CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选

目的筛选获得高表达人CD59中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表面与人CD59特异性结合的短肽序列,为下一步研究与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供实验依据。方法以离子层析柱纯化的CHO细胞的裂解蛋白纯蛋白为靶分子分别进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,双夹心ELISA方法鉴定噬菌体阳性克隆。提取阳性单克隆单链DNA测序,并推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对CHO细胞纯蛋白有特异性结合力,经测序得到两条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对CHO细胞进行纯蛋白筛选得到了能与人CD59特异性结合的短肽序列。     

通过噬菌体筛选表达人CD59的CHO细胞结合的内化短肽

目的筛选并鉴定与表达人CD59的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞特异结合的内化短肽,为设计具有拮抗CD59肿瘤逃逸活性的短肽药物奠定基础。方法以高表达人CD59的CHO细胞为靶,对噬菌体随机十二肽库进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,用ELISA法筛选噬菌体阳性克隆并对其进行DNA序列分析。结果随机挑选的10个克隆中有6个与人CD59结合力高,测序后得到2个高度同源的氨基酸序列。结论获得了与高表达人CD59的CHO细胞结合的内化短肽序列,为进一步设计与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供了参考依据。     

噬菌体展示肽库筛选大肠癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 筛选人源大肠癌LoVo细胞株特异结合的短肽,作为大肠癌靶向治疗的载体.方法 以大肠癌LoVo细胞株作为靶细胞,人正常结肠黏膜上皮细胞为吸附细胞对噬菌体展示环七肽库进行差减筛选,采用细胞ELISA与免疫荧光检测鉴定噬菌体阳性克隆并测序.结果 对噬菌体展示环七肽库进行3轮筛选后,从随机挑取的20个噬菌体克隆中获得5个能与大肠癌LoVo细胞特异结合,而不与人正常结肠黏膜上皮细胞结合的阳性克隆,其氨基酸序列含有保守序列RPMP.结论 利用噬菌体展示肽库技术,可以成功筛选到大肠癌细胞的特异性结合肽,可能成为大肠癌靶向治疗的载体.     

CCR5膜外一、二襻模拟肽的淘选及其对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的作用

目的:筛选与CC趋化因子受体5(CC chemokine receptor 5,CCR5)第一、二膜外襻特异结合的模拟肽,并将其应用在实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠模型(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE),来观察使用模拟肽后EAE模型小鼠的治疗效果。方法:用噬菌体随机7肽库筛选与CCR5特异结合的多肽序列,用ELISA鉴定其结合活性并进行DNA测序分析;接着合成与其氨基酸序列一致的模拟肽,腹腔内注射至EAE小鼠。取小鼠脊髓组织,通过H-E染色,观察模拟肽组和EAE对照组小鼠脊髓组织病理学改变。结果:随机挑出20个噬菌体克隆进行鉴定,ELISA分析显示其中18个克隆与CCR5有较强的结合活性,将其阳性噬菌体克隆进行测序,从中得到重复率极高的4段小分子肽,它们分别为 STFTTTL(SL)、TPITQLL (TL)、SLPLPKP (SP)、QTSSAAL(QL)。对照组EAE小鼠的平均临床评分为3分,模拟肽组EAE小鼠的平均临床评分为1分。H-E染色后,经病理分析EAE组小鼠的脊髓内有大量的炎症细胞浸润,白质脱髓鞘改变明显。而模拟肽组小鼠有较少的炎症细胞浸润,且没有白质脱髓鞘改变。4段短肽分别具有抑制、延迟发生EAE的作用,其平均抑制率为43%(EAE组为83%,两者比较有统计学差异,P<0.05)。结论:筛选的CCR5模拟肽具有对EAE明显的抑制作用,提示CCR5可能在EAE的发病进程中发挥着重要的作用。     

