腺病毒介导的NgR特异性RNA干扰对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠神经行为学的影响

目的 观察NgR特异性RNA干扰的重组腺病毒(Ad-shRNA-NgR)转染实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)大鼠脑组织后,EAE大鼠脑内NgR表达及神经行为学的情况.方法 Wistar大鼠108只,采用随机数字表法分为正常对照组(n=27)、空白对照组(n=27)、阴性对照组(n=27)、特异性RNAi组(n=27).造模后第7天,通过侧脑室对阴性对照组及特异性RNAi组分别注射Ad-shRNA-HK、Ad-shRNA-NgR,空白对照组以等量的PBS代替.注射后第7、14天,RT-PCR、免疫荧光染色观察脑组织中NgR的表达并行Koh神经功能评分.结果 特异性RNAi组大鼠脑组织中NgR mRNA的表达及NgR免疫荧光染色的IOD值:注射后第7天,较空白及阴性对照组均明显下降(P<0.01);注射后第14天,较该组注射后第7天时增高(P<0.05),但仍低于空白及阴性对照组(P<0.05).特异性RNAi组EAE的发病潜伏期延长(P<0.05),Koh神经功能评分降低(P<0.05),体质量无明显减轻.结论 腺病毒介导的NgR特异性RNAi可明显下调EAE大鼠脑组织中NgR的表达,改善EAE大鼠的神经行为.     

17β-雌二醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓Rho激酶表达的影响

目的探讨17β-雌二醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠中枢神经系统Rho激酶表达的影响及相关机制。方法 75只雌性Wistar大鼠分为正常组、模型组、雌激素组、DMSO对照组和雌激素+雌激素核受体抑制剂ICI组。雌激素组每日皮下注射17β-雌二醇20μg/(kg.d),连续10 d。雌激素+ICI组于17β-雌二醇注射前先给予雌激素核受体抑制剂ICI 182780 5 mg/(kg.d),比较各组大鼠神经功能评分;HE染色观察病理学改变;免疫组织化学和Western blot观察Rho激酶表达的变化。结果与对照组和模型组分别比较,雌激素组发病潜伏期延长,神经功能评分降低;HE染色示雌激素组炎性细胞浸润减少;免疫组化检测结果显示,雌激素组Rho激酶阳性细胞数(8.36±1.57)明显低于模型组[(17.55±1.70),P<0.01];Western blot检测结果显示,雌激素组蛋白表达相对值(0.833±0.022)显著低于模型组[(1.013±0.060),P<0.05];雌激素+ICI组Rho激酶阳性细胞数(18.90±2.39)和蛋白表达(1.141±0.046)显著高于雌激素组(P<0.05)。结论 17β-雌二醇能抑制EAE大鼠Rho激酶的表达,这种抑制作用是通过经典的雌激素核受体通路实现的。     

Rho激酶与大鼠不稳定膀胱关系的实验研究

目的探讨Rho激酶与不稳定膀胱发生之间的关系.方法建立不稳定膀胱大鼠模型;采用RT-PCR方法测定不稳定膀胱及对照组逼尿肌Rho激酶亚型密度的变化;Rho激酶特异选择性抑制剂Y-27632对逼尿肌肌条自发性收缩频率和收缩力的影响.结果①DI组ROCKⅠ mRNA的表达(0.93±0.14)明显高于对照组(0.60±0.03)(P<0.01);②DI组ROCKⅡ mRNA的表达(0.75±0.07)与正常对照组(0.67±0.10)之间无明显差异(P>0.05);③Rho激酶抑制剂Y-27632 (3 μmol/L)可以显著降低DI组膀胱的自发性收缩频率和自发性收缩张力,对照组无明显影响.结论 Rho激酶与不稳定膀胱的发生有关.     

融合表达IL-18BP和IL-4的重组腺病毒治疗对胶原诱导型关节炎小鼠血清IL-18表达的作用

目的:构建小鼠IL-18BP和IL-4融合表达的重组腺病毒载体(Ad mIL-18BP/mIL-4),对胶原诱导型关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠进行局部关节基因治疗,观察小鼠血清IL-18表达水平。方法:采用雄性DBA-1/BOM小鼠,建立胶原诱导关节炎的小鼠模型。将融合表达小鼠IL-18BP和IL-4的重组腺病毒载体进行局部关节腔内注射后1、2、4周,采用酶链免疫吸附检测方法(ELISA),检测血清IL-18水平。同时设AdLacZ病毒对照组和PBS组织对照组。结果:CIA小鼠关节腔注射AdmIL-18BP/mIL-4后第1、2、4周,AdmIL-18BP/mIL-4治疗组的血清IL-18平均浓度分别为(36.5±5.4)ng/L、(32.5±3.2)ng/L、(28.7±2.9)ng/L,明显低于相应时间点AdLacZ对照组[(66.2±5.1)ng/L、(69.2±4.2)ng/L、(77.7±3.9)ng/L]和PBS对照组的水平[(67.3±7.1)ng/L、(71.9±1.8)ng/L、(78.7±4.1)ng/L],P均<0.01。但治疗组血清IL-1...     

