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自 1992年对家族性高胆固醇血症病人进行第 1例肝脏疾病基因治疗以来 ,对肝脏疾病基因治疗的研究已经成为目前国内外研究的热点之一。肝脏是体内多种物质的主要代谢场所 ,并能合成多种血浆蛋白质 ,且具有强大的再生能力 ,因而肝脏是基因治疗理想的靶器官。许多肝脏疾病 ,特别是由于单基因缺陷所致的代谢性疾病 ,为肝脏基因治疗的理想疾病 ,如α1 胰蛋白酶缺陷症、遗传性酪氨酸血症、Crigler Najjar综合征等 ,为肝脏疾病的基因治疗提供了广阔的应用前景。1 基因转染的载体载体是治疗性遗传物质的携带者或运输工具 ,理想的治疗… 相似文献
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人midkine基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 构建人中期因子(MDK)基因重组逆转录病毒载体,转染人胃癌SGC7901细胞株,为探讨MDK的生物学功能奠定基础.方法 扩增人MDK编码序列基因片段,经限制性内切酶酶切后将目的 片段插入pLXSN逆转录病毒载体.经酶切及测序鉴定后与pVSVG共转染GP293包装细胞,收集病毒上清感染人胃癌SGC7901细胞,G418筛选获得阳性细胞株.,结果酶切及DNA测序证实MDK基因重组逆转录病毒载体构建正确.病毒上清感染SGC7901细胞,G418筛选出阳性克隆,经实时定量PCR及Western blot检测发现SGC7901细胞中MDK mRNA及蛋白表达水平明显上调.结论 成功构建了高表达MDK的SGC7901细胞株,为进一步探讨其生物学功能奠定实验基础. 相似文献
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临床上对肿瘤的治疗多采用联合化疗 ,因此将不同耐药谱系的多个基因导入造血干 /祖细胞可对该类细胞提供多重保护 ,对防止骨髓抑制 ,提高化疗药物剂量 ,增强疗效 ,具有重要意义[1,2 ] 。六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶 (MGMT)是决定细胞对亚硝基脲药物耐受性的分子基础。我们从人肝组织克隆了MGMT基因 ,采用新近发展起来的多基因表达技术[3] ,将MGMT与MDR1基因同时构建在含内核糖体进入位点 (IRES)多顺反子逆转录病毒表达载体上 ,转导脐血CD34 细胞 ,进行 2种不同耐药基因的表达研究。一、材料和方法1 主要试剂 :DN… 相似文献
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【目的】构建携HBx基因的逆转录病毒载体 ,为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】采用PCR技术从HBV全基因组中扩增HBx基因 ;将HBx基因亚克隆至质粒pLNSX ,构建质粒 pLNSHBx ,磷酸钙 DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系PA317,检测培养上清病毒滴度。【结果】应用PCR技术成功地从HBV基因组中克隆出全长HBx基因 ,并经序列分析证实 ;建立了产病毒细胞株PA317/HBx ,检测其培养上清病毒滴度为 8.9× 10 4 CFU ,PCR证实重组病毒中含有HBx基因。【结论】成功构建了携HBx基因的较高滴度逆转录病毒载体。 相似文献
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目的:建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MCPH1表达的影响。方法: 将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰逆转录病毒载体pSiRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白表达的变化。结果:重组pSiRNA-MCPH1质粒经测序鉴定正确;重组逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western印迹检测人MCPH1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论:携带人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MCPH1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。 相似文献
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目的:建立一个表达人生长激素(hGH)的重组逆转录病毒载体转移系统,为下一步研究做准备工作。方法:通过重组DNA技术,用Eco R I酶切载有人生长激素的质粒pNMG3,获得约3.9kb的小鼠金属硫蛋白启动子(mMT-1)和人生长激素(hGH)基因片段,将其亚克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN中。对阳性重组子LXSNhGH进行酶切和PCR鉴定。利用目的基因片段上的Bg/Ⅱ和载体pLXSN的多克隆位点中的Bam H I酶切位点双酶切,正向重组子pLXSNhGH^ 应能产生约0.8kb和9.0kb2个片段;同时,应用巢式PCR鉴定目的片段,扩增片段大小约1.119kb,与预期结果相符。结果:表明人生长激素逆转录病毒表达载体构建成功。结论:人生长激素逆转录病毒表达载体的构建成功为GHD基因治疗的进一步研究奠定了基础。 相似文献
