膀胱无细胞基质负载骨髓间充质干细胞体外构建组织工程膀胱复合物的研究

目的: 探索大鼠膀胱无细胞基质负载骨髓间充质干细胞体外构建组织工程膀胱复合物的可行性。
方法: 全骨髓贴壁培养法提取大鼠骨髓间充质干细胞( BMSCs) ,物理和酶消化法相结合制备大鼠膀胱无细胞基
质( BAMG) ,将分离纯化的P3 代BMSCs 接种在BAMG 上共同培养构建组织工程膀胱复合物,HE 染色观察复合
物的细胞生长情况,以P3 代BMSCs 的单独培养做对照,绘制两组细胞生长曲线图,对比评价BAMG 对BMSCs
生长有无影响。结果: ( 1) 全骨髓贴壁培养法分离培养的BMSCs 经流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD44
抗原表达阳性,而CD34 呈阴性表达。( 2) 应用物理法和酶消化法相结合成功制备BAMG,HE 和扫描电镜均未
见细胞残留,具有完整的胶原及纤维结构。( 3) BMSCs 与BAMG 能黏附生长,体外成功构建组织工程膀胱复合
物,其生长曲线和对照组基本相同。结论: 全骨髓贴壁培养法能简单有效的增殖纯化BMSCs,物理法和酶消化法
相结合可以成功制备BAMG,二者体外成功构建组织工程膀胱复合物。     

骨髓间充质干细胞的概述及在膀胱损伤中的作用

干细胞独特的生物学特征和诱人的应用前景, 越来越受到科研工作者的青睐.组织工程学是利用体外培养的方法将某些具有干细胞特性的细胞诱导分化为目的 组织或器官以供临床所需.本文从MSC分离培养、鉴定及生长动力学特性来阐述骨髓间充质干细胞,并以肾损伤为例,介绍间充质干细胞所起的作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞通过膀胱壁注射改善大鼠逼尿肌无力

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone-derived mesenchymal stem cells,rBMSCs)膀胱壁注射法改善大鼠逼尿肌无力(acontractile detrusor,ACD)的可能性.方法 40只SD雌性大鼠分为4组,每组10只:正常大鼠对照组、低温诱导ACD组、生理盐水治疗组、rBMSCs治疗组.常规分离培养rBMSCs至第3代.建立大鼠膀胱壁冻伤模型模拟逼尿肌无力的情况,将rBMSCs或生理盐水注入大鼠膀胱壁肌层,14 d后检测各组大鼠膀胱排尿功能,逼尿肌肌条收缩力,RT-PCR和Western blot检测平滑肌收缩相关蛋白(α-SMA、Calponin和SM-MHC)的表达情况,HE染色了解各组大鼠膀胱壁组织学改变情况.结果 rBMSCs治疗组膀胱内压、肌条收缩力显著高于低温诱导ACD组和生理盐水治疗组(P＜0.01),恢复超过50％.治疗组α-SMA、Calponin及SM-MHC的表达明显高于低温诱导ACD组和生理盐水治疗组(P＜0.01).结论 rBMSCs通过膀胱壁注射能有效改善大鼠逼尿肌无力.     

自体骨髓间充质干细胞复合膀胱去细胞基质修复犬膀胱缺损的实验研究

目的 探讨利用自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合膀胱去细胞基质(BAMG)进行犬膀胱缺损修复重建的可行性。方法 25只杂种犬,5只用于制备BAMG,20只随机分为两组进行膀胱部分切除术。A组用单纯BAMG修复膀胱缺损,B组用复合自体BMSCs的BAMG修复膀胱缺损。分别在术后1、2、4、8、12周取材进行组织学和免疫组织化学检测评价膀胱组织再生情况。结果 所有动物术后均存活。组织学检测结果表明B组术后2周时已有尿路上皮形成,术后8周和12周时在修复区再生出与正常膀胱组织相似的膀胱壁结构。A组术后4周观察到尿路上皮再生,术后12周时仍然缺乏良好的平滑肌组织再生。结论 自体BMSCs复合BAMG比单纯BAMG更能促进膀胱缺损区修复和组织再生。自体BMSCs是组织工程膀胱可供选择的种子细胞来源。     

