偏硅酸钠对ECV-304细胞株与单个核细胞黏附的影响

目的 观察偏硅酸钠(Na2SiO3)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的ECV-304细胞与人外周血单个核细胞黏附的影响,探讨其抗动脉粥样硬化(AS)作用的机制.方法 ECV-304细胞分为5组:对照组、ox-LDL组、Na2SiO3高剂量组(硅68.5 mg/L)、中剂量组(硅34.2 mg/L)、低剂量组(硅17.1 mg/L).分离正常健康人外周血单个核细胞,计数与各组ECV-304细胞黏附数,检测细胞培养液中IL-8水平;采用流式细胞术测VCAM-1的蛋白表达量;半定量RT-PCR检测VCAM-1、IL-8mRNA的表达.结果 Na2SiO3减少ECV-304单个核细胞黏附数(P＜0.01),降低IL-8浓度(P＜0.01),降低VCAM-1的蛋白表达量(P＜0.05),下调VCAM-1、IL-8 mRNA的表达(P＜0.01).结论 Na2SiO3能够下调ox-LDL诱导的ECV-304 IL-8和VCAM-1的表达.     

木贼有效部位抑制氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡及LOX-1、NOX4mRNA的表达

目的探讨木贼有效部位对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC-ECV304)凋亡抑制作用的可能机制。方法体外ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤,用木贼有效部位进行干预。采用流式细胞术检测细胞凋亡率;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮细胞血凝素样ox-LDL受体1(LOX-1)m RNA、NADPH氧化酶4(NOX4)m RNA及Caspase-3 m RNA表达。结果与模型组比较木贼有效部位干预后细胞凋亡率明显下降(P0.05),LOX-1 m RNA、NOX4m RNA及Caspase-3 m RNA表达明显下调(P0.01)。结论木贼有效部位可能通过抑制LOX-1m RNA及NOX4 m RNA的表达,实现对凋亡相关基因的调控来减少内皮细胞的凋亡。     

吡格列酮对人脐静脉内皮细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1表达的影响

目的探讨氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)作用下,吡格列酮对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)表达的影响。方法将培养的第4代HUVECs分5组:空白组(无干预);ox-LDL组(80 mg/L ox-LDL);低浓度组(1μmol/L吡格列酮+80 mg/L ox-LDL);高浓度组(10μmol/L吡格列酮+80 mg/Lox-LDL);对照组(10μmol/L吡格列酮),各组培养24 h后,采用流式细胞仪检测LOX-1的表达,采用RT-PCR检测LOX-1 mRNA的表达。结果与空白组比较,对照组LOX-1及LOX-1 mRNA表达均无明显改变(P0.05),ox-LDL组、低浓度组和高浓度组LOX-1及LOX-1 mRNA表达明显增多(P0.01);与ox-LDL组比较,低浓度组和高浓度组LOX-1及LOX-1 mRNA表达明显降低(P0.01);高浓度组较低浓度组降低更明显(P0.05)。结论吡格列酮能降低ox-LDL刺激下的HUVECs LOX-1及LOX-1 mRNA的表达,提示吡格列酮可能通过干预ox-LDL的病理生理过程起到抗动脉硬化的作用。     

非对称性二甲基精氨酸促进大鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶表达

目的观察非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)对培养的大鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响,探讨其在脂质沉积中的作用及机制。方法分组①正常对照组以PBS缓冲液与巨噬细胞共孵育,②氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)组在巨噬细胞培养液中加oxLDL(50mg/L),③O A组在巨噬细胞培养液中加oxLDL(50mg/L)和ADMA(20μmol/L),④O A L组在培养液中加ox-LDL(50mg/L)、ADMA(20μmol/L)、L-Arg(1.2mmol/L)。以硝酸还原酶法和化学比色法分别测定培养液中一氧化氮(NO)含量与iNOS活力,以RT-PCR和Western Blotting分别检测iNOSmRNA和蛋白表达。结果①OxLDL组与O A组NO含量降低,iNOS活力升高,且以O A组明显,与正常对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05);NO与iNOS呈负相关(r=-0.697,P<0.05)。②O A组iNOS mRNA和蛋白表达增强,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论ADMA抑制大鼠腹腔巨噬细胞合成NO,增强iNOS基因与蛋白表达,可能是ADMA促使巨噬细胞转变为泡沫细胞、促进动脉粥样硬化发生发展的机制之一。     

