以逆转录病毒为载体进行肝脏基因转染的研究进展

自 1992年对家族性高胆固醇血症病人进行第 1例肝脏疾病基因治疗以来 ,对肝脏疾病基因治疗的研究已经成为目前国内外研究的热点之一。肝脏是体内多种物质的主要代谢场所 ,并能合成多种血浆蛋白质 ,且具有强大的再生能力 ,因而肝脏是基因治疗理想的靶器官。许多肝脏疾病 ,特别是由于单基因缺陷所致的代谢性疾病 ,为肝脏基因治疗的理想疾病 ,如α1 胰蛋白酶缺陷症、遗传性酪氨酸血症、Ｃｒｉｇｌｅｒ Ｎａｊｊａｒ综合征等 ,为肝脏疾病的基因治疗提供了广阔的应用前景。1　基因转染的载体载体是治疗性遗传物质的携带者或运输工具 ,理想的治疗…     

人midkine基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建人中期因子(MDK)基因重组逆转录病毒载体,转染人胃癌SGC7901细胞株,为探讨MDK的生物学功能奠定基础.方法 扩增人MDK编码序列基因片段,经限制性内切酶酶切后将目的 片段插入pLXSN逆转录病毒载体.经酶切及测序鉴定后与pVSVG共转染GP293包装细胞,收集病毒上清感染人胃癌SGC7901细胞,G418筛选获得阳性细胞株.,结果酶切及DNA测序证实MDK基因重组逆转录病毒载体构建正确.病毒上清感染SGC7901细胞,G418筛选出阳性克隆,经实时定量PCR及Western blot检测发现SGC7901细胞中MDK mRNA及蛋白表达水平明显上调.结论 成功构建了高表达MDK的SGC7901细胞株,为进一步探讨其生物学功能奠定实验基础.     

多药耐药基因多顺反子逆转录病毒载体的构建及转染人脐血CD34+细胞的研究

临床上对肿瘤的治疗多采用联合化疗 ,因此将不同耐药谱系的多个基因导入造血干 /祖细胞可对该类细胞提供多重保护 ,对防止骨髓抑制 ,提高化疗药物剂量 ,增强疗效 ,具有重要意义[1,2 ] 。六氧甲基鸟嘌呤ＤＮＡ甲基转移酶 (ＭＧＭＴ)是决定细胞对亚硝基脲药物耐受性的分子基础。我们从人肝组织克隆了ＭＧＭＴ基因 ,采用新近发展起来的多基因表达技术[3] ,将ＭＧＭＴ与ＭＤＲ1基因同时构建在含内核糖体进入位点 (ＩＲＥＳ)多顺反子逆转录病毒表达载体上 ,转导脐血ＣＤ34 细胞 ,进行 2种不同耐药基因的表达研究。一、材料和方法1 主要试剂 :ＤＮ…     

携HBx基因逆转录病毒载体的构建

【目的】构建携HBx基因的逆转录病毒载体 ,为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】采用PCR技术从HBV全基因组中扩增HBx基因 ;将HBx基因亚克隆至质粒pLNSX ,构建质粒 pLNSHBx ,磷酸钙 DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系PA317,检测培养上清病毒滴度。【结果】应用PCR技术成功地从HBV基因组中克隆出全长HBx基因 ,并经序列分析证实 ;建立了产病毒细胞株PA317/HBx ,检测其培养上清病毒滴度为 8.9× 10 4 CFU ,PCR证实重组病毒中含有HBx基因。【结论】成功构建了携HBx基因的较高滴度逆转录病毒载体。     

人野生型P53基因真核表达载体的构建及其转染胃癌细胞后对胃癌细胞的影响

人野生型Ｐ５３基因真核表达载体的构建及其转染胃癌细胞后对胃癌细胞的影响赵亚刚１，张学庸１，惠宏襄２，赵永同２，王成济２（１第四军医大学西京医院消化内科，西安７１００３３，２第四军医大学生物化学教研室）关键词Ｐ５３基因，逆转录病毒载体，基因治疗，流式细...     

人MCPH1基因shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MCPH1表达的影响。方法: 将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰逆转录病毒载体pSiRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白表达的变化。结果:重组pSiRNA-MCPH1质粒经测序鉴定正确;重组逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western印迹检测人MCPH1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论:携带人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MCPH1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

表达人生长激素的逆转录病毒载体的构建

目的：建立一个表达人生长激素（hGH)的重组逆转录病毒载体转移系统，为下一步研究做准备工作。方法:通过重组DNA技术，用Eco R I酶切载有人生长激素的质粒pNMG3，获得约3.9kb的小鼠金属硫蛋白启动子（mMT-1)和人生长激素（hGH)基因片段，将其亚克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN中。对阳性重组子LXSNhGH进行酶切和PCR鉴定。利用目的基因片段上的Bg/Ⅱ和载体pLXSN的多克隆位点中的Bam H I酶切位点双酶切，正向重组子pLXSNhGH^ 应能产生约0.8kb和9.0kb2个片段；同时，应用巢式PCR鉴定目的片段，扩增片段大小约1.119kb，与预期结果相符。结果：表明人生长激素逆转录病毒表达载体构建成功。结论：人生长激素逆转录病毒表达载体的构建成功为GHD基因治疗的进一步研究奠定了基础。     

