KISS-1和GPR54基因在雌性性早熟大鼠下丘脑中的表达

目的研究KISS-1和GPR54基因在雌性性早熟大鼠下丘脑中的表达,探讨其在性早熟发生中的作用。方法将雌性26日龄SD大鼠50只随机分为实验1组、实验2组、对照1组、对照2组、对照3组。实验组皮下注射N-甲基-D,L-天冬氨酸(NMA)每天2次直至阴道开放,对照组注射生理盐水,观察大鼠阴道开放时间及性周期,测量子宫指数、卵巢指数、卵巢黄体出现率、子宫壁厚度、黄体生成素(LH)浓度。采用Real-Time RT-PCR方法,检测KISS-1和GPR54基因在雌性性早熟大鼠下丘脑中的表达。结果实验组大鼠阴道开放及首次发情间期出现的时间较对照组提前(P<0.05)。随着青春期发育,各项观测指标均逐渐升高(P<0.05),在相同的性发育阶段,实验组和对照组各项观测指标无明显差异(P>0.05)。结论 KISS-1和GPR54基因的表达与性发育阶段密切相关,提示KISS-1与GPR54基因在真性性早熟的启动和发展过程中起重要作用。     

前列腺癌组织KISS-1、GPR54表达水平及其临床意义

目的分析前列腺癌组织中人吻素1(KISS-1)和G蛋白偶联受体54(GPR54)的表达水平,并探讨二者与前列腺癌患者临床病理特征及预后的关系。方法选取郑州大学附属郑州中心医院2016年4月至2018年5月收治的30例前列腺癌患者为前列腺癌组,另选取同期前列腺增生患者20例作为对照组。采用免疫组化法检测两组中KISS-1和GPR54蛋白表达情况;采用定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测两组KISS-1和GPR54 m RNA的表达水平;分析KISS-1和GPR54表达与前列腺癌组织临床病理特征及患者预后的关系。结果免疫组化结果显示,前列腺癌组中KISS-1阳性表达率低于对照组(16.67%vs. 80.00%)(P0.05),GPR54阳性表达率与对照组差异无统计学意义(P0.05)。qRT-PCR结果显示,前列腺癌组中KISS-1 mRNA表达量低于对照组[(0.62±0.06)vs.(0.88±0.09)](P0.05),GPR54 mRNA表达量与对照组差异无统计学意义(P0.05)。KISS-1和GPR54阳性表达与年龄、淋巴结是否转移无关,KISS-1和GPR54在不同TNM分期下的阳性表达差异有统计学意义(P0.05),GPR54在不同Gleason评分下的阳性表达差异有统计学意义(P0.05)。KISS-1阳性表达者1年生存率高于阴性表达者(100.00%vs. 80.00%),GPR54阳性表达者1年生存率低于阴性表达者(80.77%vs. 100.00%),差异均有统计学意义(P0.05)。结论 KISS-1和GPR54在前列腺组织中异常表达可能与前列腺癌的发生发展及患者预后有关,有望成为预测前列腺癌的潜在生物指标。     

金属硫蛋白3基因启动子甲基化与自闭症的相关性

目的:探讨金属硫蛋白3(MT3)基因启动子区甲基化及基因表达与自闭症的关系及其意义。方法:采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对33例自闭症患者和39例对照组儿童的外周血白细胞中MT3基因启动子区域子42个CpG位点甲基化进行定量检测,并采用实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)检测其MT3mRNA的水平。结果:自闭症患者中15个CpG位点甲基化程度与对照组相比较差异有统计学意义(P均<0.05),与对照组儿童相比,MT3mRNA表达水平在自闭症患者中增加(P<0.01)。MT3基因部分CpG位点(CpG39.40.41.42.43)甲基化改变与其mRNA相对表达量呈负相关(r=-0.308,P<0.05)。结论:自闭症儿童MT3基因部分CpG位点低甲基化改变可能会引起该基因mRNA改变,这为自闭症的病因学研究提供了新的思路。     

双酚A暴露对KGN细胞m6A修饰水平的影响

目的 研究双酚A(BPA)暴露对卵巢颗粒细胞功能表观遗传学的影响。方法 将人卵巢颗粒瘤细胞(KGN细胞)暴露于BPA(浓度分别为0、0.02、0.2、2、20μg/mL) 24 h,作为溶剂对照组、0.02μg/mL BPA组、0.2μg/mL BPA组、2μg/mL BPA组、20μg/mL BPA组,测定mRNA m6A的修饰水平和m6A甲基化调控基因的表达变化;Merip-qPCR法检测抗氧化转录因子(Nrf2)的m6A修饰水平。结果 BPA下调mRNA m6A修饰水平(P<0.001),并改变了m6A甲基化调控基因的表达(P<0.05),2μg/mL BPA组的超氧化物歧化酶(SOD)表达降低(P<0.05),Nrf2的m6A修饰水平降低(P<0.05)。结论 BPA暴露通过下调Nrf2的m6A修饰导致人卵巢颗粒瘤细胞(KGN细胞)氧化应激增加,颗粒细胞功能损伤,对卵巢颗粒细胞表观遗传学产生影响。     