氧糖剥夺条件下脑血管内皮细胞对氧化型低密度脂蛋白损伤的易感性及机制研究

目的:观察缺氧缺糖性损伤条件下,血管内皮细胞对氧化型低密度脂蛋白刺激易感性的考察,以及下游氧化应激信号通路的调控机制。方法:将细胞分为正常对照组、氧糖剥夺(OGD)组6h、100μg/ml氧化型低密度脂蛋白ox-LDL处理24h组(ox-LDL组)、OGD 6h+100μg/ml ox-LDL刺激24h组(OGD+ox-LDL组),分别处理分离的大鼠脑血管内皮细胞(RBECs)。Western blot检测脑血管内皮细胞小凹蛋白1(Cav-1)、凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体(LOX-1)变化,及考察下游氧化应激MAPK信号通路和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)。免疫荧光检测RBECs中Dil细胞膜荧光标记的ox-LDL(Dil-ox-LDL)荧光强度的变化。比色法和ELISA法检测炎症因子即一氧化氮(NO)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。结果 :oxLDL刺激可对增加LOX-1表达和RBECs的Dil-ox-LDL荧光强度,并同时降低Cav-1表达。OGD组LOX-1表达和Dil-ox-LDL荧光强度相较于正常对照组无明显增加,然而Cav-1表达有所降低,然而在OGD+ox-LDL组LOX-1表达和Dil-ox-LDL荧光强度增加,且相较于ox-LDL组,有显著性差异。另外,除正常对照组外,各组RBECs均观察到MAPK信号通路中p38、ERK1/2、JNK氧化应激通路激活和NO、IL-1β、TNF-α炎症因子释放增加,并且OGD+ox-LDL组相较于OGD组、ox-LDL组均有显著性差异。结论:RBECs在OGD和ox-LDL共同刺激条件下,对ox-LDL的刺激具有易感性,可在增加细胞内Dil-ox-LDL荧光强度,并且诱导下游氧化应激反应,机制可能与Cav-1调控氧化应激反应相关,本研究可为以OGD细胞模型为代表的缺血性脑卒中等疾病相关脂质代谢研究提供科学根据。     

ox-LDL对血管平滑肌细胞AT1受体表达的影响及LOX-1对其介导作用的观察

目的:观察氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对血管平滑肌细胞(VSMC)血管紧张素Ⅱ受体-1(AT1R)表达的影响及凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)在其中的介导作用.方法:人脐带动脉平滑肌细胞体外原代培养.ox-LDL干预,RT-PCR测定VSMC AT1R mRNA和LOX-1 mRNA表达.并观察在LOX-1的抑制剂多聚肌苷酸作用后,VSMC AT1R mRNA表达的变化.结果:①20 mg/L ox-LDL作用6 h、12 h及24 h后,VSMC AT1R mRNA表达升高,与空白对照组比较,均P<0.01,作用6 h出现峰值.②1、10、100 mg/L浓度ox-LDL作用后,VSMC LOX-1 mRNA表达均升高,与空白对照组比较,P<0.05～P<0.01;且随着ox-LDL浓度的升高有升高趋势,各浓度之间比较,P<0.01.③多聚肌苷酸抑制LOX-1后,AT1R m-RNA表达明显下降,与空白对照组、ox-LDL单独作用组比较,均P<0.01.结论:ox-LDL可持续性促进VSMC AT1R表达,LOX-1在此过程中起重要介导作用.     

诱导型一氧化氮合酶参与白细胞介素-1β对人心脏成纤维细胞基质金属蛋白酶-2作用的实验研究

目的 观察白细胞介素-1β(IL-1β)对人心脏成纤维细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的作用及相关机制.方法 将3～6代人心脏成纤维细胞接种于6孔培养板内接受各种干预措施.待实验细胞接受刺激12 h后,用RT-PCR法观察MMP-2的mRNA表达量.细胞接受各种刺激24 h后,收集细胞总蛋白和培养上清,通过凝胶酶谱法进行上清MMP-2的活性检测,采用Western blot法测定细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白的表达,采用Griess法衡量细胞上清中一氧化氮(NO)水平.结果 IL-1B作用人心脏成纤维细胞24 h后,促进了细胞MMP-2的活性增加,其中4 ng/ml的IL-1β刺激作用达到高峰,与对照组相比活性增加了(170.24±13.12)%(P＜0.01),并且该浓度IL-1β能时间依赖性地促进心脏成纤维细胞MMP-2的活性增加.IL-1β作用心脏成纤维细胞12 h后,与正常对照组相比4 ng/ml和10 ng/ml IL-β组MMP-2 mRNA表达明显增加(P＜0.01).IL-1β(4 ng/ml)可以明显促进细胞NO水平升高(P＜0.01),而NOS抑制剂NG-甲基-L-精氨酸(10-3 mol/L)显著抑制了IL-1β诱导的MMP-2 mRNA表达(P＜0.01)、MMP-2活性(P＜0.01)以及NO水平的升高(P＜0.01).通过Western blot发现在生理水平的心脏成纤维细胞上未能检测到iNOS蛋白的表达,而不同浓度的IL-1β明显促进了细胞iNOS的蛋白水平的升高.结论 IL-1β能促进人心脏成纤维细胞MMP-2的mRNA表达和活性,并提示其作用与细胞iNOS-NO水平有关.     

