ShRNA-AKT2对人脑胶质瘤U87细胞株增殖及凋亡的影响

目的研究通过慢病毒载体靶向抑制丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因表达对胶质瘤细胞株U87增殖、凋亡的影响。方法利用慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)干扰载体感染U87细胞株,逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白印迹技术(Western blot)分别检测转染后细胞株AKT2 mRNA和蛋白表达水平变化,四唑盐(MTT)法检测细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞周期改变。结果转染AKT2-shRNA可有效降低U87细胞株内的AKT2表达。干扰组细胞从第3 d开始增殖明显降低(P0.05);AKT2-shRNA干扰组细胞的凋亡率为11.80%±1.83%,明显高于阴性对照组的2.01%±0.20%和未转染组的2.13%±0.32%(P0.05);AKT2-shRNA干扰组细胞周期S期细胞百分比显著低于对照组,而G0/G1期细胞比分比显著高于对照组(P0.05)。结论 AKT2-shRNA可抑制胶质瘤细胞株的增殖,并导致肿瘤细胞凋亡增加。     

TIMP-2对人脑胶质瘤U87体外侵袭力的抑制作用

目的 探讨TIMP-2对人脑胶质瘤细胞体外侵袭力的抑制作用。方法 用携带TIMP-2基因的重组腺病毒载体AdTIMP-2，体外转染人胶质瘤细胞系U87，用Western blotting检测目的蛋白的表达。通过Boyden小室法检测U87转染前后细胞体外侵袭力的变化，同时采用胶原酶谱法分析MMP-2、MMP-9活性改变。结果 D转染AdTIMP-2病毒后的U87细胞目的蛋白表达上调，转染后U87细胞的MMP-2、MMP-9明显下降，同时体外侵袭力受到明显抑制。结论 重组腺病毒载体介导的TIMP-2基因治疗，是一种有效的抗胶质瘤方法。     

WISP-2siRNA对人脑胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响

目的 探讨siRNA沉默WISP-2基因表达对人脑胶质瘤细胞U251增殖、凋亡的影响.方法 脂质体介导siRNA转染人脑胶质瘤细胞U251后,检测U251细胞的增殖、凋亡的变化,并用Western blot法检测WISP-2、Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果 WISP-2 siRNA能有效抑制U251细胞株的生长,诱导凋亡,siRNA干扰组WISP-2蛋白表达水平为(18.67±1.40)％,明显低于空白对照组(70.18±1.82)％和阴性对照组(69.41±1.77)％,且差异有统计学意义(P＜0.01);siRNA干扰组Bcl-2、Bax蛋白表达水平为(29.67±1.47)％、(31.62±1.32)％,明显低于空白对照组和阴性对照组,且差异有统计学意义(P＜0.01).结论 WISP-2 siRNA抑制WISP-2 mRNA和蛋白表达后,能有效抑制胶质瘤细胞的增殖,增加U251细胞凋亡,可能通过下调Bcl-2/Bax蛋白表达的比值来诱导细胞凋亡.     

下调RNF138基因对胶质瘤细胞株U251增殖、凋亡及细胞周期影响的研究

目的探讨RNA干扰下调胶质瘤细胞株高表达基因RNF138对胶质瘤细胞株U251体外增殖、凋亡以及细胞周期的影响。方法构建下调RNF138基因的siRNA,通过慢病毒转染导入胶质瘤细胞株U251,设立阴性干扰对照组及空白对照组,荧光显微镜观察转染效率;实时荧光定量PCR检测敲减效率;运用Cellomics仪器连续检测U251体外增殖情况;流式细胞仪检测U251凋亡及细胞周期变化情况。结果慢病毒载体高效、稳定转染U251细胞,靶向RNF138的siRNA有效抑制RNF138基因表达,使RNF138mRNA表达减少60%,U251体外增殖明显减缓,凋亡明显增加,细胞阻滞在G2/M期。结论 RNA干扰抑制RNF138基因表达可以明显抑制胶质瘤细胞株U251体外增殖,促进其凋亡,影响细胞周期,阻滞细胞分裂。     

