稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立

目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达

目的 构建HPV 18 L1－E6，L1－E7嵌合基因的表达载体，并在CHO细胞中表达。方法 克隆HPV18 L1－E6和L1－E7基因，插入中介载体pGEMT-Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法，突变L1－E6，L1－E7基因序列中与转化作用相关的位点，分别与L1基因连接后插入真核表达载体pVAX1，构建真核表达质粒pVAX-1L1 E6Mxx,L1E7Mxx。用磷酸钙沉淀法，转染CHO细胞，以抗HPV－18L1，抗E6和抗E7特异性单克隆抗体（mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测。结果 ELISA检测显示，转染各种pVAX1-LIE6Mxx-L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P－N值均＞2．1；免疫细胞化学检测，在胞浆，胞核可见棕黄色颗粒。结论 我建的pVAX1-L1E6Mxx-E7Mxx融合蛋白质表达质粒，可在转当细胞内表达相应的L1－E6Mxx和L1－E7Mxx蛋白，为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础。     

HPV18E2蛋白CTL表位多肽的构建与表达

目的分析HPV18E2蛋白的CTL表位,合成并纯化这些表位多肽,构建表达HPV18E2蛋白的靶细胞,检验特异性CTL对靶细胞的杀伤效果,为进一步研制人乳头瘤病毒18型（HPV18）基因工程疫苗打下基础。方法以重组质粒（pBR322-HPV18）为模板,利用PCR方法扩增HPV18E2 DNA片段,将HPV18E2 DNA与加强绿色荧光质粒（pIRES2-EGFP）重组构建重组质粒（pIRES2-HPV18E2-EGFP）。用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性。重组质粒转染Hela细胞。51^Cr释放实验评估CTL杀伤能力。结果克隆重组质粒pIRES2-HPV18E2-EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变。转染并用G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达。三条候选多肽特异性杀伤能力分别为60.00%、71.29%和80.00%。结论三条备选肽段都具有明显的杀伤效应,均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位。     

修饰后中国山东地方株HPV16 E6E7基因的转化活性检测及免疫原性研究

目的 利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型（HPV16）E6E7基因，研制HPV16 DNA疫苗。方法 定点突变E6的终止密码，并保证E7读码框架不定；定点突变E7蛋白的Rb结合区中对其转化活性维持起关键作用的第24位氨基酸。突变修饰后的基因命名为fmE6E7。PCR扩增fmE6E7，重组人pLNCX载体，脂质体法转染3T3细胞，免疫荧光组织化学及Western blot检测转染细胞蛋白的表达。经软琼脂集落培养法和BALB／c裸鼠皮下接种法检测fmE6E7的转化活性。然后PCR扩增fmE6E7，构建pVR1012-fmE6E7真核表达质粒，于C57BL／6小鼠肌肉内直接进行裸DNA免疫，^51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性，间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。结果 测序证实获得了预期的突变结果。pLNCX-fmE6E7转染细胞体外软琼脂培养3周未见集落形成；裸鼠皮下接种2月后未见移植瘤形成（0／3）。免疫鼠获得了较好的E7特异性的抗体E和抗原特异性的CTL。结论 修饰后E6E7基因可融合表达，转化活性消除的同时还可诱发特异的细胞免疫和体液免疫，表明中国山东地方株的E6E7基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因。     

HPV16 L1/E6-E7基因嵌和DNA疫苗质粒构建及其在CHO细胞表达的初步研究

目的：构建HPV 16 L1－E6、HPV16 L1－E7预防、治疗性DNA疫苗质粒。方法：运用PCR大引物定点诱变法逐个突变E6、E7基因与转化作用有关的位点，PCR产物连接至pGEMT-Easy质粒，测序鉴定突变基因正确后，分别均与L1基因共同连接并至真核表达载体pVAX1，得到真核表达质粒1MpVAX1-L1E6,2MpVAX1-L1E6,1MpVAX1-L1E7,2MpVAX1-L1E7,3MpVAX1-L1E7。运用磷酸钙法将所获得的质粒转染CHO细胞，以HPV－16L1特异性单克隆抗体进行转染细胞中L1蛋白表达的ELISA和免疫组化的检测。结果：ELISA检测显示转染各种L1－E6、L1－E7融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P／N值均＞2．1；免疫组化检测在胞质胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积。结论：所构建的L1－E6、L1－E7融合蛋白表达质粒可在体外表达L1蛋白，为今后进行DNA疫苗动物实验和临床试验研究做好准备。     