Nuclear estrogen receptor-mediated Rho-kinase esxpression inhibition by 17β-estradiol in the spinal cord experimental autimmune encephalomyelitis rats

目的 探讨17β-雌二醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠中枢神经系统Rho激酶表达的影响及相关机制.方法 75只雌性Wistar大鼠分为正常组、模型组、雌激素组、DMSO对照组和雌激素+雌激素核受体抑制剂ICI组.雌激素组每日皮下注射17β-雌二醇20 μg/(kg·d),连续10 d.雌激素+ICI组于17β-雌二醇注射前先给予雌激素核受体抑制剂ICI 182780 5 mg/(kg·d),比较各组大鼠神经功能评分;HE染色观察病理学改变;免疫组织化学和Western blot观察Rho激酶表达的变化.结果 与对照组和模型组分别比较,雌激素组发病潜伏期延长,神经功能评分降低;HE染色示雌激素组炎性细胞浸润减少;免疫组化检测结果显示,雌激素组Rho激酶阳性细胞数(8.36±1.57)明显低于模型组[(17.55±1.70),P＜O.01];Western blot检测结果显示,雌激素组蛋白表达相对值(0.833 ±0.022)显著低于模型组[(1.013±0.060),P＜O.05];雌激素+ICI组Rho激酶阳性细胞数(18.90±2.39)和蛋白表达(1.141±0.046)显著高于雌激素组(P＜0.05).结论 17β-雌二醇能抑制EAE大鼠Rho激酶的表达,这种抑制作用是通过经典的雌激素核受体通路实现的.     

RNA干扰RGMa对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮质血管再生的影响

目的探讨RNA干扰排斥性导向分子a(repulsive guidance molecule a,RGMa)对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮质血管再生的作用及其可能的机制。方法大鼠随机分为假手术组(S组)、脑缺血再灌注损伤组(I/R组)、脑缺血再灌注损伤+RGMa特异性RNA干扰重组腺病毒干预组(I/R+rAd-shRGMa组)以及脑缺血再灌注损伤+空载体重组腺病毒注射组(I/R+rAd-HK组)。大鼠在脑缺血前接受腺病毒注射,然后采用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。再灌注后2d免疫荧光双标法定位RGMa及其受体Neogenin在血管内皮细胞上的表达。腺病毒注射后7d,免疫组化标记CD31+的血管内皮细胞,计数大脑皮质缺血周围区微血管数;蛋白质印迹实验检测血管内皮生长因子a(VEGFa)蛋白表达水平;评估神经功能缺损。结果在缺血再灌注损伤后,RGMa及其受体Neogenin在CD31+细胞上均有表达。RNA干扰抑制RGMa表达后,微血管数量增多,VEGFa蛋白表达水平升高,神经功能缺损减轻。结论 RNA干扰RGMa表达可促进缺血再灌注损伤后缺血皮质周围区血管再生,该过程可能与脑组织VEGFa表达水平上调有关。     

串联表达FMDV多表位基因重组腺病毒免疫小鼠的效应研究

目的检测口蹄疫重组腺病毒多表位疫苗(rAd5EGS)对小鼠特异性免疫的影响。方法 6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为三组,每组15只;rAd5EGS和rAd5VP1以腹膜内接种的方式免疫小鼠,对照组小鼠注射PBS。通过MTT法检测小鼠T淋巴细胞增殖功能、ELISA法检测小鼠血清中IgG水平及IgG亚型(IgG1和IgG2a),定量ELISA法检测小鼠血清中IL-4和IFN-γ的表达水平。结果 rAd5EGS既能诱导小鼠T淋巴细胞增殖又能诱导小鼠特异性抗体的产生,其诱导小鼠淋巴细胞增殖能力明显高于rAd5VP1免疫组(P<0.05);IgG亚型和细胞因子检测结果显示,rAd5EGS免疫组小鼠血清中IgG2a的分泌水平高于rAd5VP1免疫组(P<0.05),rAd5EGS免疫组小鼠血清中IFN-γ的表达水平高于rAd5VP1免疫组(P<0.05)。结论rAd5EGS具有良好的免疫原性,且诱导Th1分化的能力高于rAd5VP1,为口蹄疫表位疫苗的研究奠定基础。     