脱细胞膀胱基质复合大鼠骨髓间充质干细胞体外构建组织工程化吊带治疗压力性尿失禁的初步研究

目的探讨脱细胞膀胱基质(urinary bladder matrix,UBM)复合大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesen-chymal stem cells,BMSCs)构建组织工程化吊带治疗压力性尿失禁的可行性。方法采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离、培养和扩增BMSCs,流式细胞术检测BMSCs免疫表型,将第3代BMSCs与UBM复合培养,7 d后通过光镜和电镜观察细胞在材料上的生长情况,进一步应用万能力学测试仪检测所构建吊带的最大负荷、杨氏模量、伸展性等机械特性,另以UBM负载大鼠膀胱平滑肌细胞株(smooth muscle cells,SMCs)构建SMCs吊带、单纯UBM及聚丙烯材料行效果比较。结果分离培养的BMSCs呈长梭形,折光性好,增殖旺盛,具有成体干细胞特性,细胞表面标志物CD29阳性,CD45和CD31阴性。UBM去细胞彻底,复合BMSCs或SMCs均可获得生长良好的细胞。机械性状检测表明,单纯UBM和复合BMSCs的UBM吊带与SMCs吊带及聚丙烯材料相比,最大负荷下降[(0.025±0.003)、(0.018±0.004)kN vs(0.030±0.003)、(0.143±0.034)kN,P<0.01];杨氏模量下降[(170.820±61.735)、(103.624±52.779)MPa vs(490.730±80.969)、(900.100±192.402)MPa,P<0.01];伸展性提高[(16.418±1.014)、(22.684±6.848)mm vs(9.498±1.384)、(2.975±0.401)mm,P<0.01]。结论成功分离、培养了大鼠BMSCs,并鉴定了其干性。构建的干细胞吊带与SMCs吊带及聚丙烯材料相比,其伸展性良好。     

大网膜包裹构建预血管化组织工程骨

目的:探讨大网膜包裹构建预血管化组织工程骨的可行性。方法:按文献描述方法制备双相陶瓷骨材料。体外分离培养兔脂肪干细胞并种植于双相陶瓷骨材料构建ADSCs双相陶瓷骨复合物。将复合物包裹于腹腔大网膜异位成骨,并与复合物肌肉包裹对比,于术后4、8、12周通过HE染色及免疫组化观察成骨情况及血管生成情况。结果:成功分离培养脂肪干细胞,复合双相陶瓷骨培养扫描电镜观察证实大量细胞黏附支架材料。术后4、8、12周,腹腔大网膜包裹异位成骨新骨形成面积及血管生成均大于肌肉包裹异位成骨,实验组术后4周可见新骨生成,术后12周新骨生成更加成熟。结论:腹腔大网膜包裹异位成骨优于肌肉包裹异位成骨,腹腔大网膜包裹ADSCs双相陶瓷骨复合物是构建血管化成熟编制骨的一种有效的新方法。     

骨髓间充质干细胞和猪去细胞瓣膜支架构建组织工程瓣膜

目的 探讨运用组织工程技术以骨髓间充质干细胞和去细胞猪心脏瓣膜支架构建组织工程心脏瓣膜的方法.方法 体外培养、扩增自体骨髓间充质干细胞并鉴定,接种于以曲拉通-脱氧胆酸钠、RnaseⅠ和DnaseⅠ去细胞的猪心脏瓣膜支架上,形成细胞材料复合物,体外培养7 d,将该复合物移植于裸鼠腹腔,4周后行组织学检测.结果 骨髓间充质干细胞具有与成纤维细胞相似的生物学特性,表达ASMA,Vimentin抗原,去细胞瓣膜去细胞彻底,骨髓间充质干细胞可在支架表面良好生长,形成表面光滑的细胞层,分泌细胞外基质,生长好.在裸鼠体内可继续扩增,形成多层细胞.结论 运用组织工程技术以骨髓间充质干细胞和去细胞猪心脏瓣膜可生成初级组织工程瓣膜.     

骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞的研究进展

组织工程学技术为颌骨缺损修复提供了新的途径，而种子细胞（seed cell）的研究是其中的主要内容之一。骨组织工程种子细胞主要来源包括骨膜、骨组织、骨髓来源的成骨细胞，     