shRNA靶向干扰Notch2对人脑胶质瘤细胞株U251的影响

目的 研究Notch2信号对人脑胶质瘤细胞株U251的增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法 应用脂质体将pGFP-V-RS Notch2 shRNA干扰质粒导入胶质瘤细胞株U251后,应用MTT法检测细胞增殖变化、流式细胞仪检测转染效率、细胞凋亡和细胞周期的改变、RT-PCR和Westen blot检测Notch2基因的抑制效果和干扰后细胞周期、凋亡相关蛋白的表达改变.结果 pGFP-V-RS Notch2 shRNA干扰质粒转染效率为86.68%±2.54%,转染后在mRNA水平和蛋白水平均发生Notch2的表达抑制,与无关序列组和未转染组相比干扰组细胞自第5天开始增殖明显减慢(P<0.05),干扰组G0/G1 期细胞百分数(68.2 %±1.29%)显著高于无关序列组和未转染组(35.8 %±2.37% 和47.7%±1.03%, P<0.01),而干扰组G2/S期细胞(20.4%±1.56%)显著低于无关序列组和未转染组(49.1%±3.65% 和35.4%±2.42%, P<0.05),干扰组凋亡率显著升高(P<0.05).细胞周期、凋亡相关蛋白P21上调,cyclinD1、p-Rb下调.结论 Notch2靶向干扰能够显著抑制U251细胞株的增殖、阻滞细胞周期、增加凋亡.     

LRIG3基因对脑胶质瘤细胞系U87和U251的细胞周期、侵袭性和凋亡的影响

目的探讨过表达的富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白3(LRIG3)基因对脑胶质瘤细胞系U251和U87的细胞周期、侵袭能力和凋亡的影响。方法将过表达的LRIG3质粒(实验组)和空白质粒(对照组)经慢病毒法感染胶质瘤细胞系U251和U87,筛选稳定细胞株,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot检测LRIG3表达的变化,碘化丙啶染色后用流式细胞仪测定细胞周期的变化,TransWell小室法检测细胞的侵袭能力,用免疫组化原位末端标记法(TUNEL)检测各组凋亡细胞。结果与对照组相比,实验组U251与U87细胞中LRIG3mRNA水平分别上升67.6%和79.9%,蛋白表达水平分别升高62.3%和91.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组U251细胞中S期与G2/M期细胞数之和低于对照组,有统计学意义(P<0.05);但U87细胞与对照组比无明显差异。实验组U251细胞中穿出细胞数量均明显少于对照组(P<0.05),TUNEL染色结果显示对照组U251细胞凋亡率为23.4%,实验组为35.7%;对照组U87细胞凋亡率为20.2%,实验组为39.5%;对照组与实验组间凋亡率均有明显差异(P<0.05)。结论 LRIG3基因过表达能阻断细胞周期于S期和G2/M期,降低胶质瘤细胞的侵袭能力,加速细胞凋亡。     

反义miR-21抑制异种移植U87人脑胶质瘤生长的体内研究

目的 探讨敲低miR-21表达抑制裸鼠皮下荷U87人脑胶质瘤生长的疗效和机制.方法 原位注射miR-21反义寡聚核苷酸(AS-miR-21)治疗裸鼠皮下荷U87人脑胶质瘤.定时测量肿瘤大小评估原位注射AS-miR-21的治疗效果.使用RT-PCR和原位杂交方法 鉴定治疗后miR-21表达水平,采用HE染色和免疫组织化学染色(增殖细胞核抗原、细胞周期抑制因子-21、基质金属蛋白酶-9和隔蛋白-7)评价治疗后肿瘤生物学性状的变化,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡. 结果 肿瘤生长曲线显示AS-miR-21治疗组肿瘤生长速度及体积明显小于对照组与无义序列治疗组,差异有统计学意义(F=6.056,P=0.007);RT-PCR检测显示AS-miR-21治疗组miR-21表达下调为对照组的(0.031±0.008)%;原位杂交显示AS-miR-21治疗组miR-21表达水平较对照组与无义序列治疗组下调:组织病理学检测表明AS-miR-21治疗后肿瘤恶性度降低;TUNEL法检测可见AS-miR-21治疗组细胞凋亡数明显高于对照组与无义序列治疗组,差异有统计学意义(F=141.021,P=0.000). 结论 以miR-21作为靶点治疗异种移植U87人脑胶质瘤效果令人满意,miR-21可作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.     