p16基因CpG位点甲基化在维吾尔族宫颈鳞癌及HPV16感染中的意义

目的:探讨p16 基因启动子区CpG 位点甲基化及HPV16 感染与新疆维吾尔族宫颈鳞癌的关系及其意义。方法:采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱方法(MALDI-TOF MS) 对20 例维吾尔族宫颈鳞癌及20 例对照组维吾尔族宫颈组织中的p16 基因启动子CpG 位点甲基化进行定量检测;采用聚合酶链反应(PCR) 的方法检测两组HPV16 的感染状况。结果:宫颈鳞癌及对照组中p16 基因启动子区16 个CpG 位点中CpG1-2, CpG6 为甲基化差异位点, 宫颈鳞癌组中CpG1-2, CpG6 位点甲基化水平明显高于对照组;宫颈鳞癌组的HPV16 感染率明显高于对照组, 差异有统计学意义(P<0.05);所检测的维吾尔族宫颈鳞癌组织中p16 基因启动子区CpG 位点甲基化与HPV16 感染无明显相关。结论:p16 基因启动子区CpG1-2, CpG6 位点高甲基化及HPV16 感染均与维吾尔族宫颈鳞癌的发生有关系, 但为两个独立事件。     

围生期高剂量双酚A暴露对仔鼠生命早期调节性T细胞的影响

目的研究围生期高剂量双酚A(BPA)暴露对仔鼠生命早期调节性T细胞(Treg)的影响,初步探讨BPA发育免疫毒性的机制。方法将确认妊娠的ICR母鼠随机分为空白对照组、溶剂对照组、BPA低剂量组(0.125 g/L)、BPA中剂量组(0.5 g/L)和BPA高剂量组(2 g/L);母鼠自妊娠第0天(GD 0)至仔鼠出生后第7天(PND 7)经饮水染毒。PND 7时处死仔鼠,无菌取胸腺,流式细胞仪(FCM)检测胸腺Treg细胞数量,RT-PCR检测Treg细胞特征性转录因子Foxp3 mRNA表达水平。结果与空白对照组及溶剂对照组比较,BPA高、中剂量组仔鼠体重在PND 1、PND 4和PND 7时明显降低(P<0.05);与空白对照组及溶剂对照组比较,BPA高、中、低3个剂量组仔鼠胸腺Treg细胞数量明显减少(P<0.01);与空白对照组及溶剂对照组相比较,3个BPA暴露组仔鼠Foxp3 mRNA表达水平明显减少,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论围生期高剂量BPA暴露可明显影响仔鼠生命早期体内Treg细胞,从而影响机体免疫功能。     

母鼠孕期暴露双酚A对子代雌性大鼠性发育的影响

目的：研究母鼠孕期暴露双酚A（BPA）对子代雌性大鼠的性发育影响。方法：选择SPF级12周龄的健康成年SD大鼠,按雌∶雄为2∶1比例合笼。将妊娠大鼠20只,随机分成4组,于妊娠第5天至第20天,分别按0,10,50,250mg/（kg·d）进行灌胃染毒。母鼠正常分娩,雌性仔鼠出生28天开始观察阴道开口,第一次发情周期,此后连续观察动情周期变化,在第10周确定发情间期后处死动物。称量肝脏、肾脏、子宫、卵巢的重量,计算脏器系数;用ELISA法测血清中卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、孕酮（P4）、雌二醇（E2）及睾酮（T）水平。结果：各剂量组肝脏和肾脏重量与对照组相比有增加趋势,50 mg/kg组的肾脏重量和250 mg/kg组的肾脏系数有统计学意义（P〈0.05）;与对照组比较,10 mg/kg组阴道开口延迟,而250 mg/kg组阴道开口日龄提前,各剂量组阴道开口时体重增加（P〈0.05）;与对照组相比,BPA各剂量组子代雌性大鼠性周期均无明显影响;各剂量组与对照组相比,T水平明显下降（P〈0.05）;50mg/kg组与对照组相比,LH、FSH、E2水平明显减少（P〈0.05）,且P4水平有升高趋势;而250 mg/kg组上述指标与对照组比较差异无显著性（P〉0.05）。结论：母鼠孕期暴露BPA可能导致子代雌性大鼠下丘脑-垂体-性腺轴的调节功能障碍,对其性发育功能造成一定影响。     

