α2,6-唾液酸转移酶 (ST6Gal I) 的表达对结肠癌细胞唾液酸化的影响

目的研究结肠癌细胞LS174T转染正义和反义的α2,6唾液酸转移酶(ST6Gal I)cDNA对结肠癌细胞表面唾液酸化及肿瘤细胞粘附功能的影响.方法结肠癌细胞株LS174T转染正义ST6Gal I cDNA或反义ST6Gal I cDNA的部分序列的表达载体pcDNA3.1, 以RT-PCR检测转染子ST6Gal I mRNA的表达, 流式细胞仪检测细胞表面α2,6唾液酸含量. 结果转染正义ST6Gal I cDNA的克隆显示ST6Gal I mRNA的表达增强以及接骨木凝集素(SNA)与细胞表面成分的结合增加;而转染反义ST6Gal I cDNA的部分序列的细胞克隆的ST6Gal I mRNA的表达减少, SNA与细胞表面成分的结合力降低. 结论 ST6Gal I的表达直接影响细胞表面α2,6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的粘附功能. 利用反义核酸技术抑制ST6Gal I的表达并降低肿瘤细胞表面α2,6-唾液酸水平可能成为减少癌细胞转移的一种手段.     

α2，6-唾液酸转移酶（ST6GalⅠ）的表达对结肠癌细胞唾液酸化的影响

目的 研究结肠癌细胞LS174T转染正义和反义的α2，6唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)cDNA对结肠癌细胞表面唾液酸化及肿瘤细胞粘附功能的影响．方法 结肠癌细胞株LS174T转染正义ST6GalⅠcDNA或反义ST6GalⅠcDNA的部分序列的表达载体pcDNA3.1，以RT—PCR检测转染子ST6GalⅠmRNA的表达．流式细胞仪检测细胞表面α2，6唾液酸含量．结果 转染正义ST6GalⅠcDNA的克隆显示ST6GalⅠmRNA的表达增强以及接骨木凝集素(SNA)与细胞表面成分的结合增加；而转染反义ST6GalⅠcDNA的部分序列的细胞克隆的ST6GalⅠmRNA的表达减少．SNA与细咆表面成分的结合力降低．结论 ST6GalⅠ的表达直接影响细胞表面α2．6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的粘附功能利用反义核酸技术抑制ST6GalⅠ的表达并降低肿瘤细咆表面α2，6-唾液酸水平可能成为减少癌细胞转移的一种手段．     

ST6Gal I 基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响

目的:探讨人α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法:设计并合成ST6GalI靶向的siRNA,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组和ST6GalIsiRNA组,采用RT-PCR测定细胞中ST6GalImRNA表达水平,流式细胞术检测细胞表面α-2,6-唾液酸含量,并分别用CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质(ECM)黏附与侵袭力。结果:与空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组相比,转染48h后,ST6GalIsiRNA组细胞中ST6GalImRNA表达明显下调;转染72h后,ST6GalIsiRNA组细胞表面α-2,6-唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组(P<0.05)。结论:化学合成的靶向ST6GalI的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalI基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗奠定基础。     

ST6Gal Ⅰ基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响

目的：探讨人α-2,6-唾液酸转移酶（ST6GalⅠ）小分子干扰RNA（siRNA）对ST6GalⅠ高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法：设计并合成ST6GalⅠ靶向的siRNA,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组和ST6GalⅠsiRNA组,采用RT-PCR测定细胞中ST6GalⅠmRNA表达水平,流式细胞术检测细胞表面α-2,6-唾液酸含量,并分别用CytoMatrix^TM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质（ECM）黏附与侵袭力。结果：与空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组相比,转染48h后,ST6GalⅠ siRNA组细胞中ST6GalⅠ mRNA表达明显下调;转染72h后,ST6GalⅠ siRNA组细胞表面α-2,6-唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组（P〈0.05）。结论：化学合成的靶向ST6GalⅠ的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalⅠ基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗奠定基础。     

