重组人角质细胞生长因子-2流体膜的研究

人角质细胞生长因子-2（keratinocyte growth factor-2，KGF-2）又称为成纤维细胞生长因子-10（fibroblast growth factor—10，FGF-2），是FCF家族成员之一，特异性靶细胞为各种上皮细胞，特异性受体为氨酸激酶受体FGFR-2IIIb（KGFR）和FGFRI。KGF-2生理作用主要承担间质细胞一上皮细胞之间的信号传递，它能促进角质上皮细胞的增殖，刺激伤口周围上皮细胞的再生、分化和迁移，但对成纤维细胞和内皮细胞则无直接作用，     

重组人角质细胞生长因子-2涂膜剂促进大鼠皮肤烫伤的修复

角质细胞生长因子-2(Keratinocyte growth factor-2，KGF-2)又称成纤维细胞生长因子-10(Fibroblast Growth Factor-10，FGF-10)，是FGF家族成员之一。KGF-2生理作用主要承担间质细胞-上皮细胞之间的信号传递。KGF02能促进角质上皮细胞的增殖，刺激伤口周围上皮细胞的再生、分化和迁移，     

重组截短型人角质细胞生长因子-1的表达及纯化

目的：构建高效表达N端缺失的23个氨基酸重组人角质细胞生长因子1( rhKGF1_dest23)的基因工程菌,为治疗放化疗后口腔黏膜炎的新药开发提供实验数据。方法：利用PCR方法分别以pET3c-hKGF1及sumo-EGF为模板合成N端缺失的23个氨基酸rhKGF1_dest23及sumo基因片段,构建4种原核表达载体pET22b-rhKGF1_dest23﹑pET22b-sumo-rhKGF1_dest23﹑pET3c-rhKGF1_dest23和pET3c-sumo-rhKGF1_dest23,分别转化原核表达宿主菌Rosetta(DE3) plysS、BL21(DE3) 、BL21(DE3)Star plysS、origima(DE3) 和BL21AI,筛选rhKGF1_dest23蛋白表达的最佳质粒与宿主菌组合。CM离子交换和肝素亲和层析法纯化rhKGF1_dest23蛋白,Western blotting法鉴定rhKGF1_dest23蛋白。结果： pET22b-rhKGF1_dest23质粒与BL21AI 宿主菌为最佳组合表达,经IPTG与阿拉伯糖诱导, SDS-PAGE电泳后表明目的蛋白大部分以可溶性形式存在,约占菌体总蛋白的10％,经CM和肝素两步纯化后rhKGF1_dest23蛋白纯度为95%以上,Western blotting法鉴定为rhKGF1_dest23蛋白。结论：成功构建表达人KGF1_dest23重组蛋白的基因工程菌,经IPTG与阿拉伯糖诱导,CM弱阳离子与肝素亲合层析后,得到了纯化的rhKGF1_dest23蛋白。     

重组人角质细胞生长因子-2对兔碱烧伤模型角膜上皮损伤的治疗作用

目的: 研究外用旋滴重组人角质细胞生长因子-2（KGF-2）对兔碱烧伤模型角膜上皮损伤的治疗作用,为角膜上皮损伤的早期治疗探索新方法。 方法: 制备兔角膜碱烧伤模型,60只日本大耳白兔随机分为碱烧伤对照组和KGF-2组（25 mg/L）(n=30);各组日本大耳白兔于造模后以50 μL药物滴眼,每日3次。7和14 d裂隙灯观察角膜烧伤面积以及角膜新生血管的形成,MTT法检测角膜上皮细胞活性,免疫组化方法进行病理组织学检查。结果：碱烧伤后7和14 d,KGF-2组角膜烧伤面积小于碱烧伤对照组,差异有显著性（P<0.01）。碱烧伤对照组7 d角膜新生血管发生率为17.50%,KGF-2组为7.32%;碱烧伤对照组14 d角膜新生血管发生率为41.67%,KGF-2组为32.5０%。MTT检测结果显示：碱烧伤后7和14 d,KGF-2组492 nm吸光度与碱烧伤对照组比较差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。碱烧伤后7和14 d,病理切片HE染色显示：对照组角膜基质水肿,板层纤维排列松散、紊乱,炎症反应反复出现,角膜上皮层变薄,部分脱落,角膜内皮层内侧有大量成纤维细胞增生;KGF-2组碱烧伤后7 d,角膜上皮细胞生长良好,基质轻度增厚,无明显的炎症反应;碱烧伤后14 d,未出现炎症复发,角膜上皮细胞生长良好,排列整齐,角膜基质仅有轻度增厚。结论：外用旋滴25 mg/LKGF-2可加速角膜上皮损伤的恢复,减轻角膜烧伤的各种炎症反应症状;减轻角膜基质水肿和纤维化,同时KGF-2 亦表现出显著的抑制角膜新生血管形成的作用;KGF-2有可能成为另一个对角膜上皮损伤具有重要调控作用的生长因子。     

