靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默

目的 设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法 应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体p GLV3-GFP中,构建p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果 测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109TU/ml,p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论 成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。     

慢病毒载体介导的Nrf2表达下调对肝星状细胞生物学行为的影响

目的观察重组慢病毒载体介导Nrf2表达下调对肝星状细胞生物学行为的影响,同时探讨其可能的作用机制。方法利用重组DNA技术将特异性shRNA序列插入慢病毒表达载体pGLV3.GFP中,形成pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA,将其转染至293T细胞中,随后进行病毒包装、滴度测定、转染率计算。采用实时荧光定量、Western blot测定转染肝星状细胞株(HSC-T6细胞)Nrt2 mRNA及蛋白的表达情况,利用Tunel染色法检测HSC-T6细胞的凋亡情况,同时对HSC-T6细胞中PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax蛋白水平进行测定。结果构建的重组病毒载体LV3-H1-GFP-shRNA可有效感染293T细胞。激光共聚焦显示空白组细胞凋亡率低于A组和B组,与A组比较,B组的细胞凋亡率降低(P0.05)。实时荧光定量PCR法结果显示空白组Nrf2 mRNA水平高于A组和B组(P0.05),与A组比较,B组mRNA水平升高(P0.05)。Western blot法显示空白组Nrf2蛋白水平高于A组和B组(P0.05),与A组比较,B组蛋白水平升高(P0.05)。与空白组相比,A组和B组PI3K、p-Akt、p-bad、Bcl-2的蛋白表达量增加(P0.05),Bax蛋白减少(P0.05),其中A组PI3K、p-Akt、p-Bad、Bcl-2的蛋白水平较B组增加(P0.05),Bax蛋白水平低于B组(P0.05)。结论 Nrf2基因的shRNA慢病毒载体pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA在体外可抑制肝星状细胞活化,其作用机制可能与通过抑制PI3K-Akt通路促肝星状细胞凋亡有关。     

GPC3基因重组慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含有GPC3的shRNA序列慢病毒表达载体并转染肝癌细胞,观察其转染效率及在肝癌细胞中的表达.方法 应用重组DNA技术,将设计好的GPC3基因特异性siRNA序列构建至慢病毒表达载体pGLV3-GFP上,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定.采用RT-PCR及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染HepG2细胞后GPC3基因的表达情况.结果 慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×108TU/mL,转染后,GPC3基因表达明显降低.结论 成功构建GPC3基因的shRNA慢病毒载体,所介导的RNAi能有效抑制靶细胞中GPC3基因的表达.     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒。方法利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hH1neo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定。重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定。结果酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3。实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2mRNA和蛋白表达(P<0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率>80%。结论构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础。     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的 构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒.方法 利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hHlneo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定.重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定.结果 酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3.实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2 mRNA和蛋白表达(P＜0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率＞80%.结论 构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达.实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础.     

靶向bcl-2基因的shRNA对肝星状细胞凋亡的影响

目的研究短发夹RNA(shRNA)重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞(HSCs)bcl-2基因的表达,观察其对HSCs凋亡的影响。方法重组质粒载体pGPU6-GFP-shRNA由脂质体介导转染HSC-T6细胞株。荧光定量PCR和Western blotting鉴定bcl-2表达;CCK-8法观察质粒转染对HSCs生长和增殖的影响;Hoechst 33258染色观察细胞形态学改变;流式细胞术及caspase-3和caspase-9酶活性检测分析转染后细胞凋亡情况。结果pGPU6-GFP-shRNA能抑制bcl-2 mRNA和蛋白表达;转染后HSC-T6体外生长明显受到抑制;转染后72 h时细胞凋亡率为33.34%,caspase-3和caspase-9酶活性显著增高。结论shRNA重组载体pGPU6-GFP-shRNA能有效地抑制HSC-T6中bcl-2的表达,抑制细胞生长并促进凋亡。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗提供了实验依据。     

