聚合酶链反应检测霍乱弧菌

为快速，准确地检测霍乱弧菌，控制霍乱流行，研究建立了一种聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测方法，根据霍乱弧菌肠毒素ＣＴ基因序列，自行设计一对特异引物，扩增片断为２９６ｂｐ，同时采用一种高效率，快速，简便的方法提取并纯化ＤＮＡ，该法能成功地检测各种样品中的产ＣＴ肠毒素Ｏ１群霍乱弧菌，应用ＰＣＲ技术和常规分离培养方法对９０９份腹泻患者粪例标本和１８份环境水样标本进行平行检测。结果表明，两种方法的检测结果一致。     

聚合酶链反应同时检测五种腹泻致病菌的初步研究

目的探索一种快速、经济、敏感的诊断方法，对常见的腹泻致病菌进行基因检测研究。方法建立一种快速标本处理和多重聚合酶链反应（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ）诊断方法，在一次ＰＣＲ反应中同时扩增５种菌的致病基因：志贺菌及侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒（ｉａｌ）基因、副溶血性弧菌的热稳定直接溶血素（ｔｄｈ）基因、Ｏ１群霍乱弧菌的霍乱毒素Ａ亚单位（ｃｔｘＡ）基因和产不耐热肠毒素大肠埃希菌的不耐热肠毒素Ｂ亚单位（ＬＴ－Ｂ）基因。扩增产物经电泳，出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的条带即判断为该标本阳性。结果对一组常规培养生化鉴定法诊断为霍乱的２６份腹泻患者标本检测后，ＰＣＲ法有２４份检测到ｃｔｘＡ基因，ＰＣＲ阴性的２份为非Ｏ１群；另一组５６份粪标本分别检测到了ｉａｌ、ｔｄｈ、ＬＴ－Ｂ基因，ＰＣＲ法较培养法阳性率高。结论该方法具有简便、快速、特异、经济和不需培养等特点，适于临床应用。     

聚合酶链反应同时检测五种腹泻致病菌的初步研究

探索一种快速，经济，敏感的诊断方法，对常见的腹泻致病菌进行基因检测研究。建立一种快速标本处理和多重聚合酶链反应诊断方法，在一次ＰＣＲ反应中同时扩增５种菌的致病基因：同菌及侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒基因，副溶血性弧菌的热稳定直接溶血素基因，Ｏ１群霍乱弧菌的霍乱毒素Ａ亚单位基因和产不耐热肠毒素大肠埃希菌的不耐热肠毒素Ｂ亚单位基因。     

胶乳凝集试验检测O1群霍乱弧菌

为建立一种快速，简便的Ｏ１群霍乱弧菌检测方法，用抗Ｏ１群霍乱弧菌多价单克隆抗体敏胶乳，建立起胶乳凝集试验（ＬＡＴ），检测粪便标本６ｈ培养３物中的霍乱弧菌，ＬＡＴ的检测的敏感性为５×１０＾５ＣＦＵ／ｍｌ，检测过程小于５ｍｉｎ，在９２例临床标本中，４４例培养阳性者ＬＡＴ法均阳性，４８例培养阴性者中，有１例假阳性，但用镜检法厅筛除。     

O139霍乱弧菌生物学特性及药物敏感性分析

为了有效，准确地检测霍乱弧菌，在某地水样泻患者的粪便中分离４株Ｏ１３９霍乱弧菌，经对分离株的生物学特性，血清学及药物敏感性进行研究，并与Ｏ１群霍乱弧菌进行比较。结果表明，Ｏ１３９霍乱弧菌具有Ｏ１群同样的生化特性，但不与Ｏ１群霍乱弧菌抗血清凝集，仅与Ｏ１３９霍乱弧菌抗血清在玻片上呈强凝集，试管凝集滴度为１：６４０～１：２５６０，所有菌株都使鸡红细胞凝集，对羊红细胞溶血的作用可变，所有菌株对霍乱Ｏ１群     

