牙龈卟啉菌特异基因片段的体外扩增和鉴定

Ｐｇ与口腔感染性疾病关系密切．现根据Ｐｇ特异的菌毛亚单位蛋白结构基因设计寡聚核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术扩增了其中长５４２ｂｐ的片段并对其进行了特异性鉴定。结果表明：所设计的引物能从５株Ｐｇ菌中扩增出大小一致的特异ＤＮＡ片段，但不能从其它１８株异种菌中扩增出产物，故具有高度的种特异性．其检测的敏感性为０．ｌｎｇ，为ＰＣＲ应用于口腔致病菌的检测奠定了基础。     

基因重组乳链球菌防龋疫苗的研究 Ⅲ．乳链球菌重组质粒DNA的Southern印迹和点印迹杂交分析

为了证实重组质粒ＤＮＡ分子中插入的外源ＤＮＡ确是来自变形链球菌拱体菌，检测受体菌中是否有探针同源的序列。本研究采用ＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交、点印迹杂交和切口平移制备生物素ＤＮＡ探针以及光敏基因检测技术，对乳链球菌ＨＬ１０２，ＨＬ１０７中的重组质粒ＤＮＡｐＬＦ１０２，ｐＬＦ１０７作了进一步分析鉴定，ＤＮＡ点印迹杂交结果显示，含有ｐａｃ基因的ｐＰＣ４１ＰｓｔⅠ酶切ＤＮＡ探针均与上述质粒ＤＮＡ结合，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交提示重组质粒１．５ｋｂ的酶切片段与生物素探针杂交，证实该基因片段是从ｐＰＣ４１中获得的变形链球菌目的基因片段，重组乳链球菌ＨＬ１０２，ＨＬ１０７均携带变形链球菌表面蛋白抗原（ＰＡｃ）结构基因ｐａｃ。     

多聚酶链反应检测牙龈卟啉单胞菌

近年来，随着Ｐｇ菌分子生物学研究工作的深入，已有Ｐｇ菌纤毛基因得以分离并测序。本文根据Ｐｇ菌特异的纤毛亚单位旦白结构基因设计寡苷酸引物，采用ＰＣＲ技术增了其中１３１ｂｐ的片段，并对其进行特异性鉴定。     

质粒pBR322介导的变形链球菌染色体DNA基因转化研究

本实验利用质粒ｐＢＲ３２２为克隆载体，成功地进行了变形链球蓖基因片段的转化，探索出了一套简便的分子克隆方法，本方法能可靠地将变形链球菌的ＤＮＡ片段转入大肠杆菌ＴＧ１中，阳性菌株中的重组质粒（携有变形链球菌基因片段）可随细菌的增殖而稳定地传代。通过该实验，我们已获得少量的变链菌基因库。     

小鼠牙本质磷蛋白cDNA的克隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠牙本质磷蛋白（ＤＰＰ）ｃＤＮＡ。方法：用异硫氰酸胍一步法从小鼠牙胚组织中抽提总ＲＮＡ，用ｏｌｉｇｏ（ｄｔ） 作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ，然后利用ＰＣＲ 方法，从ｃＤＮＡ 中扩增出小鼠ＤＰＰｃＤＮＡ基因片段（ 约１ ．６ｋｂ），将所得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ 质粒载体，转化到大肠杆菌ＸＬ１ － Ｂｌｕｅ 后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠ＤＰＰｃＤＮＡ 基因片段。     

小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区cDNA克隆

克隆小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区基因。方法：设计引物，以小鼠牙胚ｃＤＮＡ文库为模板，利用ＰＣＲ方法，扩增出小鼠釉丛蛋白成熟区的基因片段，将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体，转化到大肠杆菌ＸＬ－１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定性克隆。结果：重组质粒ｐＢＳ－ｔｕｆｔｅｌｉｎ的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠釉丛蛋白成熟编码区基因     

人牙本质基质蛋白1 cDNA序列的克隆

目的：克隆人牙本质基质蛋白１（ＤＭＰ１）成熟肽编码区基因片段。方法：用异硫氰酸胍一步法从引产胎儿牙乳头组织中抽提总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙乳头ｃＤＮＡ，然后利用ＰＣＲ方法，从ｃＤＮＡ中扩增出人ＤＭＰ１成熟区的基因片段（约１．８ｋｂｐ），将所得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒载体，转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到人ＤＭＰ１成熟肽编码区基因片段。     

小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA 隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠牙本质涎蛋白（ＤＳＰ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨睡胚组织中抽提总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ，然后利用ＰＣＲ方法，从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰ成熟区的基因片段（约１．４ｋｂｐ），将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体，转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果     

小鼠釉原蛋白成熟肽编码区cDNA的克隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠釉原蛋白（ＡＭＧ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ，然后利用ＰＣＲ方法，从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠釉原蛋白成熟区的基因片段（约６７０ｂｐ），将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体，转化到大肠杆菌ＤＨ５α后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＢＳ－ＡＭＧ的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠釉原蛋白成熟肽编码区基因。     