靶向bcl-2基因的shRNA对肝星状细胞凋亡的影响

目的 研究短发夹RNA(shRNA)重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞(HSCs)bcl-2基因的表达,观察其对HSCs凋亡的影响.方法 重组质粒载体pGPU6-GFP-shRNA由脂质体介导转染HSC-T6细胞株.荧光定量PCR和Western blotting鉴定bcl-2表达;CCK-8法观察质粒转染对HSCa生长和增殖的影响;Hoechst 33258染色观察细胞形态学改变;流式细胞术及caspase-3和caspase-9酶活性检测分析转染后细胞凋亡情况.结果 pGPU6-GFP-shRNA能抑制bcl-2 mRNA和蛋白表达;转染后HSC-T6体外生长明显受到抑制;转染后72 h时细胞凋亡率为33.34%,caspase-3和caspase-9酶活性显著增高.结论 shRNA重组载体pGPU6-GFP-shRNA能有效地抑制HSC-T6中bcl-2的表达,抑制细胞生长并促进凋亡.实验为进一步探索肝纤维化基因治疗提供了实验依据.     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础.方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒.慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度.将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL.重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达.BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达.     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础。方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒。慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度。将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL。重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达。BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P<0.05）。结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达。     

构建过表达/干扰多梳蛋白2的人胶质瘤细胞系

目的 构建过表达/干扰多梳蛋白2(polycomb-like 2,PCL2)基因重组慢病毒并稳转胶质瘤U251细胞系。方法 过表达PCL2重组慢病毒载体pLVX-hPCL2-3flag-ZsGreen-Puro和干扰PCL2重组慢病毒载体pLVXshRNA2-Puro-hPCL2通过克隆技术成功构建,在293T细胞中导入质粒载体完成慢病毒包装,经过干预HEK293获得转染效率,病毒滴度采用逐孔稀释梯度法测得。将构建好的hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒转染胶质瘤U251细胞,倒置显微镜下观察荧光强度及范围,Western blot检测PCL2蛋白的表达情况。结果 成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒载体,Western blot结果显示,相比对照组和空载组,目的蛋白在转染过表达PCL2重组慢病毒U251细胞中表达明显升高,在转染干扰PCL2重组慢病毒U251细胞中表达降低（P均<0.05）。结论 成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒的U251细胞系。     

干扰Nrf2可增强Hirsutanols A对肿瘤细胞增殖的抑制作用

目的探讨干扰Nrf2对HirsutanolsA抑制人结肠癌细胞SW480、肝癌细胞HepG2细胞增殖的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测不同浓度Hirsutanols A对细胞增殖抑制作用。流式细胞仪检测细胞内ROS的含量;Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡;Western blot检测siRNA干扰NRF2蛋白表达的效果。结果 HirsutanolsA(1.25、2.5、5、10、20和40μmol/L)对SW480、HepG2细胞增殖有明显的抑制作用,并呈现剂量依赖关系;Hirsutanols A处理SW480(15μmol/L)、HepG2(30μmol/L)细胞后,诱导细胞中过氧化氢迅速增加,并引起细胞凋亡,用自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)预处理完全抑制HirsutanolsA诱导的ROS增加及细胞凋亡。siRNA有效地干扰Nrf2表达后可极大增强Hirsutanols A对肿瘤细胞的增殖抑制作用。结论Hirsutanols A通过增加细胞内ROS诱导其凋亡同时激活Nrf2,Nrf2在维持细胞氧化还原稳态中起重要作用,干扰其表达可增强Hirsutanols A的凋亡诱导作用。     