不同增殖能力结肠癌细胞株iNOSmRNA表达的比较研究

目的:探讨iNOSmRNA在结肠癌不同增殖能力细胞株中的表达和作用,研究ATRA对于结肠癌不同增殖能力细胞株iNOSmRNA表达的影响。方法:采用MTT方法确定结肠癌细胞株CW-2和LS174T的生长增殖状况,用RT-PCR和Northernblot方法检测结肠癌中iNOSmRNA的表达量。结果:MTT生长曲线显示结肠癌细胞株LS174T的生长增殖比CW-2快;RT-PCR显示CW-2细胞株有较强的iNOSmRNA表达,而LS174T细胞株iNOSmRNA的表达较弱;Northernblot检测在CW-2中有明显的iNOSmRNA表达,但在细胞株LS174T中表达相对较弱;ATRA对结肠癌CW-2和LS174T细胞株iNOSmRNA的表达量无明显影响。结论:iNOSmRNA对结肠癌细胞株生长有双重作用,即在低增殖结肠癌CW-2呈高表达,可以通过细胞毒或诱导细胞凋亡等作用发挥抗肿瘤效应;在高增殖结肠癌LS174T呈低表达,产生NO作为信号转导的重要分子,增加血供和血管生成,促进肿瘤生长、侵袭和转移。ATRA可以抑制结肠癌细胞株的生长。     

全反式维甲酸对结肠癌不同增殖潜能细胞株VEGF表达的影响

目的:探讨全反式维甲酸对结肠癌不同增殖潜能细胞株VEGF表达的作用；研究VEGF在结肠癌侵袭和转移中的作用。 方法:采用细胞培养观察、ATRA干预、MTT和FACS方法确定结肠癌细胞株CW-2和LS174T的生长增殖状况，用Northern blotting方法检测结肠癌中VEGF mRNA的表达量，用免疫细胞化学观察细胞VEGF蛋白的表达。 结果:MTT生长曲线显示结肠癌细胞株LS174T的生长增殖比CW-2快;FACS结果显示LS174T细胞的S期细胞较CW-2细胞数多；Northern blotting和免疫细胞化学检测在CW-2中有明显的VEGF表达，但在高增殖细胞株LS174T中VEGF的表达更明显。 结论:VEGF在结肠癌细胞株中有较高的表达。在高增殖结肠癌细胞株VEGF表达更明显。ATRA可能通过抑制VEGF表达，而抑制结肠癌细胞的增生。     

基因Hath1表达对结肠癌细胞的抑制作用

目的研究Hath1基因对结肠癌细胞体外增殖的抑制作用。方法用trizol试剂提取肿瘤细胞总RNA,定量逆转录PCR法检测Hath1在结肠癌细胞和正常组织细胞中的表达;MTS和流式细胞仪法分别检测Hath1在结肠癌细胞中的增殖率和凋亡百分率;构建IEC-6稳定表达Hath1siRNA细胞系,检测Hath1siRNA对IEC-6细胞生长的影响。结果在正常人的小肠与结肠组织及大鼠小肠上皮细胞IEC-6中有着比较高水平的Hath1的表达,而在4株结肠癌细胞中Hath1的表达都很低。在表达Hath1的4株结肠癌细胞SW480、HT29、LS174T、SW620中,其细胞增殖率分别被抑制了38.5%、23.4%、55%、35.6%。在LS174T细胞中Hath1不能有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是可以显著地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。siRNA干扰试验进一步证明了Hath1起到肿瘤抑制基因的作用。结论 Hath1不能有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是可以显著地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。     

反义VEGF165基因转染对人神经母细胞瘤生物学行为的影响

目的探讨反义VEGF165基因转染在抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长中的作用。方法构建正义和反义VEGF165真核表达载体,用脂质体转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,G418筛选稳定表达细胞克隆。应用RT-PCR证实外源性反义VEGF mRNA的表达,免疫细胞化学和EUSA检测VEGF蛋白的表达水平,MTT法检测肿瘤细胞体外生长情况,并接种于裸鼠皮下,观察体内肿瘤增殖能力。结果RT-PCR证实转染反义VEGF的细胞中有外源性反义VEGF mRNA的表达,免疫细胞化学和EUSA显示VEGF蛋白表达明显降低,MTT实验显示转染前后细胞体外生长速度基本一致。而转染反义VEGF的肿瘤细胞裸鼠体内生长速度明显减慢。结论反义VEGF基因转染能够有效抑制SH-SY5Y细胞内源性VEGF蛋白的表达,抑制裸鼠体内肿瘤的生长。     

Ku80分子克隆在人肺癌细胞的表达及生物学意义

目的：研究Ku80基因分子克隆在人肺癌细胞的表达及生物学意义。方法：用分子克隆的方法构建重组的正义,反义Ku80基因表达质粒,导入人肺癌细胞后,用Northern-blotting法和Western-blotting法证明Ku80正义,反义基因在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果：（1）正义或反义Ku80克隆阳性的LCA细胞在mRNA水平均有正义或反义Ku80的表达印迹。（2）仅在正义Ku80克隆阳性的LCA细胞有正义Ku80蛋白表达印迹而反义Ku80克隆阳性的LCA细胞无Ku80蛋白表达印迹,结论：正义或反义Ku80基因的分子克隆可在人肺癌细胞的mRNA得到表达,正义Ku80克隆阳性的LCA细胞有正义Ku80蛋白表达,反义Ku80基因可封闭肿瘤细胞的正义Ku80蛋白的表达,此结论为将Ku基因作为肿瘤靶向基因治疗提供了实验依据。     

