SLC真核表达质粒的剂量-趋化效应及抑瘤效应研究

目的：观察次级淋巴组织趋化因子（SLC）真核表达质粒剂量-趋化效应关系及不同剂量体内应用时对小鼠H22肝癌的治疗作用。方法：构建了小鼠SLC真核表达质粒（pSLC），体外转染检测pSLC在体外的剂量-趋化效应关系，体内不同剂量的pSLC质粒局部注射检测其表达情况及体内的剂量-趋化效应关系，并观察不同剂量的pSLC对小鼠H22肝癌治疗的剂效关系。结果：当剂量在0．5μg以下时，pSLC在体外转染的趋化效应与转染剂量呈正相关，但在0．75μg时明显下降；pSLC体内局部注射时，在所检测的200μg剂量以内，随注射质粒剂量的增加，其表达的mRNA水平逐渐增加，相应地，对淋巴细胞的趋化作用亦逐渐增强，pSLC对肿瘤的抑制作用亦随其剂量的增加而明显增强（P〈0．001）。结论：体内局部转染表达pSLC，能够有效趋化聚集免疫细胞，对肿瘤产生免疫治疗效应。通过提高转染表达效果，可增加SLC趋化作用，增强肿瘤免疫治疗效应。     

采用sPD-1协同4-1BBL进行肿瘤免疫基因治疗的研究

目的探讨采用sPD-1协同4-1BBL进行肿瘤免疫基因治疗的效果及相关的免疫学机制。方法以不同剂量的H22肝癌细胞接种于BALB/c小鼠右后腿肌肉内,建立小鼠肿瘤模型;采用可溶性PD-1 (sPD-1)和4-1BBL真核表达质粒体内转染进行基因治疗;观察接种不同剂量肿瘤细胞、不同治疗时间小鼠的成瘤率及肿瘤治疗效果;RT-PCR检测肿瘤微环境中免疫调控相关基因的表达;组织切片检测肿瘤细胞浸润肌肉组织的组织学变化;流式细胞仪检测脾脏细胞毒性T细胞(CTLs)的杀瘤效率。结果转染4- 1BBL/sPD-1基因治疗后,接种低剂量(1×10~4个/ml)H22肿瘤细胞的小鼠肿瘤生长完全受到抑制;接种高剂量(1×10~5个/ml)H22肿瘤细胞的小鼠肿瘤也受到显著抑制。通过延长基因治疗,荷瘤小鼠的成瘤率随着治疗时间的延长逐渐递减,至8周时成瘤率为0;基因治疗不仅促进IFN-γ和IL-2基因表达上调,而且也使TGF-β、IL-10的表达下调;瘤组织中CD8~ T淋巴细胞数量增多和脾淋巴细胞的杀瘤效率显著增加。结论利用体内存在的少量肿瘤可作为抗原刺激淋巴细胞的激活;基因治疗适用于对手术、化疗、放疗后体内残存的少量肿增细胞的清除;当体内存在大量肿瘤细胞时,适当延长基因治疗时间可获得较好的治疗效果。     

小鼠IFN-γ真核表达载体的构建及其抗肿瘤效应研究

目的：构建小鼠IFN-γ的真核表达载体，将载体在体外转染小鼠腹腔MΦ，观察MΦ的抗肿瘤效应。在荷瘤小鼠腹腔内注射重组表达载体，观察抗肿瘤效应。 方法： RT-PCR扩增小鼠IFN-γ mRNA，将扩增的cDNA通过亚克隆重组到表达载体pcDNA3.1上。体外转染小鼠的腹腔MΦ，RT-PCR检测小鼠IFN-γ mRNA的表达，用转染的MΦ的培养上清培养另一组MΦ，MTT法检测MΦ对肿瘤细胞的杀伤活性。将重组质粒注射到荷瘤小鼠腹腔，观察小鼠腹水出现时间和存活时间。 结果: 将小鼠基因的开放阅读框（ORF）重组到真核表达载体pcDNA3.1内，测序证实和GenBank所公布序列相符。体外将IFN-γ基因导入MΦ内并表达，其培养上清对MΦ有激活作用，杀伤肿瘤细胞活性增强。腹腔内注射重组表达载体，荷瘤小鼠的腹水增长延迟、荷瘤生存时间延长。 结论： 构建的小鼠pcDNA3.1-IFN-γ表达载体体外转染腹腔MΦ并获表达，体内外实验显示有抗肿瘤细胞活性。     

