抗癫痫肽/GST融合表达及包涵体蛋白复性纯化

[目的]获得高纯度的谷胱甘肽硫转移酶/抗癫痫肽(GST-AEP)融合蛋白。[方法]异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组大肠杆菌DH5α表达GST-AEP融合蛋白,融合蛋白包涵体经过洗涤、变性、复性后,通过12%SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,凝胶薄层扫描检测其纯度,透析管进一步纯化蛋白,BCA法定量。[结果]从融合蛋白包涵体中获得了纯度达90%以上的目的蛋白,定量约0.163μg/μl。[结论]建立了有效纯化融合蛋白包涵体GST-AEP的方法,为对AEP进一步的相关研究奠定了基础。     

蓝藻抗病毒蛋白N基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

目的:构建蓝藻抗病毒蛋白(CV-N)基因原核表达载体,表达、纯化并复性其重组蛋白。方法:根据GenBank中CV-N的全基因序列,人工合成CV-N序列,进行PCR扩增。将扩增的PCR产物克隆至原核表达载体pET30a( )上,构建重组表达载体pET30a-CV-N,测序鉴定后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达蛋白,SDS-PAGE和Westenblot鉴定表达产物,Ni Sepharose柱纯化目的蛋白,稀释法复性蛋白。结果:重组质粒pET30a-CV-N测序结果显示,插入片段为303 bp,与GenBank中的CV-N基因序列完全相同。经IPTG诱导的CV-N基因可在E.coli中高效表达;SDS-PAGE分析表明,相对分子质量11000处出现一条新条带,主要以包涵体形式存在,37℃诱导2、4、6、8 h后,表达蛋白分别占菌体蛋白的3.87%、19.10%、33.98%和31.58%。Western blot结果显示,重组蛋白能与抗His单抗特异性反应。将诱导6 h的菌体超声破碎后,Ni Sepharose柱纯化,相对分子质量11 000处显示出清晰的单一条带,且蛋白复性效果良好。结论:成功地构建了CV-N原核表达载体,表达并纯化出重组蛋白,为深入研究其抗病毒的活性奠定了基础。     

SA-TNF-α融合蛋白高效表达、纯化及复性研究

目的 研究链亲和素标记的人肿瘤坏死因子α(SA-TNF-α)融合蛋白的纯化、复性方法 ,并研究其生物学功能.方法 在大肠杆菌中表达SA-TNF-α融合蛋白,对表达的SA-TNF-α融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,分别在尿素体系和盐酸胍体系中复性,Western blot对其进行鉴定.MTT法检测SA-TNF-α融合蛋白对L929细胞的杀伤活性,流式细胞仪分析SA-TNF-α融合蛋白对生物素化的MB49细胞锚定修饰率.结果 SA-TNF-α融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,表达的目标蛋白占菌体蛋白30%以上,镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱纯化的SA-TNF-α融合蛋白纯度达到95.7%,经过两种体系复性形成的SA-TNF-α融合蛋白的二聚体和多聚体均具有双功能活性:既对L929细胞有杀伤活性又能锚定修饰生物素化的MB49细胞,锚定修饰率大于90%.结论 初步建立了SA-TNF-α融合蛋白制备工艺,SA- TNF-α二聚体和多聚体均具有双功能活性,SA-TNF-α融合蛋白的研制有望为肿瘤的治疗提供新的治疗方法 及新型药物.     

重组人白细胞介素2—绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的 探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2－绿脓杆菌外毒素（IL－2－PE66^4lu）融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法 采用该所发明的新方法提纯包涵体，包涵体复性后，样品经DEAE＝SepharoseFF离子交换层析，获得融合蛋白纯品。结果 获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95％，复性咽收率为80％。结论 此包涵体分离纯化技术简便、实用，可为中试研究和规模化生产提供基础。     