噬菌体随机肽库对肝癌细胞特异性结合短肽的筛选及鉴定

目的:通过噬菌体随机肽库,筛选人肝癌细胞结合短肽,并对其与肝癌细胞的特异结合能力进行生物学鉴定.方法:以L-02为阴性消减细胞,HepG2为靶细胞,对噬菌体随机七肽库进行4轮消减筛选.并随机挑取26个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.以ELISA法鉴定噬菌体与HepG2细胞的结合活性.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定H3噬菌体克隆与肝癌细胞结合的特异性.人工合成短肽HBP3,利用免疫荧光技术观察其与肝癌细胞的结合特异性.结果:4轮筛选使噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集.所挑取的26个阳性噬菌斑,经测序得到各噬菌体单克隆的多肽插入序列,最终产生5条氨基酸序列.经BLAST分析发现,在蛋白质数据库中未发现与这些短肽序列具有较好同源性的蛋白质分子.ELISA分析鉴定显示,5个阳性克隆在HepG2和L-02细胞上有差异性结合,其中H3噬菌体克隆对两种细胞的结合差异性最大.免疫细胞化学染色及免疫组织化学染色均显示,H3噬菌体克隆对肝癌细胞的结合靶向性明显高于对照细胞.免疫荧光显色证实,FITC-HBP3能特异性地结合于肝癌细胞的胞膜及核周胞质.结论:H3噬菌体克隆所呈现的七肽HBP3能与靶细胞高亲合性结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的 通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定.方法 建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力.结果 成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPACl受体结合.结论 通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽.     

噬菌体随机肽库中与受损内皮细胞特异性结合短肽的筛选

目的　筛选与受损内皮细胞特异性结合的短肽。方法　以氧化型低密度脂蛋白 (oxidizedlowdensitylipoprotein ,ox -LDL)损伤牛胸主动脉内皮细胞 ,用丝状噬菌体 (FUSE5 )表面展示的随机 6肽和 15肽文库进行混合筛选 ,通过DNA序列测定确定其插入的氨基酸序列。结果　经过 3轮筛选 ,得到一些特异性结合的噬菌体克隆 ,随机挑选 10个克隆 ,进行DNA序列分析 ,其中 8个克隆含 6肽序列 ,2个克隆含 15肽序列。结论　用噬菌体技术能筛到与受损内皮细胞亲和力高、结合力强的特异性短肽     

抗大肠杆菌LPS多克隆抗体的制备与LPS模拟肽的筛选

目的获得抗大肠杆菌脂多糖(LPS)多克隆抗体与模拟LPS表位的线性噬菌体展示肽克隆。方法制备兔抗鼠大肠杆菌抗血清,鉴定抗血清效价。以亲和纯化的多克隆抗体为靶,筛选噬菌体随机线性十二肽库。双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆。结果兔抗血清能与大肠杆菌LPS反应。用亲和层析纯化的多克隆抗体为靶分子进行三轮筛选,随机挑选17个克隆,其中6个克隆显示与多抗结合。大肠杆菌LPS可抑制阳性噬菌体克隆与多抗结合,所有克隆的IC50(达到50%抑制率的LPS浓度)为250ng/ml。结论获得能与大肠杆菌LPS反应兔多克隆抗体,筛选得到可模拟大肠杆菌LPS表位的噬菌体展示线性十二肽。     

利用噬菌体肽库筛选可结合TNF—α的短肽序列

目的 对噬菌体环七肽库进行筛选。寻求可拮抗肿瘤坏死因子a(TNF-α）活性的小分子短肽。方法 以rhTNF-α为靶筛选噬菌体环七肽库，双夹心ELISA鉴定阳性克隆。结果 ELISA鉴定随机挑选经3轮筛选后所得23个噬菌体克隆发现，其中11个克隆显示与TNF-α有较强的结合，DNA测序发现其中两个克隆的氨基酸序列为：c-ALWHWWH-c,另9个克隆序列为：c-(T/S)WLHWWA-c。结论 噬菌体克隆展示肽能够模拟TNF-α受体或抗体的结合表位，为TNFα结合肽。     