套式聚合酶链反应单管法检测单纯疱疹病毒

应用聚合酶链反应方法，套式ＰＣＲ双管法及套式ＰＣＲ单法分别检测１３０份散发性脑炎患者脑脊液中单纯疱疹病毒的ＤＮＡ，阳性率依次为１８．５％（２４／１３０）、２９．２％（３８／１３０）、２９．２％（３８／１３０）；６０份非中枢神经系统感当者ＣＳＦ标本的检测阳性率分别为０、３．３％（２／６０）、０。结果显示：套式ＰＣＲ虽然提高了检测的敏感性，但假阳性也大大增加。改良的套式ＰＣＲ单管法则大大减少了污染机会     

聚合酶链反应检测伤寒沙门菌

用ＰＣＲ技术通过两对引物扩增伤寒沙门菌鞭毛抗原基因ＶＩ区一段特异性ＤＮＡ片段，并用非伤寒沙门菌作对照，结果仅伤寒沙门菌为阳性。实验表明，经二次扩增，当反应体系中达１０１１／ｍｌ个伤寒沙门菌时，即可检出。检查伤寒患者血液标本７份，粪便标本６份，ＰＣＲ阳性分别为６份和５份，而血培养阳性仅为３份和４份，肥达反应均为阴性的发热患者血液标本１２份，健康成人粪便标本６０份，ＰＣＲ均为阴性。     

肠道门诊中病原性弧菌的鉴定及药物敏感试验

病原性弧菌引起腹泻的临床报道日渐增多。我们对本院肠道门诊６００例急性腹泻患者的粪便标本进行了弧菌的分离、鉴定及药物敏感试验，报道如下。１　材料与方法１１　标本来源　本院肠道门诊１９９８年５～１０月份急性腹泻粪便标本６００份。１２　培养基　碱性蛋白胨水、庆大霉素琼脂等均自制，ＭＨ琼脂购于浙江省军区后勤部卫生防疫检验所。培养基中均含１ｇ／ｄｌＮａＣｌ。１３　诊断血清　霍乱弧菌Ｏ１群多价血清、两种单价血清及Ｏ１３９型血清，购自卫生部兰州生物制品研究所。１４　药敏纸片　阿米卡星等１６种药敏纸片，…     

非O1群霍乱弧菌感染腹泻的分布及耐药性分析

为了解本地区非Ｏ１群Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ（霍乱弧菌）感染腹泻的流行状况，对我院肠道门诊腹泻病患者的粪便标本，进行了连续两年致病性弧菌的监测，并对非Ｏ１群霍乱弧菌感染的流行病学因素，进行了综合分析，结果报告如下。１材料和方法１．１标本来源１９９８年至１９９９年急性腹泻病患者的粪便标本３１６５份；患者全部为１４岁以上的成年人，年龄从１４岁至８９岁；男性患者１６８５例，女性患者 １４８０例。１．２培养基增菌及分离培养基购自北京市东城区卫生防疫站，ＭＨ琼脂购自生物梅里埃公司。新鲜脱纤维羊血和兔血本实验室…     

PCR检测沙眼衣原体在女性阴道炎诊治中的意义

１资料与方法１．１临床资料７８名女性阴道炎患者均为我院门诊就诊人，年龄１８～４６岁。１．２检测方法取患者的阴道分泌物为检测标本，用ＰＣＲ方法检测标本中的沙眼衣原体。ＰＣＲ试剂盒由上海中亚生物公司提供。ＰＣＲ扩增仪采用美国产升温式“百乐”牌基因扩增仪。...     