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目的:制备野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法:设计引物PCR扩增野生型p53cDNA,用T-A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109,提取pGEM-T/p53重组体,双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆人逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌 JM109,筛选pL(p53cDNA)SN重组体,脂质体法转染包装细胞AM12,G-418(geneticin)筛选,收集病毒液。结果:通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆,收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒。结论:含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究。 相似文献
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目的观察诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因转染对人喉鳞癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响,研究在体人喉鳞癌细胞中iNOS与突变型p53基因的表达,探讨二者的相关性及促进肿瘤细胞凋亡的机制。方法将iNOS基因转染人喉鳞癌Hep-2细胞并筛选出阳性克隆细胞进行扩增,制备荷瘤细胞小鼠模型,致瘤小鼠随机分为3组,转染组,转染空载体组,未转染组。应用逆转录-聚合酶链反应检测各组喉鳞癌组织中iNOS与p53 mRNA的表达,免疫组织化学检测各组喉鳞癌组织中iNOS与p53蛋白的表达,流式细胞术检测各组喉鳞癌组织中iNOS与p53蛋白、细胞凋亡及细胞周期的变化。结果转染组iNOS与p53蛋白及其mRNA的表达明显高于转染空载体组和未转染组,且iNOS与p53的表达呈明显的正相关(P<0.01)。转染空载体组和未转染组iNOS与p53蛋白及其mRNA的表达无明显差别。同转染空载体组和未转染组相比,转染组喉癌细胞发生了明显的G0/G1期阻滞,同时出现了明显的凋亡峰,瘤体积出现了明显的减小,转移发生率明显降低。结论iNOS基因转染能明显增加iNOS mRNA的表达从而增加了iNOS蛋白的表达,iNOS蛋白的表达使瘤细胞内合成大量的一氧化氮,从而诱导p53基因的大量表达,促进了肿瘤细胞凋亡,推测p53基因诱导肿瘤细胞凋亡的机制可能同细胞发生G0/G1期周期阻滞有关。 相似文献
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转染野生型p53基因对肝癌细胞生长的影响 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:通过转染野生型p53基因致肝癌细胞株BEL-7404,研究其对肝癌细胞的生长及凋亡作用。方法:野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌细胞株BEL-7404。用四甲基偶氮唑(MTT)法测定细胞生长曲线,用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果:肝癌细胞BEK-7404转染野生型p53基因后,其生长作用明显受到抑制.细胞生长抑制率在第4天可达50.8%。流式细胞仪分析细胞凋亡结果:阴性对照组为1.7%,转染pUHD10-3组为3.2%.转染pUHD10-3-p53组为40.7%。结论:野生型p53基因可诱导肝癌细胞BEL-7404的生长抑制及发生凋亡。 相似文献
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目的探讨人类错配修复基因hMSH2及p53在肺癌组织中的表达及意义。方法运用免疫组织化学SP法对56例肺癌组织中hMSH2及p53的表达进行检测。结果56例肺癌组织中hMSH2阳性表达率为28.6%,分化程度高者阳性率显著高于分化程度低者(P〈0.01),有淋巴结转移者hMSH2阳性率低于无淋巴结转移者(P〈0.05),不同病理组织学类型之间hMSH2表达差异无统计学意义(P〉0.05);56例肺癌组织中,p53阳性率为51.8%,分化程度低者p53阳性率高于分化程度高者(P〈0.05),有淋巴结转移者p53阳性率高于无淋巴结转移者(P〈0.01),不同病理组织学类型之间p53阳性率差异无统计学意义(P〉0.05);hMSH2阴性表达者的p53阳性率高于hMSH2阳性表达者(P〈0.05)。结论hMSH2基因的缺陷及p53的表达与肺癌的发生发展过程并与分化程度及有否淋巴结转移有关。 相似文献