含变链菌PAc蛋白编码基因保守区重组质粒pCIA-P的亚克隆构建

人类致龋菌变形链球菌 (Ｓ .ｍｕｔａｎｓ)的一种表面蛋白ＰＡｃ ,由于参与介导细菌对牙面的粘附而被视作Ｓ .ｍｕｔａｎｓ的重要毒力因子 ,因此成为研制防龋疫苗的主要备选抗原。我们选择ｐａｃ基因中编码ＰＡｃ主要免疫活性区域的ＤＮＡ序列 ,制备出待表达ＤＮＡ片段 ,经亚克隆至ｐＧＥＭ Ｔ质粒后 ,再克隆到高效哺乳动物表达质粒ｐＣＩ中构建成含ｐａｃ基因重要抗原决定簇编码区域的重组质粒 ,从而为防龋ＤＮＡ疫苗的免疫实验研究完成了重要准备。一、材料和方法1.目的片段的体外扩增 :从ｐａｃ基因中选定包含两个主要免疫活性区 (Ａ区及…     

牙龈卟啉菌核酸探针的制备,鉴定

根据Pg的特异的fimA基因设计一对引物,采用PCR技术扩增其中542bp长的DNA片段,用~(32)P标记作为探针与25株细菌DNA进行杂交鉴定.结果显示该探针能识别5株同种菌,而与其它20株异种菌DNA无阳性信号出现,探针的敏感性达到微微克级.提示该探针具有特异、敏感、快速、简便的特性.适用于对Pg的检测.     

牙龈卟啉菌蛋白酶基因rgpA与rgpB蛋白酶区的克隆和表达

目的克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)rgpA、rgpB蛋白酶区,构建rgpA、rgpB蛋白酶区原核表达系统。方法采用聚合酶链式反应(PCR)从PgATCC33277菌株中扩增rgpA、rgpB蛋白酶区,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET42a的rgpA/rgpB蛋白酶区表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导其表达。结果所克隆的PgATCC33277菌株rgpA、rgpB基因蛋白酶区的核苷酸序列与报道的相应核苷酸序列同源性分别为98.9%、99.0%,氨基酸序列同源性分别高达99.2%、99.1%。pET42a-rgpA/rgpB-E.coli BL21DE3系统的蛋白表达量为细菌总蛋白的60%左右。结论本研究成功地构建PgrgpA、rgpB蛋白酶区高效表达系统,为测定RgpA、RgpB免疫原性及作用提供前提。     

c血清型变形链球菌致龋相关基因/DNA片段的批量克隆与高通量筛选

目的筛选含致龋相关基因／DNA片段的阳性克隆，为探究变形链球茵致龋的分子机制奠定基础。方法将抑制消减杂交方法获得的高毒力株特异的消减PCR产物与T／A栽体pCR2．1连接，将连接产物转化E．coli TOP0F’感受态细胞，进行蓝白筛选。对96个转化子进行Colony PCR，将PCR产物点样于同一尼龙膜上，分别与地高辛标记的变形链球茵高、低毒力株基因组DNA／AluI酶切产物杂交，高通量筛选阳性克隆。结果随机挑取了96个白色或白色中央有蓝色的茵落，经过Colony PCR，其中有1个转化子的扩增产物为双带，其余均为0．2～2kb之间的单一条带。经过杂交，以与高毒力株基因组有杂交信号，而与低毒力株基因组无杂交信号或信号明显弱的转化子为阳性克隆。筛选的阳性率为50％左右，阳性克隆中含有c血清型变形链球茵致龋相关的基因／片段。结论对抑制消减杂交方法获得的变形链球茵高毒力株特异的消减PCR产物进行批量克隆和高通量筛选，获得了致龋相关的基因／DNA片段。     

c血清型变形链球菌抑龋相关基因/DNA片段的高通量筛选

目的　筛选含抑龋相关基因 /DNA片段的阳性克隆 ,为探究变形链球菌高、低毒力株致龋能力的差异奠定基础。方法　将抑制消减杂交方法获得的低毒力株特异的消减PCR产物与T/A载体pCR2 .1连接 ,将连接产物转化E .coliTOP10F′感受态细胞 ,进行蓝白筛选。对 96个转化子进行ClonyPCR ,将PCR产物点样于同一尼龙膜上 ,分别与地高辛标记的变形链球菌高、低毒力株基因组DNA -AluI酶切产物杂交 ,高通量筛选阳性克隆。结果　随机挑取了 96个白色或白色中央有蓝色的菌落 ,经过ClonyPCR ,其中有 4个转化子的扩增产物为双带 ,其余均为 0 .2～ 2 .0kb之间的单一条带 ,由原转化平板上另外挑取 4个白色菌落替代 ,其中 1个未扩增出产物。经过杂交 ,以与低毒力株基因组有杂交信号 ,而与高毒力株基因组无杂交信号或信号明显弱的转化子为阳性克隆 ,筛选的阳性率为 5 0 %左右 ,阳性克隆中含有c血清型变形链球菌抑龋相关的基因 /片段。结论　对抑制消减杂交方法获得的变形链球菌低毒力株特异的消减PCR产物进行高通量筛选 ,获得了抑龋相关基因 /DNA片段     