ACE2基因通过调控Nrf2/HO-1通路改善肾缺血再灌注损伤

目的 探讨血管紧张素转化酶2(ACE2)对缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞HK-2氧化应激、炎症、凋亡及核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号通路的影响。 方法 将ACE2慢病毒转染HK-2细胞,按照实验需要分为常氧组(Control组)、缺氧复氧模型组(H/R组)、缺氧复氧转染阴性对照慢病毒组(H/R-NC组)和缺氧复氧转染ACE2慢病毒组(H/R-ACE2组)。细胞经H/R处理后,通过CCK-8法检测细胞活力;RT-PCR及ELISA法检测炎症因子白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平;比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)表达水平;Western blotting法检测胱天蛋白酶3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)、Nrf2、HO-1的蛋白水平。采用Nrf2抑制剂ML385以及HO-1抑制剂SnPPIX抑制Nrf2/HO-1通路,Western blotting法检测Caspase-3、Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1的蛋白表达水平变化,比色法检测SOD和MDA表达变化。 结果 与Control组相比,H/R组细胞活力降低(t=7.58,P<0.001),MDA含量和炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β表达水平以及细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax蛋白水平均增加(t_MDA=11.08,P_MDA<0.001;t_PCR-IL-6=5.82,P_PCR-IL6<0.001;t_PCR-TNF-α=7.69,P_PCR-TNF-α<0.001;t_PCR-IL-1β=4.80,P_PCR-IL-1β=0.001;t_ELISA-IL-6=34.11,P_ELISA-IL-6<0.001;t_ELISA-TNF-α=14.12,P_ELISA-TNF-α<0.001;t_ELISA-IL-1β=9.63,P_ELISA-IL-1β<0.001;t_Caspase-3=2.73,P_Caspase-3=0.026;t_Bax=27.75,P_Bax<0.001),SOD活性、Bcl-2和ACE2蛋白水平下降(t_SOD=7.74,P_SOD<0.001;t_Bcl-2=75.49,P_Bcl-2<0.001;t_ACE2=11.41,P_ACE2<0.001)。与H/R组相比,H/R-ACE2组细胞活力增加(t=3.61,P=0.002),MDA含量和炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β表达水平以及细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax蛋白水平均下降(t_MDA=6.15,P_MDA<0.001;t_PCR-IL-6=3.34,P_PCR-IL-6=0.006;t_PCR-TNF-α=3.65,P_PCR-TNF-α=0.007;t_PCR-IL-1β=4.06,P_PCR-IL-1β=0.004;t_ELISA-IL-6=14.62,P_ELISA-IL-6<0.001;t_ELISA-TNF-α=10.42,P_ELISA-TNF-α<0.001;t_ELISA-IL-1β=8.65,P_ELISA-IL-1β<0.001;t_Caspase-3=3.74,P_Caspase-3=0.006;t_Bax=30.52,P_Bax<0.001),SOD活性、Bcl-2和ACE2蛋白水平增加(t_SOD=3.58,P_SOD=0.007;t_Bcl-2=63.86,P_Bcl-2<0.001;t_ACE2=58.72,P_ACE2<0.001),Nrf2/HO-1信号通路被激活蛋白水平增加(t_Nrf2=44.55,P_Nrf2<0.001;t_HO-1=14.19,P_HO-1<0.001)。然而ML385和SnPPIX处理会抑制ACE2基因过表达在H/R中HK-2细胞的保护作用(F_Bax=11.02,P_Bax=0.003;F_Bcl-2=21.48,P_Bcl-2<0.001;F_Caspase-3=20.80,P_Caspase-3<0.001;F_SOD=133.49,P_SOD<0.001;F_MDA=14.06,P_MDA=0.001)。 结论 ACE2在HK-2细胞缺氧复氧损伤中具有抑制氧化应激、调节炎症、改善凋亡的作用,Nrf2/HO-1信号通路发挥重要作用。     

Nrf2在多器官保护中的作用研究进展

细胞需要面对包含活性氧族和亲电子剂等多种微环境损害，它们通过多种机制应对有毒或致癌物质的损伤。其中最重要的细胞防御机制是通过转录因子Nrf2（nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2）调节的。大量的研究均证实，Nrf2能够抵御广谱的毒性物质和致病原对细胞的损伤。Nrf2介导的细胞保护反应无细胞特异性和器官特异性，Nrf2可保护肺脏、肝脏、消化道、神经系统和心血管系统等多种器官或组织。因此，Nrf2在多器官保护中具有巨大的治疗潜力。     

Nrf2-ARE通路抑制作用研究展望

转录因子红细胞系-2p45(NF-E2)相关因子-2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)通过上调解毒酶和抗氧化酶基因的表达,为人体提供防御系统.然而,Nrf2表达过高,不但对肿瘤形成和生长起促进作用,而且可增强肿瘤细胞的耐药性.     