不同理化因素对重组人成纤维细胞生长因子21蛋白纯度的影响

目的:研究重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF21)在不同保存条件下的稳定性,阐明温度、pH值、缓冲溶液和反复冻融因素对rhFGF21稳定性的影响,进一步完善纯化rhFGF21的工艺。方法:rhFGF21在不同温度(-20℃、4℃和25℃)、不同pH值缓冲液(醋酸-醋酸钠缓冲液pH 4.0和pH 5.0、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH 5.0和pH 6.0、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0,Tris-HCl缓冲液pH 7.5和pH 8.0)中及反复冻融条件下分别保存,采用高效液相色谱法(HPLC)检测rhFGF21纯度,同时观察外观性状。结果:于-20℃和4℃分别保存时,rhFGF21的各项性质在观察期内均无明显变化;25℃时,rhFGF21存放14 d纯度由0 d时(100.00±0.00)% 下降至(15.20±0.14)% (P<0.01);在pH4.0和pH 5.0缓冲液中25℃条件下保存7 d,溶液出现浑浊;在pH 5.0和pH 6.0缓冲液中25℃条件下保存7 d,溶液出现浑浊;在pH 6.5和pH 8.0 磷酸盐和Tris-HCl缓冲液中,溶液澄清透明;rhFGF21原液反复冻融后其纯度变化差异有统计学意义(P<0.05)。结论:rhFGF21在低温和pH 6.5~8.0磷酸盐和Tris-HCl缓冲液中溶液较稳定,反复冻融处理对rhFGF21稳定性也有明显影响。     

角质细胞生长因子2的优化表达及纯化研究

目的优化工程菌的表达,比较肝素亲和层析、离子交换层析两种方法的角质细胞生长因子2（keratinocyte growthfactor,KGF-2）的纯化产量及纯度,以获取高效的提纯工艺。方法工程菌分别进行生长密度和诱导时间的实验,并将细茵裂解液上两种层析柱进行分步洗脱,收集目标蛋白,进行电泳分析。结果获得高表达KGF-2工程菌,表达率为29％;用两种层析方法获得电泳纯KGF-2。结论 离子交换层析在纯化过程中具有一定优势。     

乳糖诱导角质细胞生长因子-2在大肠杆菌中的表达

目的：研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行角质细胞生长因子-2(KGF-2)基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。方法：分别比较乳糖诱导浓度、诱导时机、诱导时间及诱导温度对重组表达产物的影响,并以IPTG诱导作为对照,确定较为优化的乳糖诱导条件。结果：对于重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到良好效果,以乳糖为诱导剂的A₆₀₀值较IPTG高,诱导产物的表达量与IPTG诱导产物相当。以终浓度为10 g/L乳糖在33℃下诱导6 h,可以达到良好的诱导效果,并且具有较好的可溶性和促细胞生长活性。结论：乳糖可替代IPTG诱导角质细胞生长因子基因表达,并取得良好效果,为工程
化生产提供了良好的实验依据。     

角质细胞生长因子2在创面愈合中的作用

角质细胞生长因子2是成纤维细胞生长因子家族近年新发现成员之一,由间质细胞分泌,其受体分布于上皮细胞,能特异性的促进上皮细胞生长、分化和迁移。研究显示角质细胞生长因子2是一个多功能因子,对表皮、真皮和黏膜组织具有显著的促再生和修复作用。     

重组人表皮生长因子在人工胃液和肠液中的稳定性

取重组人表皮生长因子(rhEGF)分别加入到人工胃液(pH2)、人工肠液(pH6．8)和加胃蛋白酶的人工胃液、加胰酶的人工肠液中，定时取样，采用放射免疫分析法测定不同时间内rhEGF含量。结果发现，rhEGF、在人工胃液和人工肠液中的含量随时间的延长而呈下降趋势，1h后人工胃液和人工肠液中rhEGF浓度分别下降43．46％和21．91％；但在酶的存在下1h后rhEGF浓度分别下降89．62％和79．52％。这表明rhEGF在人工胃、肠液中均比较稳定，但在酶的存在下rhEGF失活速度可明显加快。     