HBsAb靶向干扰素和IL-12双表达质粒pVAX-HBVE的构建与应用

目的构建能同时表达HBsAb靶向干扰素(dsFvα)和人白细胞介素12(hIL-12)的新型基因治疗质粒pVAX-HBVE。方法将pEE14.1-dsFvα质粒双酶切获得dsFvα片段,克隆入经同样双酶切后的载体pVAX-IRES-hIL-12 IRES序列的上游,构建重组表达质粒命名为pVAX-HBVE。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,ELISA检测目的基因表达;提取重组质粒pVAXHBVE,注射到乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转入1.3拷贝HBV全基因组的BALB/c小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果 pVAX-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pVAX-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够含有靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的双表达质粒,为慢性乙肝基因治疗提供新的策略。     

膜型Tim-3分子促进荷瘤小鼠抗肿瘤免疫应答的研究

目的研究膜型Tim-3分子对H22肝癌细胞生长的抑制效应,探讨膜型Tim-3分子对荷瘤小鼠免疫系统的影响。方法以H22肝癌细胞接种于BALB/c小鼠大腿肌肉建立小鼠实体瘤模型,采用原位注射裸DNA的方法在小鼠体内表达膜型Tim-3进行基因治疗,观察Tim-3对肿瘤生长的抑制作用;采用RT- PCR技术在肿瘤生长不同时期检测Tim-3对4-1BB、IFN-γ、galectin-9等免疫相关基因表达的影响;流式细胞术检测膜型Tim-3对脾细胞增殖活性及细胞毒活性的影响;观察Tim-3 4-1BBL协同抗肿瘤作用。结果体内转染表达Tim-3对肿瘤的生长有明显的抑制作用。流式细胞术结果显示,在小鼠荷瘤早期,Tim-3可提高脾细胞在特异性抗原刺激下的增殖反应和对H22肿瘤细胞的细胞毒作用;Tim-3与4-1BBL协同作用时抗肿瘤作用更加明显。结论膜型Tim-3可在免疫启动阶段作为正向免疫调节因子增强抗肿瘤免疫应答,并可与4-1BBL协同产生更强的抑瘤效应。     

sPD-1封闭PD-L促进抗瘤免疫的机制研究

目的研究本室构建的可溶性PD-1（sPD-1）真核表达质粒pPD-1A的抑瘤机理.方法用转染了pPD-1A的BHK细胞分泌产物去封闭树突状细胞上的PD-1配体（PD-L）,并用MTT法检测树突状细胞（DC）对小鼠脾细胞的增殖激活作用.BALB/c小鼠接种H22肝癌细胞后次日开始接受质粒pPD-1A的注射.用RT-PCR法分析小鼠脾细胞的细胞因子和共刺激分子的mRNA表达水平,用流式细胞术测定肿瘤内T淋巴细胞的数量.结果在淋巴细胞活化的早期sPD-1对IL-10-DC激活淋巴细胞的作用有一定的促进,但作用并不十分显著（P＞0.05）.注射了质粒pPD-1A的小鼠产生了较强的抗瘤免疫反应,H22肝癌细胞的生长明显受到抑制（P＜0.01）.脾脏淋巴细胞的4-1BB、B7.1、IFN-γ和TNF-α表达均上调,以IFN-γ的增加最明显;OX40、IL-10表达下调.肿瘤内TIL数量明显增多（75.86%）.结论sPD-1通过对PD-L的封闭,不仅增加了肿瘤内部CD3＋T细胞的数量,而且可以调节细胞因子和共刺激分子的表达,从而促进抗瘤免疫.     