丁酸钠对大鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的影响

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACi)丁酸钠对在体外与膀胱平滑肌细胞(bladder smooth muscle cells,BSMCs)接触共培养的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化能力的影响。方法常规培养大鼠BMSCs及BSMCs至第3代,种植于多孔膜两侧进行接触共培养。实验组BMSCs培养上室面添加含3 mmol/L丁酸钠诱导其分化;对照组不含丁酸钠行接触共培养。免疫荧光化学染色法对2组BMSCs中平滑肌标志性蛋白calponin进行检测,同时用逆转录PCR(RT-PCR)和荧光定量PCR法(real-time PCR)对BMSCs中平滑肌α肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、calponin、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle-myosin heavy chain,SM-MHC)行进鉴定。结果大鼠原代BMSCs流式检测显示CD29、CD44、CD166表达阳性,阳性率分别为96.55%、92.76%、99.54%;CD31、CD45表达阴性,阳性率为1.39%、5.56%。BSMCs鉴定α-SMA、calponin、SM-MHC 3种标志性蛋白的表达均为阳性。细胞免疫荧光染色显示平滑肌标志性蛋白calponin的表达均随时间的延长而增加,实验组表达强度明显高于对照组。RT-PCR和荧光定量PCR显示实验组中BMSCs平滑肌标志性基因α-SMA、calponin、SM-MHC随共培养时间的延长逐渐增多,与对照组比较有明显差异(P<0.05)。结论 HDACi丁酸钠可以增强BMSCs向平滑肌细胞的分化能力,提示提高组蛋白乙酰化程度可以促进BMSCs分化。     

新西兰兔骨髓基质细胞构建组织工程膀胱的实验研究

目的：研究骨髓基质细胞(MSCs)在兔组织工程膀胱中的应用．方法：按献改进方法制作膀胱无细胞基质(BAMG)，从兔胫骨中分离出MSCs，体外扩增后接种于BAMG外表面，在低糖DMEM(LG—DMEM)培养12h，与BAMG复合成组织工程膀胱，对同一兔实施膀胱次全切术，用组织工程膀胱替代．20只兔实施了保留三角区的膀胱次全切术．实验随机分为3组．A组6只直接缝闭三角区；B组7只用膀胱形状的BAMG进行重建；C组7只用复合自体MSCs的组织工程膀胱进行替代手术．术前术后分别记录膀胱测压和放射线造影资料．12wk时无痛处死动物，进行大体解剖和组织染色分析．结果：体外扩增时间平均为21d．A，B和C组膀胱容积分别为术前的22％，85％和95％，顺应性分别为术前的11％，104％和107％．大体解剖显示A组仅有很小的储水能力，而B，C组具有正常膀胱形态，组织染色分析A，B组显示上皮层正常，粘膜下纤维组织增生而肌层较薄；C组则显示了与自体膀胱相似的正常的3层组织结构．结论：膀胱次全切除后原位缝合膀胱容积和顺应性均不能恢复，单纯应用BAMG膀胱容积和顺应性能够恢复正常，但逼尿肌层较薄，应用BAMG复合自体ASCs或MSCs的组织工程膀胱替代，术后12wk膀胱容积和顺应性能够恢复正常，膀胱壁组织结构与正常膀胱相似．提示膀胱次全切除后应用BAMG复合自体MSCs的组织工程膀胱替代可以获得良好功能和组织结构．     

骨髓问充质干细胞体外培养表达平滑肌肌动蛋白的实验研究

目的观察骨髓间充质干细胞在无诱导因素干预下,自身表达平滑肌肌动蛋白（smooth muscle alpha-actin,α-actinSM）情况。方法采用直接贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,传代培养至第4代时,对间充质干细胞进行鉴定。利用抗α-actin SM荧光抗体,检测间充质干细胞胞质内α-actin SM表达,计算其阳性率。结果骨髓间充质干细胞在无诱导因素干预下,其自身即可表达平滑肌早期特异性标志α-actin SM,阳性率高达44.1%。结论骨髓间充质干细胞体外培养时,无需诱导因素干预,能够自发向平滑肌细胞方向分化。     

骨髓间充质干细胞在心脏组织工程中的应用

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能，体外可诱导分化为心肌细胞，采用组织工程学技术可在体外构建组织工程化心肌组织。文章从心脏组织工程的角度对BMSCs作一概述。     