氧化型低密度脂蛋白诱导肝窦内皮细胞植物血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1的表达

目的：探讨植物血凝素样氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）受体1（LOX-1）在肝窦内皮细胞（HSECs）中的表达和ox-LDL对其表达的调控作用。方法使用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting法从基因和蛋白水平检测未经处理HSECs 中LOX-1的表达。应用不同浓度ox-LDL（0、20、40、60、80和100 mg/L）对HSECs作用24 h并应用80 mg/L ox-LDL对HSECs作用不同时间（0、12、24和48 h）,作用后实时定量PCR检测HSECs内LOX-1 mRNA的表达水平,Western blotting法检测细胞内LOX-1蛋白表达。给予80 mg/L ox-LDL干预组多聚肌苷酸250 mg/L作用24 h后,测定LOX-1 mRNA和蛋白的表达。采用单因素方差分析及t检验进行数据分析。结果 LOX-1 mRNA和蛋白在HSECs中均有表达。20～80 mg/L ox-LDL组HSECs中LOX-1 mRNA、蛋白表达水平随ox-LDL剂量增加而升高,与剂量有明显相关性（F＝38.7、3.43,均P＜0.05）。与80 mg/L ox-LDL组相比,100 mg/L ox-LDL 组 LOX-1 mRNA、蛋白表达下降,差异有统计学意义（ t ＝23.75、18.26, P ＜0.05）。80 mg/L ox-LDL对HSECs作用时间在0～24 h时,随着时间延长,LOX-1 mRNA、蛋白表达递增,与ox-LDL作用时间有明显相关性（F＝2.36、0.33,均P＜0.05）。与作用24 h相比,作用48 h组HSECs中LOX-1 mRNA、蛋白表达下降（t＝69.21、36.27,均P＜0.05）。与80 mg/L ox-LDL组相比,多聚肌苷酸组中LOX-1 mRNA和蛋白表达降低,两组差异均有统计学意义（ t＝54.93、28.19,均P＜0.05）。结论LOX-1存在于HSECs。在一定浓度和时间范围内,ox-LDL对HSECs LOX-1的调控作用具有时间和浓度依赖性,而多聚肌苷酸可部分抑制这种效应。     

miR-146a调控人脐静脉内皮细胞的衰老及机制

目的探究miR-146a在人脐静脉内皮细胞衰老中的调节作用,并初步探究其机制。方法以人脐静脉内皮ECV-304细胞为研究对象,连续传代建立ECV-304细胞复制性衰老模型,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)法检测不同代次(P2、P6、P9、P12、P15代)细胞中衰老细胞比例,实时定量PCR法检测不同代次(P2、P6、P9、P12、P15代)细胞中miR-146a表达。靶基因预测软件预测miR-146a靶基因。细胞转染建立miR-146a表达上调的P12代细胞(Pre-miR146a组)和miR-146a表达下调的P12代细胞(Anti-miR146a组),并建立相应对照组,SA-β-gal法检测衰老细胞比例,Western blot检测NADPH氧化酶4(NOX4)蛋白表达。结果 P6、P9、P12和P15代细胞的衰老细胞比例明显高于P2代细胞(P0.05),miR-146a表达则明显低于P2代细胞(P0.05)。靶基因预测miR-146a的靶基因为NOX4;转染后,Pre-miR146a组衰老细胞比例明显低于对照组(P0.05),Anti-miR146a组衰老细胞比例明显高于对照组(P0.05); Pre-miR146a组NOX4蛋白表达明显低于对照组(P0.05),Anti-miR146a组NOX4蛋白表达明显高于对照组(P0.05)。结论 miR-146a在衰老的人脐静脉内皮细胞ECV-304中表达下降,上调miR-146a表达能够抑制ECV-304衰老,其机制与调节NOX表达有关。     

ox-LDL促进树突状细胞LOX-1表达及炎症因子分泌

目的应用小鼠高脂模型及树突状细胞株研究血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)高表达树突状细胞(DC)在动脉粥样硬化中的作用。方法氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导原代培养的C57小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC),采用Western blot检测BMDC LOX-1蛋白水平;采用流式细胞术检测高表达LOX-1和低表达LOX-1细胞亚群的比例;MACS磁珠分选LOX-1表达水平不同的两种细胞亚群,观察ox-LDL对两种细胞亚群的影响及释放炎症因子的影响;采用C57小鼠高脂模型,在高脂喂养的不同时间(4周、6周、8周)检测小鼠总胆固醇水平和主动脉中DC数量;用不同浓度的Dil标记的ox-LDL(Dil-ox-LDL)刺激DC2.4细胞,荧光显微镜观察各组细胞吞噬作用的差异,Western blot检测LOX-1的表达。结果 DC可分为高表达和低表达LOX-1两种细胞亚群,且ox-LDL能增加LOX-1~(high)DC的比例;分选后的阳性细胞被ox-LDL刺激后,TNF-α和IL-1βmRNA的表达明显上调(P0.01),且阳性细胞的上升比例高于阴性细胞。在C57小鼠高脂模型中,高脂喂养组总胆固醇水平明显升高,且随着总胆固醇水平的升高,小鼠主动脉中DC增多,且LOX-1~(high)DC比例明显增加。用不同浓度的Dil-ox-LDL刺激DC2.4细胞,随着Dil-ox-LDL浓度的升高,DC2.4细胞对ox-LDL的吞噬也增加,并且ox-LDL可以诱导DC2.4细胞表面LOX-1表达,20 mg/L和40 mg/L的ox-LDL对LOX-1表达的诱导作用明显。结论 ox-LDL能够上调DC表面受体LOX-1,增加LOX-1~(high)DC比例,促进炎症因子表达。