长链游离脂肪酸对滋养细胞线粒体三羟基酰基辅酶A脱氢酶基因启动子区甲基化程度的影响

目的 探讨长链游离脂肪酸对胎盘滋养细胞线粒体β氧化循环长链三羟基酰基辅酶A脱氢酶(LCHAD)基因启动子区甲基化程度影响,以及对甲基化修饰的时间效应.方法 体外培养原代人绒毛滋养细胞及HTR-8/SVneo永久性人滋养细胞,研究组采用长链游离脂肪酸孵育滋养细胞(LC-FFA组),并以短链游离脂肪酸(SC-FFA组)和中链游离脂肪酸(MC-FFA组)作为不同链长游离脂肪酸对照组,空白对照组无脂肪酸(F-FFA组).分别在孵育24、48及72 h收集细胞并提取DNA.在LCHAD基因转录起始位点上游2 000 bp区域内序列预测CpG岛位置,设计甲基化检测位点和引物.采用Sequenom MassArray甲基化DNA定量分析平台检测不同组CpG岛各CpG位点的甲基化程度后进行各甲基化位点和CpG岛的统计学分析.结果 (1)在LCHAD基因转录起始位点上游2 000bp区域内的17个CpG位点中获得11个位点(65％)的甲基化程度,8个为单独位点,3个为复合位点(-984、-960、-899、-853、-811、-796、-774、-727、-615、-595、-579).在不同研究组中每个位点的甲基化变化程度各不同,其中-899位点变化最明显.(2)LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度变化分析:①长、中链游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度影响伴随时间的延长呈现升高趋势:LC-FFA组孵育72 h(0.55±0.08)比孵育48 h(0.35±0.12)及24 h(0.31±0.04)均明显升高(P＜0.05),48 h虽比24 h升高,但差异无统计学意义(P＞0.05).MC-FFA组孵育72 h(0.44±0.05)比孵育24 h(0.31±0.04)明显升高(P＜0.05).②不同链长游离脂肪酸在不同作用时间影响LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度比较:LC-FFA组孵育72 h的甲基化程度比MC-FFA、SC-FFA组及F-FFA组的72、48及24 h均明显升高(P＜0.05).(3)作用72 h游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区11个CpG位点甲基化程度影响比较:在LC-FFA组和MC-FFA组-899位点甲基化程度明显高于其他位点(P＜0.05).(4)长链游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区-899位点甲基化程度影响伴随时间的延长呈现升高趋势(P＜0.05).LC-FFA组孵育72 h比MC-FFA、SC-FFA组及F-FFA组的72、48及24 h均明显升高(P＜0.05).结论 长链游离脂肪酸比中链和短链游离脂肪酸呈现较大的滋养细胞LCHAD基因启动子区甲基化的修饰作用,并伴随作用时间延长表现出明显的时间依赖效应;甲基化程度改变主要发生在LCHAD基因启动子区-899位点.     

卵巢上皮性癌OPCML基因的表达缺失和启动子甲基化

目的探讨OPCML基因在卵巢上皮性癌中的失表达及其与基因启动子CpG岛甲基化的关系。方法用逆转录—聚合酶链反应、限制性内切酶-聚合酶链反应检测卵巢正常组织、良性上皮性肿瘤、上皮性癌组织和SKOV-3、3AO、CAOV3卵巢癌细胞株OPCML基因的失表达及CpG岛甲基化。结果在卵巢癌中OPCMLmRNA的表达率显著低于正常卵巢组织(χ2=30·108,P=0·0000)和卵巢良性肿瘤组织(χ2=21·162,P=0·000)。SKOV-3和CAOV3细胞未见OPCMLmRNA表达,而3AO细胞可见OPCMLmRNA表达。在卵巢癌中,启动子CpG岛尤其是HapⅡ酶切位点甲基化率显著高于正常卵巢组织(χ2=13·630,P=0·0000)和良性肿瘤组织(χ2=11·797,P=0·000)。卵巢癌OPCML启动子CpG岛甲基化和mRNA失表达呈显著相关(r=11·589,P=0·002)。SKOV-3和CAOV3细胞有内切酶位点甲基化,而3AO细胞无酶切位点甲基化。结论卵巢上皮性癌细胞存在OPCML基因失表达;基因启动子CpG岛,尤其是HapⅡ酶切位点的甲基化是导致OPCML基因失表达的途径,但不是唯一途径。     

双酚A干扰人卵巢颗粒细胞雌二醇生成的机制

目的:研究双酚A(BPA)对人卵巢颗粒细胞细胞色素P450芳香化酶(P450arom)和雌二醇(E2)表达的影响机制。方法:提取人卵巢颗粒细胞进行体外培养,细胞鉴定采用免疫细胞化学法,CCK-8增殖实验分析细胞体外增殖活力。予以不同浓度BPA(0,0.1,1,10,100mg/L)或BPA+PPAR-γ抑制剂GW9662 1μmol/L处理处理人卵巢颗粒细胞,ELISA法测定各组E2浓度,获取细胞沉淀,RT-PCR法测定P450arom mRNA表达。结果:人卵巢颗粒细胞体外培养第3-5天达增殖分裂高峰,FSHR免疫细胞化学鉴定显示阳性染色定位于细胞膜和细胞质,细胞纯度达95%以上,ELISA及RT-PCR结果显示当BPA浓度为0.1mg/L时,P450arom mRNA及E2生成较空白对照组增加(P<0.05),当BPA浓度为1,10,100mg/L时,P450arom mRNA及E2生成逐渐减少(P<0.05),加入GW9662后,P450arom mRNA及E2表达量较单独BPA处理组增高(P<0.05)。结论:BPA干扰人卵巢颗粒细胞E2的生成,该干扰可能通过PPAR-γ核受体途径进行。