水流动力学注射介导的IL-12基因在小鼠体内的高效表达

目的:评估水流动力学注射法转移表达小鼠白细胞介素12(mIL-12)质粒pCMV-mIL-12的有效性,以及质粒DNA重复注射后转基因的表达情况.方法:通过小鼠尾静脉大体积快速注射pCMV-mIL-12质粒后取血及主要器官,应用ELISA、PCR、RT-PCR及免疫组织化学染色等方法,检测质粒在组织器官中的分布与表达.为了研究重复注射质粒后mIL-12的表达,分别在首次注射后第7天、第14天和第30天二次注射相同剂量的质粒.每次注射前及注射后均取血检测mIL-12的表达及其诱导产生的IFN-γ及NO.结果:注射后10小时血清中的mIL-12蛋白水平最高,第7天恢复到基线值,其表达呈DNA剂量依赖性.IFN-γ及NO的表达高峰均出现在注射后第3天.首次注射后第14天及第30天重复注射可获得mIL-12的再次高效表达.结论:水流动力学注射方法是一种简便、有效的体内IL-12基因转移方式.重复应用水流动力学注射方法体内转移表达mIL-12的裸DNA后,可以获得转基因的再次高效表达,两次注射间隔时间至少为14天.     

可复制型抗乙肝免疫基因治疗剂pSVK-HBVE的构建与表达

目的构建能同时表达抗体小分子靶向干扰素(dsFvα)和人白介素12(hIL-12)的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒pSVK-HBVE。方法将pVAX-HBVE质粒双酶切,回收dsFvα-IRES-hIL12片段;将dsFvα-IRES-hIL12片段克隆入早期构建的pSVK载体,得到重组质粒pSVK-HBVE。将重组质粒瞬时转染到293T细胞,ELISA法检测目的基因表达;提取重组质粒pSVKHBVE,注射乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转基因小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果pSVK-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pSVK-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够同时表达抗体靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒,为慢性乙肝免疫基因治疗提供新的备选方案。     

抗HBV的治疗性双质粒DNA疫苗的构建及初步药效学研究

目的：构建抗乙型肝炎病毒（HBV）的治疗性DNA疫苗并进行体外、体内鉴定。方法：采用PCR技术扩增含有HBV包膜中蛋白（preS2.S）抗原基因和hIL-2/hIFN-γ融合蛋白的基因,将目的基因分别亚克隆于pVAX1真核表达载体,并进行酶切和测序分析;转染双质粒于COS-7细胞检测基因及蛋白表达情况;利用Combinatotial Extension（CE）软件模建分析佐剂质粒表达融合蛋白的空间结构;双质粒联合在体电脉冲技术（EP）注射BALB/c小鼠以检测特异性的体液和细胞免疫应答。结果：经酶谱和测序分析表明,构建的双质粒pVAX1/S2.S（pS2.S）和pVAX1/IL-2IFN-γ（pIIF）的基因片段的方向、序列完全正确;ELISA法定量检测双质粒转染COS-7细胞后48小时目的基因（preS2.S和hIL-2/hIFN-γ）的蛋白表达水平较高,HBsAg、IL-2、IFN-γ的含量分别为45.1、10.03、11.5ng/ml;模拟空间结构分析表明佐剂质粒的融合蛋白中两细胞因子的活性部位均裸露在外;小鼠免疫试验结果表明,疫苗pS2.S能诱导健康小鼠的保护性抗-HBs的抗体产生,且具有剂量相关性;佐剂pIIF可显著增强疫苗pS2.S质粒的免疫效果;在EP辅助作用下,质粒pS2.S和pIIF共肌注BALB/c小鼠,低剂量就能诱导较强特异性的细胞和体液免疫。结论：成功构建了抗HBV的DNA疫苗pS2.S及佐剂pIIF质粒,并具有较特异的体内外活性。     

BCR-ABL-pIRES-SEA重组质粒在BALB/c小鼠肌肉表达分析

检测BCR-ABL-pIRES-SEA重组基因疫苗在小鼠肌肉中的表达。用已构建BCR-ABL-pIRES-SEA重组质粒免疫BALB/c小鼠一侧后肢骨骼肌,每两周一次,每次注射200μg,第七周取材用RT-PCR及免疫组织化学染色法检测目的基因在注射部位肌肉中转录和表达。结果发现:实验小鼠骨骼肌内检测到BCR-ABL和金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因的转录,以及BCR-ABL蛋白的表达,证明所构建的BCR-ABL-pIRES-SEA重组质粒在小鼠体内可以有效地表达基因产物。     