自体内皮祖细胞促进组织工程骨血管化的体内外实验研究

目的：探讨自体内皮祖细胞（EPCs）在体内、外促进组织工程骨血管化的能力。方法将兔自体外周血 EPCs 及骨髓间充质干细胞（BMSCs）按联合培养时细胞增殖率最大时配比（EPCs ∶ BMSCs ＝1∶2）体外培养（联合培养组）,在体外采用实时定量 PCR 方法检测成骨相关细胞因子 Osteonectin 、Osteopotin 、Col-1及成血管相关细胞因子血管内皮生长因子（VEGF）表达,于培养3、7、14 d 观察表达量的变化并与单纯 EPCs 及 BMSCs 组比较;将单纯 EPCs 、BMSCs 及联合培养组的组织工程骨移植到兔四肢肌袋内,于移植后2、4、8周观察组织工程骨生长情况,同时制成组织切片行 CD34、CD105、ZO-1免疫组织化学染色,采用 Im-age-Pro plus 6．0图像分析软件,测量光密度值,比较3组工程骨表达量变化。结果3、7、14 d Osteonectin 、Osteopotin 、Col-1、VEGF 各组表达均逐渐增高,其中联合培养组增高最明显,且各时间点表达量最高（P＜0．01）;2、4、8周兔四肢肌袋内的组织工程骨中联合培养组细胞复合的工程骨随时间延长成骨增加最明显,新生血管长入最多,免疫组织化学显示 CD34、CD105、ZO-1表达最明显（P＜0．01）。结论自体 EPCs 与 BMSCs 相互作用,在体内、体外均可促进组织工程骨血管化。     

骨髓间充质干细胞移植对失神经肌肉萎缩大鼠的影响

目的观察骨髓间充质干细胞移植于大鼠离断坐骨神经断端治疗失神经肌肉萎缩的效果。方法采用贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。选取健康Sprauge-Dawley大鼠36只,切断左侧后肢坐骨神经制备神经缺损模型,随机分为观察组和对照组,观察组大鼠左侧后肢腓肠肌内注射1.5×108L-1的骨髓间充质干细胞悬液0.2 m L,对照组大鼠左侧后肢腓肠肌内注入同等剂量低糖达尔伯克改良伊格尔培养液,分别于2、4、6周后对2组大鼠进行大体观察,检测左侧后肢腓肠肌湿质量、肌纤维横截面积、坐骨神经功能指数(SFI),免疫组织化学法检测腓肠肌组织Bcl-2、Bax的表达变化。结果术后2、4、6周,观察组大鼠左侧后肢腓肠肌湿质量、腓肠肌纤维横截面积、SFI均显著高于对照组(P<0.05)。术后2、4、6周,观察组大鼠左侧后肢腓肠肌组织中Bcl-2阳性细胞表达强度均高于对照组(P<0.05),Bax阳性细胞表达强度均低于对照组(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞可提高失神经后骨骼肌湿质量和肌纤维横截面积,减少肌细胞凋亡,延缓失神经支配骨骼肌萎缩。     

Ectopic osteogenesis and scaffold biodegradation of tissue engineering bone composed of chitosan and osteo-induced bone marrow mesenchymal stem cells in vivo

Background Chitosan （CS） scaffolds combined with osteogenically induced bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） have been proved to be promising substitutes for repairing bone defects.Nevertheless,the bone-forming and scaffold-biodegrading processes are seldom studied.This study aimed to determine the osteogenic ability of CS/osteoinduced BMSC composites by observing the bone-forming process and explore the relationship between bone formation and scaffold biodegradation.Methods The CS/osteo-induced BMSC composites （CS＋cells group） and the CS scaffolds （CS group） were,respectively,implanted into SD rat thigh muscles.At 2,4,6,8,and 12 weeks postoperatively,the rat femurs were scanned by CT,and the CT values of the implants were measured and comparatively analyzed.Subsequently,the implants were harvested and stained with hematoxylin and eosin and Masson trichrome,and the percentages of bone area,scaffold area,and collagen area were calculated and compared between the two groups.Results The imaging results showed that the densities of implants of the two groups gradually increased along with time,but the CT values of implants in the CS＋cells group were much higher than in the CS group at the same time point （P ＜0.05）.The histological results showed that the de novo bone and collagen formed in the pores of the scaffolds and gradually increased since 2 weeks postoperation in both groups,and the scaffold gradually degraded along with the boneforming process.However,the comparative analysis results showed that the CS＋cells group gained more de novo bone and collagen formation and had less scaffold than the CS group at the same time point （P ＜0.05）.Conclusion The CS/osteo-induced BMSC composites are excellent bone tissue engineering substitutes,and the scaffold biodegradation is accordant with the bone formation.     