过表达MiR-494抑制脑胶质瘤细胞U87的增殖

目的观察微小RNA-494(miR-494)对脑胶质瘤细胞U87增殖能力的影响。方法通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测5例瘤旁组织和14例胶质瘤样本中miR-494的表达水平,并且检测其在6种胶质瘤细胞系中的表达;将100 nmol/L miR-494 mimics瞬时转染至脑胶质瘤U87细胞,qRT-PCR检测miR-494表达情况;采用四唑盐比色法(MTT)检测U87细胞增殖情况;流式细胞术(FCM)检测对U87细胞周期的影响。结果与瘤旁脑组织相比,miR-494在胶质瘤中呈现低表达;U87细胞转染48 h后,miR-494 mimics组miR-494表达为对照组的357倍(P0.05);与对照组相比,miR-494 mimics转染后抑制了U87细胞的增殖能力(P0.05);S期细胞显著减少,而G1期细胞则明显增多。结论 miR-494在胶质瘤中低表达,过表达miR-494 mimics有效抑制了U87细胞的增殖,调节细胞周期S期降低G1期增多,提示miR-494有望成为胶质瘤治疗的分子靶点。     

miR-93在脑胶质瘤的表达及其对胶质瘤细胞系U87、U251细胞增殖的影响

目的 探讨miR-93在脑胶质瘤的表达及其对胶质瘤细胞系U87、U251细胞增殖的影响。方法采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测61例脑胶质瘤组织及正常脑组织的miR-93表达水平。构建慢病毒载体,转染抑制胶质瘤细胞系U87、U251中miR-93的表达。检测转染后24、48、72、96 h的胶质瘤细胞系U87、U251细胞增殖和克隆形成数。结果 61例胶质瘤组织标本中,44例(72. 1%) miR-93表达水平明显高于正常脑组织。其中WHOⅠ级胶质瘤的阳性表达率为20%(1/5)、Ⅱ级为71. 4%(15/21)、Ⅲ级为73. 3%(11/15)、Ⅳ级为85%(17/20)。miR-93在WHOⅠⅣ级胶质瘤组织的表达值分别为1. 25、5. 91、6. 71、31. 20。转染抑制U251、U87细胞的miR-93表达后,细胞的增殖活性明显被抑制(均P 0. 05),并且U251、U87细胞的克隆形成能力明显降低(均P 0. 01)。结论 miR-93在脑胶质瘤中的表达水平较正常脑组织明显增高,且与胶质瘤的分级相关; miR-93能促进胶质瘤细胞的增殖。     

隔蛋白7对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响

目的 检测SEVT7对胶质瘤细胞系U251的细胞周期、增殖、侵袭以及凋亡的影响.方法 流式细胞术分析转染SEPT7对细胞周期的影响,Western blot检测细胞周期因子表达变化,MTT法和Annexin V法评价SEFT7对U251细胞的增殖活性和凋亡的影响,Martrigel三维立体培养分析转染SEPT7后U251细胞侵袭能力的变化.结果 SEPT7使U251细胞G0/G1期阻滞,S期细胞比例(SPF)降低,增殖活性和侵袭能力明显受到抑制,并可诱发细胞凋亡.结论 SEPT7抑制U251细胞侵袭、增殖,促进凋亡.结果 提示,SEPT7是对胶质瘤具有抑制作用的基因.     