重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素(IL2-PE664Glu)融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法采用该所发明的新方法提纯包涵体,包涵体复性后,样品经DEAE-SepharoseFF离子交换层析,获得融合蛋白纯品。结果获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95%,复性回收率为80%。结论此包涵体分离纯化技术简便、实用,可为中试研究和规模化生产提供基础。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的 建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法 将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH／pGEX—4T—1转化到宿主菌BL21，该GDH／GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达，经SDS—PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂／去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8mol／L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性，并通过浊度分析、非还原SDS—PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH／GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果 经SDS—PAGE分析表明，GDH／GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25％左右；浊度分析表明：稀释复性法优于其它两种方法，同时20mmol／L，Tris—HCI、1mmoH，EDTA、pH8．5及GSSG／GSH=1：10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件，其复性回收率可达90％以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论 通过稀释复性，二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH／GST融合蛋白。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH/ pGEX-4T-1转化到宿主菌BL21,该GDH/GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达,经SDS-PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂/去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8 mol/L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性,并通过浊度分析、非还原SDS-PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH/GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果经SDS-PAGE分析表明,GDH/GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25%左右;浊度分析表明:稀释复性法优于其它两种方法,同时20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH8.5及GSSG/GSH=1∶10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件,其复性回收率可达90%以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论通过稀释复性,二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH/GST融合蛋白。     

重组hEGF-TCS融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的 构建新型人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)和天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)融合蛋白的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化EGF-TCS融合蛋白.方法 利用基因工程技术将人表皮生长因子EGF和天花粉蛋白基因连接起来,克隆到高效表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-EGF-TCS.并在大肠杆菌M15中表达该融合蛋白(EGF-TCS).产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化.结果 重组表达质粒pQE30-EGF-TCS在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达.目的蛋白占细胞总蛋白的40%左右,以可溶性形式存在,表达上清柱纯化纯度达95%以上.结论 应用基因工程技术,成功构建了融合蛋白EGF-TCS,为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定了基础.     

基因重组蛋白L243诱导表达包涵体的变性、复性与纯化

目的 对来自于日本七鳃鳗的基因重组蛋白L243包涵体进行变性、复性与纯化,以获得成分均一的活性蛋白.方法 以6 mol/L尿素为变性剂,以0.1 mol/L氧化型谷胱甘肽及0.9 mol/L还原型谷胱甘肽为复性剂,对构建于pET23b的日本七鳃鳗L243基因在大肠杆菌Rosetta中表达的包涵体进行了的变性、复性与组氨酸亲和层析纯化.结果 经变性、复性后,获得了均质的L243纯化蛋白,该蛋白的复性率达80%.结论 成功对上述重组蛋白包涵体进行了变性、复性及纯化,为后续与此蛋白相关的生物活性测定奠定了物质基础.     

重组人白细胞介素—2／粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的：研究重组人白细胞介素-2/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法：常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得副合蛋。结果：获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论：此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的研究重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得融合蛋白。结果获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

重组人胶原绑定骨形态发生蛋白2在大肠杆菌中的表达、纯化与复性

目的: 利用大肠杆菌表达体系制备带有胶原结合结构域(CBD)的骨形态发生蛋白2(BMP2),研究CBD-BMP2表达、纯化及复性的条件和方法。方法: 将具有胶原结合能力的CBD基因序列克隆入BMP2基因序列的N端,构建重组蛋白表达质粒pet21b/CBD-BMP2,转化入工程性大肠杆菌BL21菌株内;37℃条件下添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)持续诱导表达;采用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化;运用超纯水稀释复性法对纯化后的CBD-BMP2进行复性;0.22 μm微孔滤膜对复性后蛋白除菌,通过除菌前后蛋白浓度比值计算回收率;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白表达、纯化以及复性;BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。结果: 重组质粒pet21b/CBD-BMP2在工程性大肠杆菌中得到充分表达;CBD-BMP2以包涵体形式表达;SDS-PAGE分析,8 mol·L^-1尿素存在条件下目的蛋白溶解于裂解液上清中,经纯化后目的蛋白单体存在于洗脱液B中,单体相对分子质量约为14000;稀释复性后SDS-PAGE分析,相对分子质量14000及28000处可见2条清晰条带,重组蛋白单链成功复性为二聚体结构,相对分子质量约为28000;过滤除菌前后目的蛋白浓度分别为110和80 mg·L^-1,回收率约为73%。结论: 重组CBD-BMP2载体成功转化至大肠杆菌内,CBD-BMP2蛋白得到了高效的表达和复性。建立了利用原核表达体系制备重组CBD-BMP2蛋白的实验方法。     