黑色素细胞与骨髓间充质干细胞复合构建组织工程化皮肤

目的 探讨构建含有黑色素细胞组织工程化皮肤的方法.方法 从人包皮组织中获取黑色素细胞,从人骨髓中获取骨髓间充质干细胞(BMSCs),以二者为种子细胞,按照1:10的比例混和培养,并与I型胶原膜复合体外构建组织工程化皮肤,对裸鼠创面进行修复.通过大体标本观察、4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)体内示踪标记、HE染色、免疫组织化学检测及透射电镜观察等方法,观察组织工程化皮肤修复裸鼠皮肤创面缺损及黑色素细胞的分布情况.结果 裸鼠创面皮肤生长良好,DAPI体内示踪标记、免疫组织化学检测S-100蛋白及透射电镜观察可以发现黑色素细胞以正常的组织结构形式分布于创面皮肤.结论 黑色素细胞与BMSCs通过适当的比例及体外条件培养,与I型胶原膜复合可以在体外构建出具有黑色素细胞的组织工程化皮肤.     

壳聚糖复合成骨诱导后的骨髓间充质干细胞组织工程骨的异位成骨及支架降解的实验研究

摘要 背景及目的：壳聚糖支架复合成骨诱导后的骨髓间充质干细胞已经被证实是修复骨缺损的良好替代材料。然而,其成骨的具体过程以及支架的降解却研究较少。本研究的目的是通过观察壳聚糖支架复合成骨诱导后的骨髓间充质干细胞后的异位成骨过程来证实该复合材料的成骨能力,并探索支架降解与骨形成之间的关系。 方法：壳聚糖支架复合成骨诱导后的骨髓间充质干细胞（壳聚糖复合细胞组）和单纯壳聚糖支架（壳聚糖组）被分别植入SD大鼠的股骨肌袋内。 于术后2、4、6、8、12周,分别对大鼠股骨行CT扫描,并测定、统计分析两组的植入物CT值。随后取出标本,行HE染色和Masson染色,并测定、统计分析骨面积分数、支架面积分数以及胶原面积分数。 结果：影响学结果显示两组植入物的密度随时间延长而逐渐增高,但是在同一时间点,壳聚糖复合细胞组植入物的CT值明显高于壳聚糖组（P<0.05）。组织学检测结果显示从术后2周开始,两组均可观察到支架孔隙内的新骨和胶原蛋的形成并且随着时间延长而逐渐增加,以及支架随着骨形成的过程而逐渐降解。然而,统计分析结果显示,在同一时间点,壳聚糖复合细胞组的新生骨量以及胶原蛋白表达量明显高于壳聚糖组,而剩余支架要明显少于壳聚糖组。 结论：壳聚糖支架复合成骨诱导后的骨髓间充质干细胞是一种优秀的组织工程骨替代物,支架的降解与异位成骨过程一致。     

应用hMSCs-脱钙骨复合物体内构建软骨组织的实验研究

目的 观察成软骨诱导后人骨髓间充质干细胞和脱钙骨复合物在裸鼠皮下组织形成情况。方法 从志愿者髂前上嵴处抽取骨髓,得到骨髓间充质干细胞,将第1代的骨髓间充质干细胞密度调整到1.5×107/mL,均匀接种于脱钙骨,培养4 h后以含有TGF-β3(10 ng/mL)DMEM培养液的培养作为实验组,加10％FBS的DMEM为对照组Ⅰ,空白材料为对照组Ⅱ,体外培养6 d,嘲植到裸鼠皮下。回植前及回植后2、4、6、8、10周取材,石蜡切片进行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的免疫组化、Masson’s、Alician Blue’s染色鉴定。结果 回植前及回植后各时间段,实验组免疫组化测到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的表达,对照组未见Ⅱ型胶原表达;实验组Masson、Alician染色可见材料内的胶原分泌非常旺盛,有硫酸化酸性粘多糖沉积,对照组则表达量极少。结论 诱导后人骨髓间充质干细胞一脱钙骨复合物在裸鼠皮下能表达特异性软骨基质。     

损伤性肾匀浆体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞转分化效果及可能机制的研究

目的：利用损伤性肾匀浆体外模拟急性肾损伤的微环境,探讨骨髓间充质干细胞（BM SC ）诱导转分化及其可能机制。方法将体外培养的BM SC用10％大鼠缺血再灌注损伤肾匀浆上清液进行培养。7 d后从形态学改变、18型角蛋白（CK‐18）、肝细胞生长因子（HGF）、骨形态发生蛋白‐7（ BM P‐7）的相应表达水平。结果损伤肾匀浆诱导7 d后,骨髓间充质干细胞形态发生明显变化,并检测到CK‐18阳性表达;同时被诱导的HGF和BMP‐7表达水平明显升高。结论损伤肾匀浆可诱导BMSC部分向肾小管上皮样细胞转分化,其可能机制是BMSC可能以旁分泌的形式产生了 HGF和BMP‐7等“肾脏保护因子”。