腺病毒介导的TIMP-2基因对恶性胶质瘤血管生成能力的影响

目的探讨基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-2)参于恶性脑胶质瘤发生发展,及对脑胶质细胞瘤血管生成的抑制作用.方法选用含TIMP-2基因的重组腺病毒载体,体外转染人胶质瘤细胞系U87,用逆转录酶-多聚酶链反应法(RT-PCR)检测其mRNA的表达,并用酶联免疫分析法(ELISA)检测其蛋白表达.用四唑蓝比色法(MTT)法检测含TIMP-2上清对人脐静脉内皮细胞生长(ECV-304)的影响,并检测它对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的作用.结果 RT-PCR 、Western结果表明转染AdTIMP-2病毒后的U87细胞TIMP-2表达上调.MTT 示蛋白含量为100 ng/ml 的TIMP-2对人脐静脉内皮细胞生长表现出明显的抑制作用.CAM 结果显示AdTIMP-2组可见血管稀疏区,并出现血管结构紊乱.血管指数:U87组为(91.1± 8.2)%、AdX-gal组为(62.4±3.3)%,AdTIMP-2组为(45.7±6.1)%.VIII因子相关抗原的表达病理指数U87组为17.27±7.48, AdX-gal组为16.98±7.54,AdTIMP-2组为 6.78±3.37. 结论 TIMP-2基因是为胶质瘤的抗血管生成治疗的临床应用提供了实验依据.     

miR-137对U87胶质瘤细胞中EZH2表达和细胞增殖的影响

目的研究miR-137对U87胶质瘤细胞EZH2表达及细胞增殖的影响。方法先用双荧光素酶报告基因检测系统筛选靶向EZH2 3'-非翻译区(3'-UTR)的miRNA,然后采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测在胶质瘤细胞中作用最强的miRNA对EZH2 mRNA和蛋白表达的影响,再用MTT法检测该miRNA对U87胶质瘤细胞增殖的影响。结果胶质瘤细胞中低表达的9个miRNA被预测靶向EZH2的3'-UTR。双荧光素酶报告基因检测表明:miR-126、miR-137和miR-138能使荧光素酶活性显著降低,其中miR-137的作用最强(P<0.01)。RT-PCR和Western blot结果也显示miR-137能抑制EZH2 mRNA和蛋白的表达。MTT结果显示:miR-137能抑制U87胶质瘤细胞增殖,过表达EZH2基因可拮抗miR-137对胶质瘤细胞增殖的抑制作用。结论 miR-137可抑制U87胶质瘤细胞增殖,可能与抑制EZH2基因表达有关。     

下调BAG3表达对胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨下调BAG3表达对胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响。方法 体外培养U87细胞,转染pEGFP-BAG3-shRNA质粒构建BAG3低表达胶质瘤U87细胞株（低表达组）,转染pEGFP-shRNA对照质粒为对照组;利用RT-PCR和免疫印迹法鉴定;利用CCK8和EdU检测U87细胞增殖,利用流式细胞术检测U87细胞凋亡。结果 与对照组相比,RT-PCR和免疫印迹法检测结果显示低表达组BAG3 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）,低表达组24、48、72 h细胞增殖水平均明显降低（P<0.05）,低表达组细胞凋亡率明显增高（P<0.05）。结论 下调胶质瘤U87细胞BAG3表达显著抑制其增殖、促进其凋亡。     