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST-p16融合蛋白。方法以质粒pM-p16为模板,扩增出p16基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1,将所构建的重组质粒pGEX-p16转化大肠杆菌B121并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16．抗体特异性识别。结论本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GSTipl6融合蛋白并可用于以后的实验研究。     

活性SET7/9融合蛋白的表达与纯化

目的:表达与纯化活性GST-SET7/9融合蛋白(SET7/9融合蛋白).方法:以含人SET7/9基因结构域全长cDNA的pCMV-SET7/9质粒为模板,聚合酶链反应(PCR)法扩增获得目的基因片段,将测序正确的目的基因片段经EcoR Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切,插入载体pGEX-6P-3中,构得质粒经转染和异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,纯化后采用组蛋白甲基化转移酶(HMT)测定法鉴定蛋白活性.结果:构成pGEX-SET7/9重组质粒,表达分子质量约为77 kD的融合蛋白,纯化后测得CPM值明显高于对照组.结论:pGEX-SET7/9可表达高活性的SET7/9融合蛋白.     

PTD-p53 融合蛋白的表达、纯化及其对肝癌细胞的转导活性

目的：原核表达野生型p53与PTD的融合蛋白,检测PTD介导p53进入肝癌细胞的效率。方法：利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTATHA和pET32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将PTD-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测PTD-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果：成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了p53融合蛋白及p53蛋白,证实PTD-p53可以高效地转入HepG2细胞。结论：PTD-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用PTD-p53蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。     

重组人骨形成蛋白-7成熟肽的表达、纯化及活性的研究

目的:研究重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7m)羧基端140个氨基酸成熟肽的大肠杆菌表达、纯化及活性,为其实际应用打下基础.方法:将编码此成熟肽的cDNA亚克隆入含PL启动子的表达质粒pDH2中,构建表达质粒pDH2-B7m,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达;通过包涵体洗涤、离子交换层析纯化目的蛋白;用Western blot验证透析复性后表达蛋白的抗原性,用含荧光素酶报告基因专门用于检测BMP活性的细胞株C2C12-K4检测其活性.结果:成功构建了PL启动子控制的原核表达载体pDH2-B7m;42℃诱导5 h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白40.3%,表达产物以包涵体形式存在.包涵体经洗涤、离子交换层析纯化,目的蛋白纯度至少在96.0%以上.Western blot实验证实其抗原性,细胞株C2C12-K4反应的检测表明透析复性后的rhBMP-7m有较强的活性.结论:成功地在E.coli中表达了hBMP-7m重组蛋白并证明其有较强的生物活性.     

PCP-2胞外区/Fc融合蛋白的真核表达、纯化及其生物学活性鉴定

目的:构建PCP-2胞外区(PCP-2EC)与人免疫球蛋白IgG Fc融合蛋白表达载体,在哺乳动物细胞中表达并纯化PCP-2EC/Fc蛋白,研究其在神经细胞黏附中发挥的作用.方法:以PBLIISK-PCP-2为模板扩增PCP-2EC片段,定向插入真核表达载体pIGplus;重组质粒分别转染COS-7细胞和293细胞,可溶性表达PCP-2EC/Fc融合蛋白,并通过金葡菌蛋白A特异性纯化;以此融合蛋白作为基质,观察原代培养神经元的黏附情况.结果:成功构建PCP-2EC/Fc融合蛋白表达载体,表达载体的构建与预期设计相符;进一步在哺乳动物细胞中表达并纯化PCP-2EC/Fc蛋白;PCP-2EC/Fc蛋白可以促进原代培养神经元的黏附作用.结论:本研究成功地构建了PCP-2EC/Fc融合蛋白真核表达载体,获得有活性的PCP-2胞外区可溶性分子,初步研究发现其在神经细胞黏附中发挥促进作用,为后续神经及其他领域中的功能研究奠定基础.