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①目的 探讨抑癌基因PTEN和p5 3在胃癌组织中的表达及其与胃癌发生发展、临床病理特征之间的关系。②方法 应用免疫组织化学链霉亲和素方法 (SABC) ,检测PTEN和突变型p5 3基因在 6 5例胃癌组织、2 6例不典型增生胃黏膜、10例浅表性胃炎和 30例正常胃黏膜组织中的表达。③结果 胃癌组织中PTEN、突变型p5 3基因的阳性表达率分别为 4 8%、6 5 % ,不典型增生胃黏膜中PTEN、突变型p5 3基因的阳性表达率为 85 %、31% ,突变型p5 3基因在正常胃黏膜和浅表性胃炎组织中不表达 ,PTEN基因在正常胃黏膜和浅表性胃炎组织中全部呈阳性表达。胃癌组织中PTEN基因、p5 3基因的表达与其在正常胃黏膜组织、不典型增生胃黏膜、浅表性胃炎组织中的表达差别有显著性 (uc=2 .6 1~ 4 .5 2 ,P <0 .0 5 ) ;随临床分期、胃癌分化程度降低、浸润深度加深、淋巴结的转移 ,突变型p5 3基因的阳性表达率逐渐上升 (χ2 =4 .388~ 8.76 4 ,P <0 .0 5 ) ,PTEN基因的阳性表达率逐渐降低 (χ2 =5 .4 91~ 8.0 2 0 ,P <0 .0 5 ) ;PTEN基因表达阳性的胃癌组织中突变型p5 3基因的阳性表达率显著低于PTEN基因表达阴性的胃癌组织 (χ2 =9.81,P <0 .0 5 )。④结论 PTEN和p5 3基因的异常表达与胃癌的发生有关 ;PTEN和p5 3基因可以作为判断胃癌生 相似文献
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目的:建立稳定表达外源野生型p53(wtp53)基因的人胆囊癌细胞系。方法:在脂质体lipofectamine^TM 2000介导下,将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入胆囊癌细胞系GBC—SD中。经G418筛选抗性克隆,扩大培养,建立转染克隆细胞系。用聚合酶链反应(PCR)证实外源野生型p53基因的整合,用反转录聚合酶链反应(RT—PCR)和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。结果:野生型p53基因成功地导入胆囊癌细胞系GBC—SD,转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。结论:GBC—SD胆囊癌细胞株能稳定表达外源野生型p53基因。 相似文献
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采用聚合酶链式反应——单链构象多态性溴乙锭染色法,分别检测43例卵巢肿瘤p53基因外显子5-8。结果显示:卵巢癌p53基因改变率高于良性肿瘤(P<0.05),p53基因改变见于交界性瘤及Ⅰ-Ⅳ期卵巢癌。提示p53基因改变与卵巢癌的发生密切相关;它可能参与卵巢癌变的机制,同时可发生在卵巢癌的早期,并对其发展过程中起作用。 相似文献
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为了解肝细胞癌(HCC)中p53基因的突变情况,收集86例HCC手术切除标本,采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR/SSCP)、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR/RFLP)和DNA序列分析,研究了p53基因的突变情况。86例HCC中,p53基因的突变率为36%,其中,密码子249的突变率为33.7%,1例SSCP和RFLP均提示密码子249存在突变者经DNA序列分析显示密码子249的第三个碱基发生了AGG/ArgAGT/Ser突变。以上结果提示,HCC中,p53基因的突变主要以点突变为主,主要发生在密码子249,其突变率、突变谱和突变方式与启东等HCC高度流行区相似 相似文献
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p53基因突变与贲门癌的关系及其临床病理意义 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 研究p53基因突变在贲门癌中的作用及其临床病理意义。方法 银染聚合酶链反应-单链构像多态性分析法(PCR-SSCP)检测贲门癌新鲜冰冻组织中p53基因5-8外显子点突变情况。结果 PCR-SSCP检测p53基因5-8外显子点突变率为52.6%(20/38),以第8外显子出现突变的频率最高。其中有淋巴结转移者的p53基因突变率(70.6%)较无淋巴结转移者的突变率(38.1%)高(P<0.05),除此以外,p53基因突变率与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度及组织类型等均无明显相关性(P>0.05)。结论 p53基因突变是贲门癌常见的分子事件,并可能是导致贲门癌野生型p53功能丧失的重要遗传改变,p53基因突变与贲门癌淋巴结转移之间有相关性,提示检测p53基因突变对估计该肿瘤的预后可能有所帮助。 相似文献
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为研究人乳头瘤病毒16和18型(HPV16和HPV18)感染及p53基因突变与肺癌的关系,应用经病理学证实的肺癌活组织,行聚合酶链反应(PCR)检测癌组织中的HPV16、HPV18;并用LSAB免疫组化法检测相应蜡块标本中p53蛋白的过度表达。在48例肺癌组织标本中未检出HPV16、HPV18;p53蛋白表达呈阳性,阳性率为54.2%(26/48),其中鳞癌66.7%(18/27),腺癌57.1(4/7),小细胞癌33.3%(1/3),大细胞癌33.3%(2/6),类癌20.0%(1/5)。提示肺癌的发生可能与HPV16、HPV18感染无关,而与p53基因突变有关,尤以与鳞癌和腺癌关系密切 相似文献