650nt）共402bp的片段。序列分析后进行系统进化分析以确定病毒基因型及亚型。结果 HCV NS5b区段分型74例,其中1b亚型51例,2a亚型10例,6a亚型8例,3a亚型2例,3b亚型2例,1a亚型1例;5'UTR区分型74例,其中1型45例,2型11例,6a亚型10例,3a亚型3例,3b亚型5例;两区段共同分型49例,47例基因型一致,2例不同。结论 对比分析HCV不同区段基因序列,可深化对HCV基因型和亚型的了解。初步表明广东地区慢性丙型肝炎患者HCV基因亚型分布以1b为主;其次为2a、6a,两者比例相当;3b、3a也占有一定比例。 ［关键词］丙型肝炎病毒;基因型;5'-非编码区;NS5b区;系统进化分析     

漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征分析

目的了解漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征。方法对2010年漳州市的5株肠道病毒71型分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4．0软件构建系统发生树。结果5株肠道病毒71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,且与2008年安徽阜阳流行株Fuyang．Anhui．P．R．C-17．08-2的VP1区核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高,分别为98．2％-98．8％和99．7％-100．0％。5株肠道病毒71型分离株间的核苷酸序列同源性为97．2％-99．8％．氨基酸序列同源性为99．3％～100．0％。氨基酸在98位和218位这两个位点发生了特异性变异。VP1区基因遗传进化分析表明,漳州市所有分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论5株肠道病毒71型分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支．与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型完全-致。     

IGS1、ITS和D1/D2区在毛孢子菌鉴定中的意义及国内阿萨希毛孢子菌基因分型研究

目的 比较不同DNA区域在毛孢子菌分子学鉴定方面的灵敏性和特异性以及国内临床分离5株阿萨希毛孢子菌(T. Asahii)基因型的研究.方法 用玻璃珠法提取总DNA,用D1/D2(26s)、ITS、IGS1区的特异性引物进行PCR扩增,克隆、测序;用CLUSTAL X 1.83进行比对分析,构建系统发生树并进行基因分型.结果 T. Asahii(CBS2479)、真皮毛孢子菌(T. Dermatis)、赖巴克斯毛孢子菌(T. Laibachii)3株菌D1/D2长度分别为:640、639、637 bp;ITS区长度分别为:541、528、531 bp;IGS1区长度分别为:643、515、411 bp.临床分离5株T. Asahii IGS1区长度均为643 bp.所有毛孢子菌D1/D2区序列相似性为:89%～99%,ITS区为85%～99%,IGS1区为11%～95%.临床分离菌株BZP07001,BZP07002,BZP07004,BZP07005属于基因型Ⅰ,菌株BZP07003属于基因型Ⅳ.结论 在鉴别系统发生关系较近的毛孢子菌时IGS1区序列分析优于D1/D2、ITS区,IGS1区序列分析具有更高的灵敏性和特异性.国内临床分离5株T. Asahii分属基因型Ⅰ和Ⅳ.     

庚型肝炎病毒"重庆株"NS3区核苷酸和氨基酸序列分析

目的：研究庚型肝炎病毒(HGV)“重庆株”(CHq)在NS3区与其它一些分离株之间核苷酸和氨基酸序列的同源性。方法：采用RT-套式PCR,从中国重庆市的庚型肝炎患血清中分离出HGV-NS3区基因cDNA并测序,然后经计算机软件对其核苷酸序列及由此推导的氨基酸序列进行分析。结果：HGV“重庆株”NS3区与HGV-l(U44402)、HGV-2(U45966)、GBV-C(U63715)及HGV C964 NS3区之间,核苷酸序列同源性分别为85．96％、83．67％、85．96％和96．28％;氨基酸序列同源性分别为97．4％、97．4％、97．4％和96．6％。结论：在NS3区核苷酸序列方面,“CHq”与HGVC964同源性最高,而在NS3区氨基酸序列方面,“CHq”与其它4株HGV的同源性均在96％以上,无明显差别。提示以NS3蛋白为抗原,对感染不同HGV株的患血清进行免疫学检测,其检出率应无显差异。