FBXO6基因真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的 构建F盒蛋白6(FBXO6)基因真核表达载体.方法 采用PCR方法合成含有EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切位点的FBXO6 cDNA全长.分别构建载体pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6,采用菌落PCR、双酶切鉴定以及测序证实cDNA片段大小和序列正确.将载体pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6分别转染HEK293T细胞,Western blot法检测FBXO6蛋白的表达.结果 pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6包含大小、序列正确的FBXO6片段;FBXO6蛋白在转染pEGFP-C1-FBXO6的293T细胞中高表达;在转染pEGFP-C1-anti-FBXO6的HEK293T细胞中表达降低.结论 成功构建FBXO6基因正义真核表达载体pEGFP-C1-FBXO6和反义真核表达载体pEGFP-C1-anti-FBXO6.     

蓝莓花青素诱导结肠癌LS174T细胞凋亡和抑制其增殖

目的观察蓝莓花青素对结肠癌LS174T细胞增殖的抑制作用及凋亡的诱导及探究蓝莓花青素的抗癌机制。方法体外培养结肠癌LS174T细胞,加入不同浓度的蓝莓花青素(25、50、100和200μg/m L)处理,利用CCK法、Hoechst染色检测不同浓度的蓝莓花青素对LS174T细胞增殖和凋亡的影响;实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测细胞相关凋亡基因P53、CCND3、P73、SFN、caspase-8和FAM200a mRNA的表达;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测细胞caspase-8和P73的表达。结果蓝莓花青素呈时间和剂量依赖性抑制了结肠癌LS174T的增殖(P0.05);蓝莓花青素呈现剂量依赖性诱导癌细胞凋亡;CCND3、P73和SFN mRNA表达水平上调(P0.05),caspase-8、FAM200a和P53 mRNA表达水平下调(P0.05);caspase-8蛋白表达下调,P73蛋白表达上调。结论蓝莓花青素抑制结肠癌ls174t细胞增殖,诱导凋亡与P73蛋白表达上调和caspase-8蛋白表达下调相关。     

抗肿瘤细胞抗原单克隆抗体亲和常数的流式细胞术测定

本文介绍的流式细胞术(Flow Cytometry)测定抗肿瘤细胞抗原单克隆抗体的亲和常数方法是以3倍系列稀释的FITC标记的抗结肠癌(类CEA)单克隆抗体4D_6,直接染色标记结肠癌细胞系LS 174T,通过流式细胞仪FACS 440测定有抗原表达的细胞百分数。按照Michaelis-Menten方程原理,即当抗原为一定量时,逐渐增加抗体浓度,使抗原结合达饱和,然后求出     

抗原特异TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCRV β13-pIRES2-EGFP真核表达载体的构建及共转染研究

目的 构建携带弥漫大B型非霍奇金淋巴瘤(DLBL)相关抗原特异性的TCR Vα和TCR Vβ基因片段的真核表达载体TCR Vα-pIRES2.EGFP和TCR Vβ-plRES2-EGFP,将其共同转染Raji和Jurkat细胞.方法 前期研究从1例DLBL患者外周血T细胞中发现克隆性增殖T细胞受体(TCR)Vα6和Vβ13亚家族T细胞,在此基础上利用RT-PCR扩增TCR Va6和TCR Vβ13基因全长序列后,分别将其定向克隆入带有绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pIRES2-EGFP,酶切和核酸序列测定分析方法鉴定重组质粒TCR Vα6-pIRKS2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP的正确性;利用核转染技术(nueleofector)将其分别或共同转染Raji细胞和Jurkat细胞,24 h后利用激光共聚焦显微镜观察EGFP的瞬时表达情况,48h后利用实时定量PCR检测TCR Vα6和TCR Vβ13基因的表达情况,Western blot检测EGFP蛋白的表达情况.结果 获得来自DLBL患者的TCR Vα6和TCR Vβ13基因全长序列,酶切分析和核酸序列测定证实TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP重组质粒构建正确;转染24 h后,激光共聚焦显微镜下可观察到EGFP的表达,40%以上细胞发出绿色荧光,单独转染和共转染组荧光产生情况相似;实时定量PCR在单独转染和共转染组均町检测到TCR Vα6和TCR Vβ13基因的表达,共转染组2基因的表达水平稍低于单独转染组;Western blot检测在单独转染和共转染组均显示EGFP蛋白的表达,2组的蛋白杂交带强度相似.结论 成功构建了DLBL特异性的TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP真核表达质粒,两者可同时转染到细胞中,并实现了体外共表达.     