人胰岛素样生长因子前体基因的重组、表达及其蛋白纯化

目的：构建含有人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor-1，hIGF-1）前体编码全长cDNA的重组载体，使其在E-coli BL21（DE3）中表达，并对此表达菌株所表达的重组蛋白进行纯化，同时探讨其抗原性及应用价值。方法：采用PCR法，扩增编码hIGF-1前体cDNA的片段，通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a（＋）／hIGF-1重组载体，然后将其转化入BL21（DE3）中，经IPrG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化，并用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果：重组质粒pET32a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。BL21（DE3）表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后显示．其表达量占细菌总蛋白量的25％左右．该重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90％以上。Western blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带，表明此重组蛋白具有免疫学特异性。结论：pET32a（＋）／hIGF-1重组载体构建成功，并能够高效表达。     

抗人胰岛素样生长因子-1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定.方法:用纯化后的hIGF-1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗hIGF-1的mAb,用Western blot法鉴定mAb的特异性,用间接ELISA法检测mAb腹水效价及mAb的亲和力,杂交瘤细胞染色体分析,鉴定Ig亚类.结果:获得2株能稳定分泌抗hIGF-1的mAb杂交瘤细胞系,Western blot分析显示,该mAb能与具有生物学活性的成熟IGF-1蛋白结合.腹水mAb效价可达6×104.mAb相对亲和力为2.1×109/mol～7.8×109/mol.2株单抗属IgM亚类.染色体分析符合杂交瘤细胞特征.结论:成功制备出抗hIGF-1的2株mAb杂交瘤细胞,为进一步用于hIGF-1的临床检测和实验研究创造了条件.     

重组人生长激素治疗不同病因矮小症患儿效果观察

目的 探讨重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)治疗不同病因矮小症患儿临床效果及安全性.方法 回顾性分析2005年8月至2015年10月在重庆医科大学附属儿童医院内分泌专科门诊诊断为矮小症患儿200例,其中生长激素缺乏症(growth hormone deficiency,GHD)患儿73例[男性43例,女性30例,年龄(9.5±3.3)岁],特发性矮小症(idiopathic short stature,ISS)患儿56例[男性22例,女性34例,年龄(8.9±2.7)岁],特纳综合征(Turner syndrome,TS)患儿50例[年龄(9.9±2.9)岁],宫内发育迟缓(small for gestational age,SGA)患儿21例[男性8例,女性13例,年龄(6.3±2.2)岁],rhGH治疗2～4年,评价不同病因矮小症患儿身高变化、年生长速度(growth velocity,GV)、身高标准差分值(height standard deviation scores,Ht SDS)、体质指数(body massindex,BMI)、体质指数标准差分值(BMI standard deviation scores,BMI SDS)、骨龄(bone age,BA)、终身高(final adult height,FAH)的差异,并观察不良反应.结果 ①经rhGH治疗后,前述不同病因矮小症患儿年生长速度较治疗前均有明显增长,且以第1年增长最明显,分别达到(11.23±2.63)、(9.91±1.67)、(8.45±1.83)、(9.78±1.72) cm/年;治疗第2～4年逐渐减缓.②经rhGH治疗后,不同病因矮小症患儿Ht SDS逐年改善,其中GHD患儿Ht SDS变化(△Ht SDS)改善(2.12±1.12)优于ISS患儿(1.51±0.82)、TS患儿(1.23±0.73)及SGA患儿(2.07 ±1.04).③随访部分已达终身高患儿,其终身高趋近于靶身高.④经rhGH治疗后,不同病因矮小症患儿BMI及BMI SDS均呈现缓慢上升趋势.⑤随访2～4年,不同病因矮小症患儿骨龄及青春期无明显提前,不良反应少见.结论 rhGH对GHD、ISS、TS、SGA患儿均有明显的促增长作用,但不同病因的矮小症患儿间rhGH疗效存在较大差异.     