Cpn0308真核表达载体的构建及对小鼠免疫功能的影响

目的:构建Cpn0308重组质粒pcDNA3.1/His A-Cpn0308,将重组质粒腹腔注射小鼠后观察小鼠免疫反应变化,以期为进一步研究Cpn0308免疫保护性奠定基础。方法:构建pcDNA3.1/His A-Cpn0308,并用菌落PCR、双酶切、序列测定等多种技术确定其正确性;将重组质粒转染HeLa细胞,间接免疫荧光法检测细胞内蛋白表达情况;重组质粒免疫BALB/c小鼠,一定时间后Western blot检测血清Cpn0308抗体特异性,间接ELISA法检测小鼠血清中Cpn0308 IgG抗体水平、ELISA试剂盒检测血清中细胞因子。结果:pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒构建成功且序列正确;重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光;重组质粒组血清抗体A450x±s为0.343±0.024,pcDNA3.1/His A质粒组为0.174±0.018,PBS组为0.156±0.023,WB结果显示重组质粒组小鼠血清稀释800倍后仍有特异性目的条带出现,对照组不出现;重组质粒组小鼠IFN-γ浓度均值为264 ng/L,IL-4浓度均值为22 ng/L,pcDNA3.1/His A质粒组为:IFN-γ120 ng/L,IL-4 10 ng/L,PBS组为:IFN-γ99 ng/L,IL-4 9 ng/L。重组质粒组IgG抗体水平和细胞因子水平明显升高,与对照组相比有统计学差异。结论:pcDNA3.1/His A-Cpn0308真核表达重组质粒构建成功,且能够在真核细胞中表达目的蛋白;重组质粒对小鼠进行免疫后,提高了小鼠血清IgG抗体水平和细胞因子水平,为进一步研究Cpn DNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。     

脂质体介导弓形虫SAG1与SAG3复合基因诱导小鼠免疫应答研究

目的评价弓形虫SAG1与SAG3基因真核表达质粒DNA免疫小鼠的免疫应答效果。方法以PCR方法扩增出SAG1与SAG3目的基因片段,并插入载体pEGFP-N3以构建重组质粒pE- SAG1／SAG3,瞬时转染细胞Cos-7。质粒pESAG1／SAG3以10μg剂量,脂质体介导肌肉注射BALB／c小鼠,免疫3次,最后一次免疫后4周,观察体液和细胞免疫。RT-PCR方法检测注射部位目的基因的转录;斑点杂交方法检测目的基因是否与小鼠染色体基因组整合。结果质粒pESAG1／SAG3转染细胞后观察到绿色荧光;Western blot显示pESAG1/SAG3表达识别条带在相对分子质量(Mr)66．2×103附近。小鼠免疫后,血清产生抗弓形虫速殖子抗体,诱导IFN-γ及IL-2水平高于对照组。RT-PCR显示首次免疫15 d后,目的基因在肌肉组织中仍有转录,斑点杂交显示目的基因未与小鼠的基因组发生整合,混合质粒注射的小鼠抗弓形虫感染的存活时间延长。结论脂质体介导弓形虫SAG1与SAG3复合编码基因质粒接种小鼠能明显诱导体液和细胞免疫应答。     

CD74基因对重症肌无力患者胸腺上皮细胞IFN-γR基因表达的影响

目的:探讨CD74基因对重症肌无力患者胸腺上皮细胞(TEC)IFN-γR基因表达的影响.方法:原代培养重症肌无力患者胸腺上皮细胞,脂质体法转染pCMV-CD74,荧光定量RT-PCR法检测转染结果及TEC中IFN-γR等与自身免疫病相关基因mRNA水平的表达.结果:原代培养并传代的胸腺上皮细胞转染pCMV-CD74质粒后,CD74基因的表达显著提高.TEC高表达CD74基因,可引起HLA-A、ECFGI、IL4R、IL-32和IFN-γR基因表达显著增加.结论:CD74基因对TEC表达IFNγR基因有明显的促进作用.     