含野生型p53cDNA重组逆转录病毒的制备

目的：制备野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法：设计引物PCR扩增野生型p53cDNA，用T－A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109，提取pGEM-T/p53重组体，双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆人逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌 JM109，筛选pL(p53cDNA)SN重组体，脂质体法转染包装细胞AM12，G－418（geneticin)筛选，收集病毒液。结果：通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆，收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒。结论：含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究。     

iNOS转基因诱导裸鼠移植瘤细胞凋亡及其与p53表达相关性的实验研究

目的观察诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因转染对人喉鳞癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响,研究在体人喉鳞癌细胞中iNOS与突变型p53基因的表达,探讨二者的相关性及促进肿瘤细胞凋亡的机制。方法将iNOS基因转染人喉鳞癌Hep-2细胞并筛选出阳性克隆细胞进行扩增,制备荷瘤细胞小鼠模型,致瘤小鼠随机分为3组,转染组,转染空载体组,未转染组。应用逆转录-聚合酶链反应检测各组喉鳞癌组织中iNOS与p53 mRNA的表达,免疫组织化学检测各组喉鳞癌组织中iNOS与p53蛋白的表达,流式细胞术检测各组喉鳞癌组织中iNOS与p53蛋白、细胞凋亡及细胞周期的变化。结果转染组iNOS与p53蛋白及其mRNA的表达明显高于转染空载体组和未转染组,且iNOS与p53的表达呈明显的正相关(P<0.01)。转染空载体组和未转染组iNOS与p53蛋白及其mRNA的表达无明显差别。同转染空载体组和未转染组相比,转染组喉癌细胞发生了明显的G0/G1期阻滞,同时出现了明显的凋亡峰,瘤体积出现了明显的减小,转移发生率明显降低。结论iNOS基因转染能明显增加iNOS mRNA的表达从而增加了iNOS蛋白的表达,iNOS蛋白的表达使瘤细胞内合成大量的一氧化氮,从而诱导p53基因的大量表达,促进了肿瘤细胞凋亡,推测p53基因诱导肿瘤细胞凋亡的机制可能同细胞发生G0/G1期周期阻滞有关。     

转染野生型p53基因对肝癌细胞生长的影响

目的：通过转染野生型p53基因致肝癌细胞株BEL-7404，研究其对肝癌细胞的生长及凋亡作用。方法：野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌细胞株BEL-7404。用四甲基偶氮唑（MTT）法测定细胞生长曲线，用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果：肝癌细胞BEK-7404转染野生型p53基因后，其生长作用明显受到抑制．细胞生长抑制率在第4天可达50．8％。流式细胞仪分析细胞凋亡结果：阴性对照组为1．7％，转染pUHD10-3组为3．2％．转染pUHD10-3-p53组为40．7％。结论：野生型p53基因可诱导肝癌细胞BEL-7404的生长抑制及发生凋亡。     

人类错配修复基因hMSH2及p53在肺癌组织中的表达及意义

目的探讨人类错配修复基因hMSH2及p53在肺癌组织中的表达及意义。方法运用免疫组织化学SP法对56例肺癌组织中hMSH2及p53的表达进行检测。结果56例肺癌组织中hMSH2阳性表达率为28.6%,分化程度高者阳性率显著高于分化程度低者（P〈0.01）,有淋巴结转移者hMSH2阳性率低于无淋巴结转移者（P〈0.05）,不同病理组织学类型之间hMSH2表达差异无统计学意义（P〉0.05）;56例肺癌组织中,p53阳性率为51.8%,分化程度低者p53阳性率高于分化程度高者（P〈0.05）,有淋巴结转移者p53阳性率高于无淋巴结转移者（P〈0.01）,不同病理组织学类型之间p53阳性率差异无统计学意义（P〉0.05）;hMSH2阴性表达者的p53阳性率高于hMSH2阳性表达者（P〈0.05）。结论hMSH2基因的缺陷及p53的表达与肺癌的发生发展过程并与分化程度及有否淋巴结转移有关。     