EAE发病机制中MALT1、IL-17作用的探讨

目的:通过建立实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型,观察小鼠脑组织中黏膜相关淋巴组织淋巴瘤转运蛋白1与血清白介素-17(Interleukin-17)的表达情况,并探讨两者在EAE发病机制中的作用。进一步探究MALTI是否可以作为多发性硬化(MS)的治疗靶点,以便寻找治疗MS的新手段。方法:将36只C57BL/6雌性小鼠按照随机数字表法分为EAE组和佐剂组各18只,EAE组采用MOG与完全弗氏佐剂的沫状混合物制备EAE模型,佐剂组仅给予弗氏佐剂。观察每只实验动物发病情况并每隔2 d进行一次神经功能评分。分别于免疫后14 d、24 d、40 d两组小鼠随机各取6只,心脏取血并4%多聚甲醛灌注取脑组织。取小鼠脑组织石蜡切片,免疫组化方法检测各组小鼠脑组织中MALT1并用ELISA法检测血清IL-17表达。结果:EAE组与佐剂组的小鼠神经功能评分、体重、血清中IL-17含量和脑组织中MALT1蛋白阳性细胞数比较差异均有统计学意义(P0.05)。EAE组中24 d组小鼠的神经功能评分(2.50±0.55)分明显高于14 d组的(0.83±0.41)分和40 d组的(1.50±0.32)分,体重(17.04±0.41)g明显少于14 d组的(18.33±0.49)g和40 d组的(18.15±0.13)g,且血清中IL-17含量(288.00±26.45)pg/mL明显高于14 d组的(122.60±10.11)pg/mL和40 d组的(184.40±29.51)pg/mL,脑组织中MALT1蛋白阳性细胞数(183.80±9.25)个明显多于14 d组的(78.25±9.47)个和40 d组的(133.50±19.87)个,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:EAE小鼠神经功能评分越高,血清中IL-17含量越高,MALT1表达也越多,提示MALT1参与了EAE小鼠的发病过程,其机制可能与MALT1在EAE小鼠上调血清IL-17表达有关。     

Rho激酶抑制剂及CD8+T细胞在EAE模型的作用机制研究

目的 观察Rho激酶抑制剂法舒地尔对RhoA、Rock-Ⅱ以及CD8+T细胞在脑和脊髓组织中表达的影响,探索法舒地尔在实验性自身免疫性脑脊骨髓炎(EAE)模型中的作用机制.方法 把90只Lewis大鼠随机分为5组:A组(空白对照),B组(免疫后第13天),C组(免疫后第21天),D组(免疫后第35天)及E组(法舒地尔干预组).以豚鼠全脊髓为抗原混合福氏完全佐剂(CFA)诱导Lewis大鼠EAE模型,观察实验动物神经功能损害的情况;利用免疫组织化学染色法观察实验动物组脑、脊髓组织中RhoA、Rock-Ⅱ以及CD8+T细胞的表达.结果 成功建立Lewis大鼠EAE模型,A、B、C、D、E 5组中RhoA、Rock-Ⅱ以及CD8+T细胞在脑、脊髓组织中均有表达,在免疫后21 d达高峰,在免疫后及法舒地尔干预组的脑、脊髓组织中表达较空白对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);法舒地尔干预组RhoA、Rock-Ⅱ以及CD8+T细胞在脑、脊髓组织的表达较免疫后各个时间点有所减轻,差异有统计学意义(P<0.05);免疫后第13天组与免疫后35天组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 Rho激酶抑制剂可以抑制EAE的病情进展、减轻神经元及轴索损害,其机制可能是抑制了Rho激酶参与白细胞及巨噬细胞迁移、浸润、吞噬过程;抑制Rho信号转导通路对细胞骨架的调节作用,而起到促进轴突再生、保护神经元的作用.     

RHO激酶抑制剂及CD8+T细胞在EAE模型的作用机制的研究

目的 观察RHO激酶抑制剂—法舒地尔对RHOA、ROCK-II以及CD8细胞在脑和脊髓组织中表达的影响,探索RHO激酶抑制剂-法舒地尔在EAE模型中的作用机制。 方法 把90只Lewis大鼠随机分为5组：A组（空白对照Lewis大鼠）,B组（免疫后第13天）,C组（免疫后第21天）D组（免疫后第35天）及E组（法舒地尔干预组）。以豚鼠全脊髓为抗原混合福氏完全佐剂（CFA）诱导Lewis大鼠EAE模型,观察实验动物神经功能损害的情况;利用免疫组织化学染色法观察实验动物组脑、脊髓组织中RHOA、ROCK-II、以及CD8+T细胞的表达。 结果 成功建立Lewis大鼠EAE模型,A、B、C、D、E五组中RhoA、Rock-II以及CD8细胞在脑、脊髓组织均有表达,在免疫后21天达高峰,在免疫后及法舒地尔干预组的脑、脊髓组织中表达较空白对照组明显增加,差异有显著性（P<0.05）;法舒地尔干预组RhoA、Rock-II以及CD8细胞在脑、脊髓组织的表达较免疫后各个时间点有所减轻,差异有显著性（P<0.05）;免疫后第13天组与免疫后35天组比较,差异无显著性（P>0.05）。 结论 Rho激酶抑制剂可以抑制EAE的病情进展、减轻神经元及轴索损害,其机制可能是抑制了Rho激酶参与白细胞及巨噬细胞迁移、浸润、吞噬过程;抑制Rho信号转导通路对细胞骨架的调节作用,而起到促进轴突再生、保护神经元的作用。