11型HPV E7蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的构建人11型乳头瘤病毒(HPV 11)E7蛋白的原核表达载体,表达纯化后制备抗HPV11E7蛋白的多克隆抗体。方法构建pGEX-4T2-HPV11E7原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-HPV11E7,纯化获取11型HPVE7蛋白。将HPV11E7蛋白免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的多克隆抗体,用蛋白G琼脂糖纯化获得IgG型多克隆抗体。Western blot法及免疫荧光染色检测该抗体的效价及特异性。结果 SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导6 h后可表达出高水平可溶性GST-HPV11E7融合蛋白。纯化后免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的血清,纯化获得了IgG型多克隆抗体。Western blot及免疫荧光染色结果显示,兔抗HPV11E7 IgG具有效价高和特异性强的特点。结论成功表达了HPV11E7蛋白并制备了效价较高、特异性较好的IgG型兔抗HPV11E7蛋白多克隆抗体。     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达及初步鉴定

目的　构建登革 2型病毒E基因的真核表达载体 ,实现登革病毒E蛋白的真核表达。方法　采用逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)扩增登革 2型病毒 (NGC株 )包膜糖蛋白E基因全长片段 ,克隆入真核表达载体pcDNA3的Pcmv启动子下游 ,构建重组真核表达质粒pcDNA3 E ,用脂质体转染法转染NIH3T3细胞 ,表达产物以免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹进行分析检测。结果　成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3 E ,通过脂质体转染法导入NIH3T3细胞 ,免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹分析检测表明 ,E基因在NIH3T3细胞实现了真核表达 ,产物相对分子质量 (Mr)为 6 0× 10 3。结论登革病毒E基因真核表达载体的构建及E基因的真核表达为研究登革病毒E蛋白的结构与功能、研制登革病毒诊断试剂及核酸疫苗奠定了基础     

HPV16E7E6抗原表位嵌合体DNA抗肿瘤疫苗的研究

目的:探讨HPV16 E7、E6抗原表位与HSP70 N端重组DNA疫苗抗肿瘤活性.方法:以重叠PCR将HPV16 E7基因N端60个氨基酸的编码序列与E6基因的10个(48～57)氨基酸的编码序列及HSP70 N端序列进行融合.以pcDNA3.0为载体,构建真核表达载体pcD-E76HSP.重组质粒免疫C57BL/6小鼠后,通过淋巴细胞增殖实验和细胞毒性杀伤实验研究该疫苗激发的细胞免疫反应及反应强度;观察该疫苗对C57BL/6小鼠TC-1肿瘤细胞移植瘤的治疗效果.结果:重组DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠后,小鼠脾淋巴细胞体外增殖明显,并可诱导产生针对TC-1肿瘤细胞的特异性CTL反应;体内抑瘤试验显示该疫苗对HPV16病毒转化的TC-1细胞小鼠移植瘤的生长有抑制作用.结论:该疫苗能激发特异性细胞免疫反应,显著抑制HPV16转化的TC-1肿瘤细胞生长.     

优化密码促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应

目的：探讨优化密码对人乳头瘤病毒6b型（HPV 6b）基因表达及免疫原性的影响，为治疗性DNA疫苗的研究奠定基础。方法：设计合成含优化密码及pRB结合位点突变的HPV 6bE7(humE7）全长基因。测序验证无误后，定向克隆于pcDNA3的Kpn I和EcoR I位点，成功构建真核表达质粒pcDNA3-hu-mE7。体外转染COS－1细胞，免疫荧光检测其E7蛋白表达。C57BL／6小鼠胫前肌内接种裸DNA，观察其诱导的细胞免疫反应。结果：pcDNA3-hu-mE7在COS－1细胞获得明显表达，表达产物主要位于细胞核中。DNA免疫结果显示，与含有野生型E7基因的表达质粒pcDNA3-wtE7比较，pcDNA3-hu-mE7免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ产生明显升高，CD8^ 和CD4^ 淋巴细胞活性增强。结论：优化密码能促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应。     

CD80作为分子佐剂增强HPV11 E7免疫效果的观察

构建的人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）11型E7基因DNA真核表达质粒，在真核细胞获得有效表达。为增强其作为尖锐湿疣治疗性疫苗的免疫效果，现将E7基因与协同刺激分子CDS0（B7-1）进行连接重组，构建HPV11E7-CD80嵌合DNA真核表达质粒，并将其免疫小鼠，研究其诱导的免疫效应。