重组人生长激素对肝癌细胞MHCC-97H的作用及机制

目的探讨重组人生长激素（rhGH）对肝癌细胞MHCC-97H的作用及机制。方法以无血清培养液诱导肝癌细胞MHCC-97H凋亡,再以浓度为0μg/L（GH0组）、5μg/L（GH5组）、25μg/L（GH25组）、50μg/L（GH50组）、100μg/L（GH100组）和500μg/L（GH500组）的rhGH完全培养液进行培养,MTT法观察MHCC-97H细胞生长情况,流式细胞技术检测细胞凋亡率、细胞周期和细胞增殖指数,RT-PCR和Western blotting法分别检测凋亡相关基因Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白表达情况。结果与GH0组比较,GH25组、GH50组、GH100组和GH500组MHCC-97H细胞增殖明显,S期细胞百分比和细胞增殖指数显著增加（P〈0.05）;GH25组、GH50组和GH100组细胞凋亡率显著降低（P〈0.05）,Bax mRNA和蛋白表达显著降低（P〈0.05）,Bcl-2 mRNA和蛋白表达显著增加（P〈0.05）。结论 rhGH体外显著促进肝癌细胞MHCC-97H增殖,并通过调节凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达来抑制无血清培养液诱导的细胞凋亡。     

重组截短型人角质细胞生长因子1在昆虫细胞中的表达

目的：探讨重组截短型人角质细胞生长因子1（rhKGF1_d23）蛋白在昆虫细胞中表达的可行性,为rhKGF1_d23蛋白的生产提供新的途径。方法：PCR法扩增昆虫偏爱密码子优化截短序列kgf1_d23亚克隆到pFastbac载体。在辅助质粒的作用下,pFastBac-kgf1_d23载体Tn7片段转座到Bacmid 中mini-attTn7位点,得到穿梭载体Bacmid-kgf1d23,并通过脂质体法转染sf-9细胞得到杆状病毒P1。继续转染细胞扩增病毒并提高病毒滴度,蛋白表达分析从P3代病毒转染细胞开始,收集细胞超声裂解后进行纯化,MTT法检测纯化后目的蛋白生物活性。结果：昆虫偏好密码子改造的kgf1_d23基因构建进转移载体pFastBac-kgf1_d23和穿梭载体Bacmid-kgf1_d23载体中。SDS-PAGE 结果表明,重组蛋白在60 h后开始大量表达,优化的收获蛋白时间在84～96　h;利用肝素亲和层析和SP阳离子交换层析可以去除90%以上的杂蛋白。纯化的rhKGF1D23蛋白在0.3~25.0 μg•L^-1时,随浓度的增加HaCat细胞的促有丝分裂能力增强,在25.0 μg•L^-1时达到平台期。结论：重组截短型角质细胞生长因子rhKGF1_d23蛋白在昆虫细胞中得到表达,保持其特有的肝素亲和特性,并具有免疫原性及细胞生物学活性。     

重组人生长激素对裸鼠胃癌移植瘤生长及血清VEGF浓度的影响

目的:研究重组人生长激素(rhGH)对裸鼠人胃癌移植瘤生长及血清VEGF水平的影响。方法:取60只雄性裸鼠进行实验,通过免疫细胞化学染色法检测胃癌细胞株SGC-7901及MKN-45生长激素受体(GHR)的表达状况,将GHR阳性表达的胃癌细胞株SGC-7901及GHR阴性表达的胃癌细胞株MKN-45分别接种于4只裸鼠皮下,制作裸鼠胃癌皮下移植瘤模型,3周后取出移植瘤制成组织匀浆,接种于剩余52只裸鼠。依据接种细胞种类不同分为移植瘤GHR阳性表达和GHR阴性表达裸鼠,不同GHR表达的裸鼠进一步分为对照组(C组:予0.9%NaCl,0.2 ml.d-1)、rhGH低剂量组(L组:予rhGH0.5 U.kg-1.d-1)、rhGH高剂量组(H组:予rhGH2.5 U.kg-1.d-1),连续给药14 d,观察并记录各组裸鼠体重和肿瘤体积变化,酶联免疫吸附法测定血清VEGF含量。结果:SGC-7901为GHR阳性表达的人胃癌细胞株,MKN-45为GHR阴性表达的人胃癌细胞株。对于接种GHR阳性表达的人胃癌细胞株的裸鼠,rhGH给药组皮下移植瘤体积较对照组增大(P<0.05),且H组促增长效应显著(P<0.05),3组...