体内电穿孔在质粒介导的基因转移及DNA免疫中的应用

目的 研究体内电穿孔技术对于质粒DNA介导的体内基因表达以及HIV-1 Env DNA疫苗免疫效果的影响.方法 将携带荧光素酶Luciferase基因的表达质粒p1.0-Luc和携带HIV-1 CN54 env基因的DNA疫苗质粒p1.0-gp1455m通过单独肌肉注射或肌肉注射后加电穿孔两种不同方法 注射小鼠.用IVIS(R)活体成像系统实时检测Luciferase报告基因在体内的表达情况.用ELISA检测HIV-1 Env特异的抗体反应,用IFN-γ ELISPOT检测HIV-1 Env特异的T细胞免疫反应.结果 体内电穿孔技术可以显著提高Luciferase在小鼠体内的表达水平,幅度达35倍.HIV-1 Env DNA疫苗免疫结果 显示,8μg质粒剂量电穿孔途径诱导的体液和细胞免疫应答强于40μg质粒剂量单纯肌肉注射组;体内电穿孔途径免疫2次与单纯肌肉注射途径免疫3次诱导的体液和细胞免疫应答水平相当.结论 体内电穿孔技术可以大幅度提高报告基因在体内的表达水平和DNA疫苗的免疫应答.     

以TF为靶点的裸DNA疫苗脾内转染对结直肠癌的免疫抑制作用

目的:探讨以组织因子(tissue factor,TF)为靶点的裸DNA疫苗pγ1.Ig H.SPTT重组质粒脾内单次注射对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的免疫抑制作用。方法:采用分子生物学技术构建携带TF靶向肽SPTT和免疫球蛋白H链基因的裸DNA质粒pγ1.Ig H.SPTT,质粒脾内单次注射后,检测外周血转基因产物SPTT-Ig H浓度,分析质粒脾内转染效率、特性及其对CRC的作用。结果:重组pγ1.Ig H.SPTT质粒脾内单次注射后第4周脾组织即有SPTT-Ig H融合基因强表达,12周强度开始下降,至16周消失;转染质粒后第2周外周血SPTT-Ig H浓度为7.2μg/L,后逐渐升高,第8周达高峰为13.11μg/L;质粒脾内注射后转录基因定向在脾组织表达,淋巴结、骨髓、肝、肾、等组织未发现目的基因转染;pγ1.Ig H.SPTT重组质粒脾内转染对结直肠癌具有抑制作用(P0.01)。结论:以TF为靶点的裸DNA疫苗pγ1.Ig H.SPTT单次脾内注射可以激发机体对结直肠癌的保护性免疫反应,是治疗CRC的一种安全有效的免疫方法。本课题研究为裸DNA疫苗抗肿瘤免疫治疗提供了新的思路。     

重组人Hsp70提呈的H22肝癌细胞混合抗原肽治疗小鼠肿瘤的研究

目的：探讨B22肝癌细胞混合抗原肽体内抑制小鼠肿瘤的最佳方式。方法：采用冻融，低渗振荡，加热沉淀及酸处理等方法从H22肝癌细胞中制备抗原肽；将接种过H22瘤细胞的小鼠分别给予Hsp70-H22肽复合物注射，复合物＋pCH510质粒注射或化疗后给予复合物＋质粒注射，观察肿瘤抑制情况。结果：上述方法制备的抗原肽为混合肽，其与Hsp70形成的复合物体内能够抑制小鼠肿瘤生长，并且这种复合物可与pCH510质粒协同完全抑制10^5接种的瘤细胞形成肿 瘤，但不能完全抑制10^6接种的瘤细胞形成肿瘤，然而这种双因素与化疗进行衔接则可完全抑制10^6接种的瘤细胞形成肿瘤。结论：H22肝癌细胞肿瘤混合抗原肽经rhHsp70提呈可诱导H22荷瘤小鼠产生特异性免疫保护作用，与其它因素联合应用可产生更好的治疗效果。     

sPD-1和4-1BBL体内联合表达对小鼠实验性肝癌的治疗作用

目的探讨sPD-1和4-1BBL联合治疗肿瘤的效应和相关的免疫学机制。方法以H22肝癌细胞接种于BALB／c小鼠右后腿肌肉内，建立小鼠肿瘤模型；采用4-1BBL和可溶性PD-1（sPD-1）真核表达质粒通过肌肉转染进行基因治疗；检测小鼠肿瘤生长情况，并检测转染基因及肿瘤微环境中免疫调控相关基因的表达，检测肿瘤组织中的淋巴细胞数量的变化。结果单独转染4-1BBL基因或sPD-1基因均显示出抗肿瘤作用，而联合治疗对肿瘤生长抑制作用更为明显，该组抑瘤率高达92．3％（以pcDNA3．1组为对照），显著高于4-1BBL组（78％）、sPD-1组（70．2％）。联合治疗不仅使TGF-β、IL-10的表达下调，而且在治疗后期更有效地促进IFN-γ和IL-2基因表达上调，且使瘤组织中CD8^＋T淋巴细胞数量较其他各组显著增加。结论4-1BBL和sPD-1联合治疗可使肿瘤微环境中的免疫相关基因表达更有利于抗肿瘤免疫应答，增强肿瘤免疫治疗效果。     