随机十肽库的构建及血管形成素结合肽的筛选

将合成的含有随机序列 (NNK) 1 0 的寡核苷酸片段 ,克隆入噬菌体呈现载体噬菌粒 p CANTAB5 E的 Sfi ,N ot 位点 ,即 cp 蛋白信号肽与成熟肽之间 ,电转化 E.coli TG1,构建了噬菌体表面呈现的十肽库 ,实际库容为 3.5 3× 10 7,插入率为 6 6 .7% .经辅助噬菌体 M13KO7超感染后 ,获得滴度为 4.8× 10 1 1 pfu/ m l的噬菌体上清 .经过两轮 panning筛选和富集 ,从构建的随机十肽库中筛选到 2 6个具有血管形成素结合活性的重组噬菌体克隆 ,对其中 12个阳性噬菌体克隆的短肽序列进行了分析 ,EL ISA检测结果显示 12个阳性噬菌体克隆都能够…     

可结合细胞表面IL-2Rα的短肽分子的筛选

目的利用噬菌体肽库技术筛选可特异性结合IL-2Rα的短肽序列，探索获得IL-2Rα小分子拮抗剂的可能性。方法以高表达IL-2Rα的MT-2细胞为钓饵。筛选噬菌体线性12肽库。用抗IL-2Rα单克隆抗体竞争洗脱结合的噬菌体，细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆，并测序。结果随机挑选的17个克隆中有7个可与MT-2细胞结合。免疫组化显示阳性噬菌体克隆M15可与MT-2细胞及PHA刺激的PBMC结合。根据阳性克隆DNA序列，推导出氨基酸序列，共有6种序列，富含亲水氨基酸并包含Tyr、Phe、Leu保守残基。结论得到含Tyr、Phe保守残基的序列，阳性序列可结合细胞表面的IL-2Rα。     

噬菌体随机肽库筛选抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶单抗2A5的识别表位

目的利用噬菌体随机肽库技术筛选恶性疟原虫乳酸脱氢酶(pfLOH)抗体2A5的识别表位。方法以抗pfLDH的单抗2A5筛选噬菌体随机12肽库,挑取阳性克隆测定DNA序列,推导其氨基酸序列并进行同源性分析。通过ELISA、竞争抑制试验鉴定获得的噬菌体短肽与单抗2A5之间的结合特性。结果从噬菌体随机12肽库中筛选出21株可与2A5单抗特异结合的噬菌体克隆,其中多数克隆呈现核心序列SQK(R)L,该序列与pfLDH的一级序列具有一定同源性。竞争抑制实验显示,带有核心序列的噬菌体克隆可与pfLDH竞争结合单抗2A5。结论 SQK(R)L是pfLDH单抗2A5特异识别的表位。     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的：获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽，作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法：以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞，成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选，用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：经三轮筛选，从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个特异性与骨肉瘤细胞os-732结合，而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论：得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆，提示骨肉瘤细胞表面结构复杂，具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性，为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

天花粉蛋白结合肽的筛选及潜在靶点蛋白的同源分析

目的 通过噬菌体展示技术,筛选天花粉蛋白(TCS)的结合多肽,并通过蛋白质同源分析,研究TCS在体内可能直接作用的靶点蛋白。方法 用构建的十五肽库和购买的十二肽库分别对TCS进行4轮固相亲和筛选,并通过噬菌体ELISA检验阳性克隆与靶蛋白的亲和力,对阳性克隆进行测序,并将多肽序列与已登记蛋白序列进行同源性分析。结果 每轮筛选的回收率,及多克隆噬菌体ELISA结果显示筛选有效。通过单克隆噬菌体ELISA结果挑取阳性克隆,测序分析得到若干噬菌体展示多肽序列。经蛋白质同源性分析,TCS特异性结合多肽与蛋白激酶C（PKC）的磷酸化位点具有同源序列。结论 噬菌体展示技术是筛选中药成分靶点蛋白的有效手段,PKC可能为TCS潜在的靶点蛋白。