山西省从粪便中分离到产霍乱毒素的拟态弧菌

目的从山西省霍乱样粪便中分离到拟态弧菌,并检测其是否携带霍乱毒素基因。方法采集患者粪便、患者家用自来水、金鱼和鱼缸水标本,按照WS289-2008和《霍乱防治手册》(第5版)方法 ,对标本进行增菌和选择性培养基的分离培养,疑似菌落以霍乱弧菌血清凝集试验检测,并用API20E系统鉴定菌种。同时,疑似菌落用PCR检测O1、O139群特异性和是否携带霍乱毒素基因。结果粪便标本经增菌后接种选择性培养基,在庆大琼脂和碱性琼脂上均有霍乱弧菌疑似菌落,但在TCBS琼脂上为绿色、透明、中等大小、光滑、湿润的菌落;血平板上可见灰白色、湿润菌落,有透明溶血环;染色镜检湿片暗视野下未见流星状运动细菌。氧化酶和粘丝实验阳性,霍乱弧菌O1、O139群血清凝集试验阴性。菌株经API20E鉴定为拟态弧菌(93.5%可能性)。环境标本中未分离和检测到拟态弧菌。PCR检测该拟态弧菌中携带霍乱毒素基因,而O1、O139群特异性为阴性。结论从急性霍乱样腹泻粪便中分离到1株拟态弧菌,对于临床类似霍乱样症状的病例标本,当病原的霍乱弧菌血清凝集为阴性时,应进一步做霍乱毒素的检测。     

2004-2013年北京市外环境及食品中霍乱弧菌监测结果分析

目的 了解北京市外环境及食品中霍乱弧菌污染状况,为人间霍乱疫情防控提供科学依据。方法 2004-2013年,每月均在全市的16个区(县)采集地表水、游泳池水、养殖池水、水产品、熟食、其他等6类样品,分别进行霍乱弧菌培养,对培养结果应用描述流行病学的方法进行分析。结果 2004-2013年养殖池水和其他类别样品的霍乱阳性率最高,分别为1.16%(44/3808)和1.48%(61/4135);游泳池水中未检出霍乱弧菌;外环境疫情在北京市集中在城近郊区,呈环形分布;牛蛙和甲鱼检测阳性率较高,霍乱毒素(cholera toxin, CT)阳性疫情较少,占检测总起数的9.09%(5/55),且均为水产品涂抹疫情。2007年以来,霍乱外环境疫情较少,O139群霍乱弧菌污染呈下降趋势,O1群稻叶型则有所增多。结论 北京市霍乱弧菌污染较轻,且检出菌株也以CT阴性菌株为主,对人体威胁较小。     

Analysis of virulent and avirulent strains of Vibrio cholerae by the nest polymerase chain reaction

The detection of cholera enterotoxin in environmental objects and isolation of patients are considered to be the most reliable indices of that the cholera agent is present. Described in the case study is a method of nested polymerase chain reaction (PCR) based on amplifying the ctxA gene fragment coding subunit A of enterotoxin. A possibility was shown to use the above method to confirm the virulence of strains Vibrio cholerae isolated from different sources. The method was tested with 18 virulent and avirulent strains V. cholerae as well as (for the sake of verifying the analysis specificity) with DNAs of other human-pathogenic microorganisms and with the human genome DNA. The results showed a high efficiency of nested PCR in detecting the pathogenicity of cholera-agent strains.     

血清凝集、基因测序联合检测群霍乱弧菌的应用

目的 避免霍乱弧菌检测假阳性,提高检测正确率。方法 随机选取2013年1～7月,全国各省市CDC送往中国CDC霍乱初筛阳性菌株14株; 用LB营养琼脂培养12 h,挑取单菌落进行霍乱弧菌血清凝集,同时水煮模板法提取菌株的DNA。针对弧菌属16SrDNA序列设计引物,进行弧菌16SrDNA PCR检测,电泳观察16SrDNA产物,将16SrDNA阳性产物送测序公司测序,测序结果在NCBI网站上进行Blast比对,分析比较血清凝集和Blast比对结果。结果 共选取14株菌进行实验,血清凝集阳性12株,2株未凝。经弧菌16SrDNA扩增,电泳观察14株菌均扩增出相应的片段,说明所选菌株均为弧菌属。将14株菌的16SrDNA阳性产物测序,并将测序结果进行Blast比对:2株血清未凝集菌均是哈维氏弧菌; 12株血清凝集阳性的菌中,1株是需钠弧菌,其余11株是霍乱弧菌。结论 血清凝集和基因测序联合检测群霍乱弧菌,可避免霍乱弧菌检测假阳性,提高检测正确率。     