Beclin 1 基因对恶性胶质瘤细胞 U87 自噬活性和增殖的影响简

目的研究BeclinJ基因对U87胶质瘤细胞自噬和增殖的影响。方法实验分5组：空白对照组．pSUPER—Bec组（表达BeclinsiRNA）与其阴性对照组（pSUPER—non组）,pcDNA3．1-Bec组（表达BeclinJ基因质粒）与其阴性对照组（pcDNA3．1-non组）。分别转染U87细胞,采用免疫印迹检测Beclin1、LC3和p62蛋白在各组的表达;用氚标胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR）检测各组细胞增殖率。结果转染后48h,pSUPER—Bec组Beclin1、LC3B—11蛋白表达下降,p62蛋白表达升高。pcDNA3．1-Bec组Beclin1、LC3B-Ⅱ蛋白表达升高,p62蛋白表达下降。与空白对照组或pcDNA3．1-non组相比．pcDNA3．1-Bec组细胞增殖速度降低（P〈0．05）,其他各组细胞增殖速度无明显差异。结论恶性胶质瘤细胞中自噬相关基因Beclinj表达下降,过表达Beclinl蛋白能增强细胞的自噬活性,抑制细胞的增殖活性。     

米托蒽醌联合顺铂对脑胶质瘤U87细胞株的影响

目的 体外观察米托蒽醌(mitoxantrone,NVT)联合顺铂(cisplatin,CDDP)对脑胶质瘤U87细胞株的增殖抑制作用及可能的协同机制.方法 MTT法检测浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL NVT、CDDP以及两药物联合对U87细胞的增殖抑制作用.RT-PCR法检测CDDP、NVT及两药联合对U87细胞上Bcl-2和Bax基因表达的影响.结果 MTT法检测结果显示,NVT浓度为0.3125μg/mL联合相同浓度CDDP时,两药联合能明显增强其对U87细胞的增殖抑制作用(67.7%±1.5%);RT-PCR法检测显示,CDDP组Bax基因的表达明显高于正常对照组,但对Bcl-2基因无此作用;低浓度的NVT和两药联合Bcl-2基因的表达明显低于正常对照组及顺铂组.结论 胶质瘤U87细胞在化疗药物NVT和CDDP两药物联合作用下可通过诱导Bcl-2/Bax基因表达量的改变,协同发挥其促凋亡作用,从而增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性.     

RhoE表达上调抑制U87细胞增殖与侵袭

目的探讨RhoE在胶质瘤发生发展过程中的作用。方法将包含RhoE基因的质粒转染U87细胞后,采用四唑盐（MTr）法检测细胞增殖能力的变化;Transwell侵袭试验检测细胞侵袭能力的改变;Westernblot分析细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2和-9的表达变化。结果RhoE蛋白在U87和U251细胞系中表达明显低于正常人脑胶质细胞;上调RhoE表达,U87细胞增殖和侵袭能力明显下降（P〈0．05）;Westernbolt检测显示上调RhoE表达能够降低U87细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平（P〈0．05）。结论上调RhoE的表达能够抑制胶质瘤U87细胞的增殖和侵袭能力。     

芹菜素对脑胶质瘤细胞U87增殖、侵袭及迁移能力的影响

目的 探讨芹菜素对脑胶质瘤U87细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响及作用机制。方法 体外培养脑胶质瘤U87细胞,加入20、40、80 μmol/L芹菜素干预,以培养基作为空白对照组。使用MTT法检测U87细胞的增长抑制率,使用Hocst染色法观察细胞凋亡情况;使用Transwell检测U87细胞侵袭能力;划痕实验法检测U87细胞迁移能力;使用免疫印迹法检测U87细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、Bak1、Caspase-3表达水平。结果 与空白对照组比较,芹菜素组细胞抑制率显著增加（P<0.05）、细胞凋亡数目明显增加（P<0.05）、细胞侵袭数目显著下降（P<0.05）、细胞迁移数目明显减少（P<0.05）,U87细胞MMP-2、MMP-9、Bak1蛋白表达显著下降（P<0.05）,Caspase-3蛋白表达显著升高（P<0.05）;而且均呈浓度依赖性。结论 芹菜素可有效抑制脑胶质瘤U87细胞增殖、促进凋亡,可能与下调MMP-2、MMP-9、Bak1蛋白表达水平,上调Caspase-3表达有关。