小鼠体内RU486诱导的及肝脏特异性的IL-12基因表达

目的 研究含有RU486调控系统质粒的可诱导能力.方法 通过水流动力学注射的方法,将含有RU486调控系统、肝脏特异性启动子以及转基因IL-12的质粒pRS22注射到小鼠体内,质粒注射后不同时间点腹腔注射RU486.通过ELISA试剂盒检测血清中IL-12表达水平,通过PCR、RT-PCR以及免疫组织化学染色的方法,在DNA、RNA及蛋白质水平测试质粒pRS22在小鼠体内的可诱导性表达.结果 为了确定质粒pRS22活性的持续时间,在水流动力学注射10μg质粒后,每7天给小鼠注射1次RU486(250μg/kg),发现尽管每次诱导后血清中IL-12的水平逐渐下降,但直到质粒注射后第15周,仍然可以被诱导表达.为了测试不同诱导方式对IL-12表达趋势的影响,5μgpRS22被注射到小鼠体内后,在6d内分别每天或每两天给小鼠注射1次RU486.结果每两天诱导1次后IL-12表达呈波浪形,而每天诱导1次则可获得持续的IL-12表达.PCR和RT-PCR结果显示,无论有无RU486诱导,都能在肝脏检测到pRS22质粒及GLp65调节子mRNA的表达,但是仅能够在接受RU486的小鼠肝脏中观察到IL-12 p35亚基mRNA表达.免疫组织化学染色结果提示,IL-12蛋白只有在RU486作用下才会在肝细胞中表达.结论 在肝脏特异性启动子TTR控制下,RU486调控系统能够在时间和空间上精确控制转基因IL-12的表达.     

重组甲型流感病毒NS2蛋白抑制感染小鼠肺组织干扰素的产生

目的用大肠杆菌表达获得甲型流感病毒(IAV)非结构蛋白2(NS2),并观察NS2蛋白对小鼠肺组织γ干扰素(IFN-γ)产生的影响。方法构建p ET22b(+)/NS2原核表达质粒并转化大肠杆菌Rosetta-gami(2),通过诱导表达、纯化获得NS2。将40只BALB/c小鼠,随机分8组,分别为正常对照组、200μg/kg NS2联合病毒组、200μg/kg NS2联合RNA组、100μg/kg灭活病毒、0.2×半数致死量(LD50)病毒组、50μg/kg病毒RNA组、200μg/kg NS2组和100μg/kg NS2组,各组滴鼻给予小鼠处理。通过反转录PCR、Western blot法分别检测肺组织IFN-γ的mRNA和蛋白表达。结果在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达并纯化获得重组NS2;将NS2或/和IAV滴鼻给小鼠后,反转录PCR和Western blot法检测表明NS2联合病毒组的小鼠肺组织IFN-γmRNA和蛋白水平较病毒组均降低。结论 NS2抑制IAV所诱导的小鼠肺组织IFN-γmRNA和蛋白的水平。     

表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答

目的:探讨表达钙网蛋白(Calreticulin,CRT)和HPV E2融合蛋白的肿瘤疫苗在小鼠体内诱导的抗肿瘤免疫应答.方法:转染重组质粒得到高表达CRT、E2和CRT-E2融合蛋白的肿瘤细胞,作为肿瘤疫苗隔周两次腹腔注射免疫小鼠,17天后观察成瘤率,检测NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CIL活性以及睥淋巴细胞分泌IFN-γ水平,并观察荷瘤小鼠生存期.结果:高表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗免疫小鼠后,其成瘤率明显低于其他实验组,NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CTL活性和脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平均显著高于其它实验组(P＜0.01),生存期也明显延长(P＜0.01).结论:小鼠体内实验显示,表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗能够诱导特异性CD8+T细胞免疫应答和NK细胞活性,显著抑制了肿瘤生长.