霍乱弧菌CT毒素环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

目的将一种新颖的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应用于霍乱弧菌毒素基因ctxA的快速检测。方法针对霍乱弧菌毒素基因ctxA设计6条特异性引物(两条内引物、两条外引物和两条环引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。结果最佳反应时间为60 min,反应温度为65℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅含毒素基因ctxA的霍乱弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为68 fg和42 cfu/ml。对模拟样品进行直接检测,检测限为72 cfu/g。结论该方法检测霍乱弧菌毒素基因ctxA特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1 h即可完成,适合基层检验部门使用。     

浙江省非O1、非O139群霍乱弧菌快速检测与毒力基因研究

目的 建立一种快速检测非O1、非O139群霍乱弧菌方法,并对浙江省部分地区海水产品中非O1、非O139 群霍乱弧菌及其携带毒力基因开展快速检测.方法 采用三糖斜面、氧化酶实验、粘丝实验、无盐胨水等简单生化进行初筛,对全部结果阳性的菌株用聚合酶链反应(PCR)方法检测霍乱弧菌外膜蛋白OmpW以及毒力基因ctxA、hl...     

2株与霍乱弧菌O139诊断血清发生凝集的麦氏弧菌鉴定

目的对2株疑似O139群霍乱弧菌进一步鉴定,以排除或确诊霍乱。方法以试管凝集和交叉吸收实验复核玻片凝集结果,用生化实验和BIOFOSUN 微生物鉴定系统进行生化鉴定,PCR技术检测O139霍乱弧菌特异性脂多糖基因（LPS）。结果玻片凝集阳性,试管凝集1株菌可达原诊断血清效价的1/4,1株菌达1/2,交叉吸收后均证实为非特异性凝集;未检出LPS基因;系统生化鉴定判定为麦氏弧菌。结论2株菌不是O139霍乱弧菌,而是麦氏弧菌。     

2006年湖南省霍乱监测结果分析

目的 监测人群中霍乱病例和被霍乱弧菌污染的水体及食物,以便尽早采取预防控制措施,防止疫情扩散.方法 全省范围开展腹泻患者及外环境、食品监测,选择重点地区开展甲鱼霍乱弧菌污染状况专项监测.结果 2006年湖南省共登记腹泻患者111 526例,检测霍乱弧菌89 661例,检测率为80.39%,检出阳性4例,均为0139群霍乱弧菌感染;检测环境和食品样44 533份,其中水体35 113份,全部为阴性,水产品5377份,阳性16份,阳性率为0.30%,阳性标本为甲鱼和牛蛙,其他食品4043份,均为阴性;甲鱼专项监测2323份,检出阳性33份,阳性率为1.42%;霍乱毒素基因检测34株菌,20株为产毒株,占58.80%;药敏试验28株菌,均对诺氟沙星、环丙沙星、丁胺卡那霉素100%敏感,对强力霉素、复方新诺明的敏感率为92.86%.结论 甲鱼、牛蛙等水产品是湖南省发生霍乱的主要因素,应加强水产品的监测和卫生管理.     

2015－2017年北京市顺义区食源性疾病监测腹泻病例霍乱弧菌感染及病原学特征分析

目的研究食源性疾病监测腹泻患者霍乱弧菌感染特点及病原学特征，为科学防控和临床治疗提供依据。方法从2015－2017年北京市顺义区腹泻监测病例的粪便标本中分离培养霍乱弧菌，针对分离菌株进行毒力基因聚合酶链式反应（PCR）检测、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）图谱分析以及抗生素敏感性分析。结果2015－2017年，共收集1 105例腹泻患者，霍乱弧菌的检出率为0.54%（6/1 105），霍乱毒素基因ctxAB均为阴性，血清学分型为非O1/O139型，其中5株霍乱弧菌携带Ⅲ型分泌系统毒力基因。 菌株PFGE聚类分析结果和MALDI-TOF MS图谱聚类结果具有较好的一致性。结论霍乱弧菌流行强度不高，但其感染和病原学监测工作应在食源性疾病监测体系中得到重视。