牙龈卟啉单胞菌血凝素2基因缺陷型突变株的构建

目的 构建牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)血凝素2(hemagglutinin-adhesin 2,HA-2)基因缺陷型突变株,为研究HA-2基因功能奠定基础.方法 PCR扩增PgHA-2基因两翼片段HA_u、HA_1,将抗性基因ermF-ermAM连接到两者之间构建打靶载体HA-ermF-ermAM.将HA-ermF-ermAM电转化PgATCC33277,基因同源重组整合进入PgATCC33277染色体,用选择性培养基筛选获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株.进行PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株与其野生株凝血功能试验,比较二者的凝血功能差异.结果 PCR、酶切和测序鉴定结果表明,打靶载体HA-ermF-ermAM成功构建.经PCR鉴定,打靶载体HA-ermF-ermAM通过同源重组整合进入PgATCC33277染色体,成功获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株.凝血实验结果表明,PsATCC33277HA-2基因缺陷型突变株与野生株相比凝血能力明显减弱.结论 成功获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株,为进一步研究HA-2的生物学性质奠定了基础.     

Amplification, clone and identification of the specific fragments of tumor metastasis-suppressor gene nm23-H1 and nm23-H2]

A series of DNA primers specific for the specific fragments of nm23-H1 and nm23-H2 were designed and synthesized. The specific fragments of nm23-H1(185 bp) and nm23-H2(145 bp) were amplified from human blood DNA by using polymerase chain reaction (PCR). The recovered PCR products were treated with Klenow fragment, inserted into pGEM-3zf(+) vector with blunt-end ligation, and then transformed into competent cell JM109. The positive colonies were directly identified by colour screening on indicator plates. The recombinant plasmids were digested by Alu I and identified by PCR. The results showed that the authors had obtained the specific fragments of nm23-H1 and nm23-H2 respectively, and these specific fragments could be used for study the expression of nm23-H1 and nm23-H2 seperately.     

应用16S rDNA结合膜芯片检测3种产黑色素牙周可疑致病菌

目的:探讨采用16SrDNA结合膜芯片检测牙龈卟啉菌Pg、中间普氏菌Pi和变黑普氏菌Pn的价值。方法:利用Genebank中细菌16SrDNA保守区序列,设计一对通用引物,通过已知Pg、Pi和Pn的16SrDNA序列,设计合成对应的特异性寡核苷酸探针。先用通用引物PCR扩增所有标准菌株的DNA,PCR产物和已点样有Pg、Pi和Pn的3种探针的膜芯片杂交,进行分析。结果:膜芯片上的Pg、Pi和Pn3种探针只能与相对应的Pg、Pi和Pn的PCR产物反应,而与其他标准菌株的PCR产物无反应。结论:用16SrDNA结合膜芯片,可准确检测Pg、Pi和Pn,具有很高的特异性,有望成为一种有效的临床检测方法。     

牙龈卟啉菌rRNA基因间隔区的序列测定

目的通过rRNA基因间隔区碱基序列测定，建立对牙龈卟啉菌(Pg)菌株进行鉴定的技术。方法利用种特异性引物对Pg rRNA基因间隔区进行套式PCR扩增，用glass-milk纯化PCR扩增产物，对纯化的扩增产物进行碱基序列测定。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示，Pg rRNA基因间隔区PCR扩增产物为0．88kb，经放射活性测序反应技术测得Pg rRNA基因间隔区的碱基序列。结论rRNA基因间隔区DNA扩增后进行测序，对Pg菌株鉴定是一种精确、重复性好的分子遗传学方法。     

牙周致病菌密度感应信号系统luxS基因的检测

目的 检测牙周可疑致病菌密度感应信号系统luxS基因,了解其在牙周致病菌中的分布.方法 选取牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌的模式株、参考株及临床分离株作为研究对象,提取DNA,通过聚合酶链反应(PCR)、电泳鉴定和DNA测序,并利用GenBank数据库的Blast检测以上细菌luxS基因的存在情况.结果 电泳鉴定存在目的 条带,测序和Blast检测表明牙龈卟啉单胞菌PCR产物与目的 基因有高度一致性(均为99%以上),具核梭杆菌测序结果 与GenBank数据库的基因相同,伴放线放线杆菌电泳鉴定结果 显示存在目的 条带(750 bp),与参考条带大小一致.结论 本实验引物设计合理,能较好地扩增出牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线放线杆菌各实验菌株的luxS基因,为进一步研究luxS基因的功能奠定了基础.