胃癌组织中PTEN和p53基因的表达

①目的　探讨抑癌基因PTEN和p5 3在胃癌组织中的表达及其与胃癌发生发展、临床病理特征之间的关系。②方法　应用免疫组织化学链霉亲和素方法 (SABC) ,检测PTEN和突变型p5 3基因在 6 5例胃癌组织、2 6例不典型增生胃黏膜、10例浅表性胃炎和 30例正常胃黏膜组织中的表达。③结果　胃癌组织中PTEN、突变型p5 3基因的阳性表达率分别为 4 8%、6 5 % ,不典型增生胃黏膜中PTEN、突变型p5 3基因的阳性表达率为 85 %、31% ,突变型p5 3基因在正常胃黏膜和浅表性胃炎组织中不表达 ,PTEN基因在正常胃黏膜和浅表性胃炎组织中全部呈阳性表达。胃癌组织中PTEN基因、p5 3基因的表达与其在正常胃黏膜组织、不典型增生胃黏膜、浅表性胃炎组织中的表达差别有显著性 (uc=2 .6 1～ 4 .5 2 ,P <0 .0 5 ) ;随临床分期、胃癌分化程度降低、浸润深度加深、淋巴结的转移 ,突变型p5 3基因的阳性表达率逐渐上升 (χ2 =4 .388～ 8.76 4 ,P <0 .0 5 ) ,PTEN基因的阳性表达率逐渐降低 (χ2 =5 .4 91～ 8.0 2 0 ,P <0 .0 5 ) ;PTEN基因表达阳性的胃癌组织中突变型p5 3基因的阳性表达率显著低于PTEN基因表达阴性的胃癌组织 (χ2 =9.81,P <0 .0 5 )。④结论　PTEN和p5 3基因的异常表达与胃癌的发生有关 ;PTEN和p5 3基因可以作为判断胃癌生     

稳定表达外源野生型p53基因人胆囊癌细胞系的建立和鉴定

目的：建立稳定表达外源野生型p53（wtp53）基因的人胆囊癌细胞系。方法：在脂质体lipofectamine^TM 2000介导下，将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入胆囊癌细胞系GBC—SD中。经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用聚合酶链反应（PCR）证实外源野生型p53基因的整合，用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。结果：野生型p53基因成功地导入胆囊癌细胞系GBC—SD，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。结论：GBC—SD胆囊癌细胞株能稳定表达外源野生型p53基因。     

p53基因在卵巢肿瘤中的改变

采用聚合酶链式反应——单链构象多态性溴乙锭染色法，分别检测４３例卵巢肿瘤ｐ５３基因外显子５－８。结果显示：卵巢癌ｐ５３基因改变率高于良性肿瘤（Ｐ＜０．０５），ｐ５３基因改变见于交界性瘤及Ⅰ－Ⅳ期卵巢癌。提示ｐ５３基因改变与卵巢癌的发生密切相关；它可能参与卵巢癌变的机制，同时可发生在卵巢癌的早期，并对其发展过程中起作用。     

肝细胞癌患者中p53基因的突变研究

为了解肝细胞癌（ＨＣＣ）中ｐ５３基因的突变情况，收集８６例ＨＣＣ手术切除标本，采用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ／ＳＳＣＰ）、聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（ＰＣＲ／ＲＦＬＰ）和ＤＮＡ序列分析，研究了ｐ５３基因的突变情况。８６例ＨＣＣ中，ｐ５３基因的突变率为３６％，其中，密码子２４９的突变率为３３．７％，１例ＳＳＣＰ和ＲＦＬＰ均提示密码子２４９存在突变者经ＤＮＡ序列分析显示密码子２４９的第三个碱基发生了ＡＧＧ／ＡｒｇＡＧＴ／Ｓｅｒ突变。以上结果提示，ＨＣＣ中，ｐ５３基因的突变主要以点突变为主，主要发生在密码子２４９，其突变率、突变谱和突变方式与启东等ＨＣＣ高度流行区相似     

p53基因突变与贲门癌的关系及其临床病理意义

目的 研究p53基因突变在贲门癌中的作用及其临床病理意义。方法 银染聚合酶链反应－单链构像多态性分析法（PCR－SSCP）检测贲门癌新鲜冰冻组织中p53基因5－8外显子点突变情况。结果 PCR－SSCP检测p53基因5－8外显子点突变率为52．6％（20／38）,以第8外显子出现突变的频率最高。其中有淋巴结转移者的p53基因突变率（70．6％）较无淋巴结转移者的突变率（38．1％）高（P＜0．05）,除此以外,p53基因突变率与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度及组织类型等均无明显相关性（P＞0．05）。结论 p53基因突变是贲门癌常见的分子事件,并可能是导致贲门癌野生型p53功能丧失的重要遗传改变,p53基因突变与贲门癌淋巴结转移之间有相关性,提示检测p53基因突变对估计该肿瘤的预后可能有所帮助。     

HPV16、HPV18感染及p53蛋白过度表达与肺癌的相关性研究

为研究人乳头瘤病毒１６和１８型（ＨＰＶ１６和ＨＰＶ１８）感染及ｐ５３基因突变与肺癌的关系，应用经病理学证实的肺癌活组织，行聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测癌组织中的ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８；并用ＬＳＡＢ免疫组化法检测相应蜡块标本中ｐ５３蛋白的过度表达。在４８例肺癌组织标本中未检出ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８；ｐ５３蛋白表达呈阳性，阳性率为５４．２％（２６／４８），其中鳞癌６６．７％（１８／２７），腺癌５７．１（４／７），小细胞癌３３．３％（１／３），大细胞癌３３．３％（２／６），类癌２０．０％（１／５）。提示肺癌的发生可能与ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８感染无关，而与ｐ５３基因突变有关，尤以与鳞癌和腺癌关系密切