小鼠β_2m反义核酸重组荧光蛋白表达载体的构建及表达研究

本研究应用分子生物学技术 ,构建小鼠 β2 m反义核酸重组荧光蛋白表达载体pEGFP β2 mAN ,经过酶切、PCR鉴定 ,以及序列分析证实克隆的正确性。然后用脂质体转染NIH3T3细胞 ,经过RT PCR及Westernblot检测 ,观察重组质粒对细胞β2 mmRNA和蛋白表达的影响 ,同时在荧光显微镜下直接观察细胞转染的结果。结果证明pEGFP β2 mAN已成功导入NIH3T3细胞中 ,且有效表达 ,在荧光显微镜下可见梭形绿色荧光细胞 ;与同步转染的小鼠 β2 m正、反义核酸表达载体pcDNA3 β2 mSN、pcDNA3 β2 mAN的转染结果一起进行分析 ,转染pcDNA3 β2 mSN细胞的 β2 mmRNA和蛋白表达水平升高 ,而转染pcD NA3 β2 mAN和pEGFP β2 mAN的细胞 β2 mmRNA和蛋白表达水平降低。小鼠 β2 m反义核酸重组荧光蛋白表达载体pEGFP β2 mAN的转染结果显示 :它不但可以降低NIH3T3细胞 β2 m基因的表达 ,而且为观察脂质体转染效果提供了直观、即时的方法     

人IL-8正义和反义真核表达载体的构建与表达

目的:构建人IL- 8正义和反义真核表达载体.方法:RT-PCR扩增正义和反义IL- 8基因片段后, 将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+), 通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定后, 采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞中, 并用RT-PCR和ELISA法检测细胞转染后IL- 8的表达水平.结果:经验证, 重组人IL- 8正义/反义真核表达载体构建正确.pcDNA3.1(+)-ssIL- 8转染A2780细胞后, 其IL- 8 mRNA及蛋白表达水平均显著增加;而pcDNA3.1(+)-asIL- 8转染SKOV3细胞后, 其IL- 8分泌水平降低.结论:成功构建了人IL- 8正义/反义真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ssIL- 8/pcDNA3.1(+)-asIL- 8, 为后续研究IL- 8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础.     

非甾体类抗炎药对结肠癌细胞NAG-1 基因表达的诱导

研究非甾体类抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drug,NSAID)对结肠癌细胞生长的影响及NSAID活化基因-1(NAG-1)的诱导作用。体外培养HT-29、SW480及LS174-T三种结肠癌细胞,分别加入不同浓度的aspirin、celecoxib及meloxicam作用于HT-29及SW480细胞,采用MTT法检测结肠癌细胞增殖;蛋白质印迹技术检测三种结肠癌细胞COX-2的表达;采用半定量RT-PCR技术分析NSAID对三种结肠癌细胞NAG-1基因表达的影响。aspirin、celecoxib及meloxicam均能有效抑制体外培养的HT-29、SW480结肠癌细胞生长,并具有良好的量-效关系。Western blot表明,HT-29细胞表达COX-2,而SW480细胞不表达COX-2。三种结肠癌细胞均表达NAG-1基因mRNA,其中LS174-T细胞NAG-1基础水平较低;NSAID能不同程度上调结肠癌细胞NAG-1基因表达。NSAID能有效抑制结肠癌细胞生长,这种作用可能部分通过诱导结肠癌细胞NAG-1基因表达实现,NAG-1基因表达不受肿瘤细胞是否表达COX-2的影响。     