抑制Keap1基因对染砷HaCaT细胞Nrf2通路的影响

目的观察无机砷混合物对Keap1抑制HaCaT细胞的活力及形态变化,探讨Keap1抑制及染砷对Nrf2通路相关基因表达的影响,探究砷致皮肤早期氧化损伤的机制。方法培养正常与Keap1抑制HaCaT细胞,将无机砷混合受试物按照LC50的1/100、1/50、1/10分为低、中、高3个不同浓度组,即为2.90μmol/L、5.80μmol/L、29.00μmol/L,以0μmol/L无机砷混合受试物染毒Keap1抑制HaCaT细胞组为阴性对照组,正常细胞组为空白对照组,于4个时间点(8、24、48、72 h)采用MTT法检测细胞活力,使用实时荧光定量PCR检测Nrf2通路相关基因(Nrf2、Keap1、Bach1及CBP)mRNA表达。结果随染砷浓度增加,细胞收缩明显,边缘多不规则,脱壁明显。2.90μmol/L混合砷染毒促进细胞增殖,≥5.80μmol/L混合无机砷染毒抑制细胞增殖。与空白对照组比较,阴性组Nrf2通路相关基因(Bach1,CBP)随时间延长,基因表达持续升高,差异均有统计学意义(F=200.261,P0.05)。与阴性组比较,2.90μmol/L染砷组24、48 h时Nrf2基因表达无差异;Bach1、CBP基因表达均上调,差异均有统计学意义(F=29.015、43.964,P0.01)。5.80μmol/L染砷组24 h时Nrf2基因表达无差异,Bach1、CBP基因表达均上调;48、72 h时Nrf2、Bach1、CBP基因表达均下调,差异均有统计学意义(F=5.289、29.015、43.964,P0.01)。29.00μmol/L染砷组24、48 h时Nrf2、Bach1、CBP基因表达均上调;72 h时Nrf2、Bach1、CBP基因表达均下调,差异有统计学意义(F=34.275,P0.01)。经两两比较,72 h时随染砷浓度逐渐增加,Nrf2、Bach1、CBP基因表达逐渐下调,差异均有统计学意义(P0.05)。结论抑制Keap1基因会引起Nrf2持续激活。Bach1和CBP协同调控Nrf2通路可能在砷致氧化应激反应中起调节作用。     

Nrf2在缺血性脑损伤中的关键性作用

缺血性脑卒中是全球范围内致死及致残的主要原因之一。核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是一种调节机体氧化还原反应平衡的蛋白质分子,通过协调多种细胞保护基因,参与抵抗内源性或外源性压力。Nrf2 信号通路不仅严格调控机体氧化还原稳态,同时还参与调节机体代谢的多个过程。因此,靶向 Nrf2 已成为预防和治疗包括缺血性脑卒中在内的中枢神经系统疾病的潜在策略。首先介绍 Nrf2 和 Kelch 样 ECH 相关蛋白 1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)的结构特征,并简要描述 Nrf2 通路的激活和调控过程。然后讨论 Nrf2 通路的病理生理机制、上游调节剂和下游靶点。在此背景下,扩展到 Nrf2 在缺血性脑卒中后的作用,并探讨潜在的治疗方向。     

Nrf2/ARE通路在消化道肿瘤预防中的研究进展

转录因子红细胞系-2 p45(NF-E2)相关因子-2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)通过与抗氧化反应元件ARE(antioxidant response element)结合,调控一系列二相解毒酶和抗氧化酶基因的表达,从而保护机体免受化学致癌剂的伤害,大量研究证明Nrf2对预防肿瘤发生起重要的作用。目前,肠癌、胃癌、食管癌等消化道肿瘤是我国高发癌症类型,服用天然或人工合成的Nrf2激活剂有可能是防止此类疾病发生的有效措施。文中基于动物模型和临床的研究报道,综述了Nrf2/ARE通路在消化道肿瘤化学预防中的最新进展。     

Nrf2在中枢神经系统疾病中的神经保护作用

活化状态的核因子相关因子2(Nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)通过与核内的抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)相结合,启动下游一系列分子的表达,如Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶、血红毒加氧酶(heme oxygenase,HO)、谷胱甘肽合成代谢相关酶,其中HO和谷胱甘肽合成代谢相关酶可发挥广泛的神经保护作用。文中对Nrf2的分子机制及在多种中枢神经系统疾病中的神经保护作用作一综述。     

Nrf2基因敲除小鼠的饲养繁殖及基因型鉴定

目的 繁殖和鉴定Nrf2基因敲除小鼠.方法 将引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功的子代有3种基因型小鼠,即野生型、杂合子以及纯合子小鼠,从繁殖成功的小鼠尾巴中提取基因组DNA,用PCR法鉴定小鼠的基因型.结果 Nrf2杂合子小鼠的繁殖和饲养均获得成功,亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠.结论 正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得Nrf2基因敲除纯合子小鼠的有效途径.