人VMAT_2基因RNA探针制备及其在COS-7细胞中的表达

本研究目的在于制备人 型囊泡单胺转运体 (VMAT2 )基因的反义和正义 RNA探针 ,以检测 VMAT2 基因能否在真核细胞表达。从携带 p GEM-Easy-T-VMAT2 克隆载体中通过限制性酶切反应得到 VMAT2 基因 ,与 p BK-RSV载体重组构建真核表达载体 p BK-RSV-VMAT2 ;分别以 T7和 T3聚合酶制备反义和正义探针 ,通过斑点杂交检测探针浓度。转染猴肾成纤维细胞COS-7,原位杂交及免疫荧光细胞化学检测 VMAT2 的表达。结果证明 ,反义和正义探针浓度分别为 80 ng/μl及 12 0 ng/μl;原位杂交及免疫组织化学证实重组的真核表达载体 p BK-RSV-VMAT2 在 COS-7的表达阳性率为 (10 .6± 1.2 ) %。本研究结果表明获得 VMAT2 基因反义链及正义链 RNA探针 ,并检测到 VMAT2 基因在真核细胞中表达     

重组腺相关病毒转导外源基因入EB病毒转化的B淋巴细胞获长期表达

目的 采用重组腺相关病毒（AAV）载体pAGX( ),把6A8α-甘露糖苷酶基因的正义或反义DNA片段转导入EB病毒转化的B淋巴细胞,以获得正义或反义6A8DNA长期表达的B淋巴细胞株。方法 构建含正义或反义6A8DNA片段的重组pAGX( )质粒,经包装后转导淋巴细胞,经G418筛选,用有限稀释法克隆转导成功的淋巴细胞。Northern杂交和RT-PCR检测转导基因的mRNA表达水平。ConA结合试验检测细胞在转导基因后6A8α-甘露糖苷酶活性的改变,结果 pAGX-反义6A8DNA及pAGX-正义6A8DNA经包装获得了高复制滴度的重组AAV（rAAV)颗粒,藉助rAAV成功地把6A8基因转导入EB病毒转化的B细胞株SKW6和B淋巴样白血病细胞株BJAB。Northern杂交结果显示,转导的正义或反义6A8DNA获得表达,经1年余传代培养,RT-PCR检测见BJAB和SKW6细胞中转导的正义或反义6A8DNA的mRNA表达增加,新霉素抗性基因（neo^R)也获得表达,表明转导基因获得了长期表达,ConA结合强度在转导反义6A8DNA的细胞升高,提示转导反义6A8DNA可影响6A8α-甘露糖苷酶的表达。结论 用AAV载体成功地把6A8α-甘露糖苷酶基因的正义或反义DNA片段转导入EB病毒转化的B淋巴细胞SKW6和B淋巴样白血病细胞株BJAB,转导的基因获得长期表达,并干扰6A8α-甘露糖苷酶的表达。     

粘着斑激酶反义寡核苷酸对平滑肌细胞粘附迁移和凋亡的影响

为研究粘着斑激酶反义寡核苷酸对平滑肌细胞粘附迁移和凋亡的调控作用 ,采用纤粘连蛋白 (fibronectin ,FN)诱导平滑肌细胞 (smoothmusclecells,SMCs)粘附迁移并活化粘着斑激酶 (focaladhesionkinase ,FAK) ,将FAK反义寡核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotides,ODNs)经脂质体转染细胞 ,观察对FAK磷酸化、细胞粘附迁移以及凋亡的影响。结果表明 ,FN在有效地诱导SMCs粘附迁移并活化FAK的同时 ,凋亡细胞数显著低于对照 ,(8 96± 1 2 ) %和(2 3 45± 9 6 ) %。脂质体可有效地介导ODNs转染 ,转染效率为 (86 7± 4 5 ) % ,FAK磷酸化表达量明显减少 ,不同浓度FN组 5～ 6 0mg L ,细胞铺展率减少 17 89%～ 2 7 6 7% ,10、2 0、40和 6 0mg LFN组迁移细胞数也分别显著减少2 3 2 6 %、2 1 6 3%、19 31%、17 88% ,凋亡细胞数比对照高 33 5 7% (P <0 0 5 ) ,也显著高于FN组。据此可以认为FAK活化及其介导的信号转导通路是细胞外基质诱导SMC粘附迁移并抑制其凋亡的重要因素。反义FAKODNs可有效地对此进行调控     

上皮细胞超表达Cox-2时粘附和凋亡的变化

已有研究表明,人结肠直肠癌的cox-2 mRNA和cox-2蛋白水平增高。本实验旨在研究起表达cox-2引起大鼠肠上皮细胞的表型和生化变化。 本实验用RIE-P与转染含正义或反义DNA的cox-2表达载体的肠上皮细胞(RIE-S和RIE-AS)进行实验。结果:①RIE-S细胞表达cox-2蛋白水平增高,对细胞外基质蛋白Matrigd和层粘连蛋白的粘附增加。②RIE-S细胞不能测得钙粘附素(E-cod),