福建省狂犬病毒的N基因序列分析

目的了解福建省狂犬病毒流行毒株的基因分型和遗传进化关系,以及流行毒株与疫苗株在N基因核苷酸和氨基酸水平的差异。方法采集福建省不同时间、不同地区的犬脑组织标本共89份,通过RT-nested-PCR扩增、纯化、克隆、测序,获得19条包含N基因全长的序列,采用生物学软件进行序列整理分析。结果根据N基因核苷酸和推导的氨基酸的同源性,把福建省已知狂犬病毒分为3个群组,群组间具有显著的地域分布特征,各群组内部N基因核苷酸和氨基酸同源性分别在99.7%～100%和98.9%～100%之间,群组间N基因核苷酸和氨基酸同源性在86.4%～89.3%和95.3%～98.4%之间。福建省狂犬病毒的流行毒株与目前使用的各种疫苗株N基因序列同源性在86.5%～98.9%之间。结论福建省境内存在表观健康犬携带狂犬病毒现象,福建省已知狂犬病毒流行毒株均属于基因I型,可分为3个群组。从N基因序列的分析上看,我省目前使用疫苗能有效地保护流行毒株的感染。     

山东省4株狂犬病病毒核蛋白基因序列分析

目的通过对山东省4株狂犬病病毒核蛋白(N)全基因序列的测定与分析,了解近年山东省狂犬病病毒流行株的遗传变异情况。方法直接免疫荧光法(DFA)和RT-PCR法检测2007-2008年在山东省采集的14份疑似狂犬病病毒感染的犬脑组织标本,检测阳性标本进行N基因序列测定、序列同源性比较和种系发生分析。结果 DFA和RT-PCR法检测均为阳性的标本为12份,其中4份得到N基因编码区全序。4株病毒N基因核苷酸序列的同源性在97.9%～99.9%之间,推导出的氨基酸序列同源性为98.7%～99.8%。结论近年山东省狂犬病病毒具有地域性特征,进化变异不大,与我国各地流行株相近。     

河南省8株狂犬病毒磷蛋白基质蛋白基因分析

目的分析河南省8株狂犬病毒磷蛋白P及基质蛋白M的基因序列,探讨狂犬病毒流行株毒力与致病性变异的可能原因。方法以免疫荧光法检测2006年采自河南省的121份犬脑,取阳性犬脑组织悬液接种鼠脑分离病毒,以RT-nest-edPCR法扩增病毒P与M基因,克隆测序后进行生物信息学分析。结果分离到8株狂犬病毒,序列分析表明8株病毒均为基因1型狂犬病毒,8株病毒彼此之间P基因与M基因核苷酸序列同源性均为98.9%～99.8%,推导的氨基酸序列同源性分别为98.0%～99.3%和97.0%～99.5%。8株病毒与我国宁夏分离株CNX8511、CNX8601的同源性最高,P基因与M基因核苷酸同源性分别为89.1%～89.7%和91.1%～92.0%,氨基酸同源性分别为93.3%～94.3%和96.6%～98.0%。在核苷酸及氨基酸水平上,8株病毒与CTN疫苗株的P与M同源性均明显高于与其它疫苗株的相应同源性。系统发育分析表明,8株病毒与我国宁夏街毒株、CTN疫苗株、泰国及菲律宾等东南亚株进化关系最近,而与CTN以外的其它疫苗株、标准攻击毒CVS株,以及我国80年代初分离的DRV、MRV株进化关系较远。氨基酸对位分析表明,较之参比的其它基因1型毒株,河南省8株狂犬病毒的P与M出现多处变异。结论8株狂犬病毒仍属基因1型狂犬病毒,但其P基因及M基因在核苷酸及推导的氨基酸水平上均出现了明显变异。     

狂犬病毒糖蛋白研究进展

狂犬病是由狂犬病毒（Rabies virus．RV）引起的人兽共患传染病,一旦发病,病死率几乎100％,是人类病死率最高的急性传染病。狂犬病毒是单股负链RNA病毒。病毒基因组长约12kb．由3’端至5’端依次排列着N、P、M、G和L5个狂犬病毒的结构基因,分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录酶大蛋白。由G基因编码的糖蛋白,是病毒与宿主细胞结合的配体,介导了病毒与靶细胞的结合及在神经系统的分布,不但与病毒的毒力、致病性密切相关,而且是狂犬病毒的主要保护性抗原,能刺激机体产生中和抗体,保护机体抵抗病毒的感染。本文结合我们的研究工作,对近年来狂犬病毒糖蛋白的研究进展作一综述。     

狂犬病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的构建狂犬病毒核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于狂犬病的检测及诊断。方法应用RT-PCR方法扩增ERA株狂犬病毒NP基因后克隆到PCR2.1TA载体,转化OneShortTMTOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用KpnΙ和NotΙ双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast ERA-NP重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后,转化到DH10BacTME.coli感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h收获细胞,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析。结果构建了含有ERA NP基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中获得表达。结论本研究成功表达出了具有免疫原性的狂犬病毒核蛋白。     

狂犬病毒HEP-dG株的拯救

目的筛选免疫原性高、致病性低的狂犬病疫苗候选株。方法应用反向遗传技术,在狂犬病毒弱毒株HEP-Flury株全基因组3'-N-P-M-G-L-5'的假基因区域(G与L之间),插入一个G基因,构建携带双G基因的全长感染性克隆,其与辅助质粒共转染BHK-21细胞,盲传十代,用荧光抗体和RT-PCR鉴定病毒。结果成功获得携带双G基因的狂犬病毒HEP-dG株,该病毒在BHK-21细胞中稳定生长,其病毒滴度达到1010FFU/mL。结论HEP-dG株会为研制高效的狂犬病病毒基因工程口服疫苗提供了良好的疫苗候选株。     

河南省九株狂犬病毒的糖蛋白基因序列分析

目的 了解河南省狂犬病毒与人用、兽用狂犬病疫苗株在糖蛋白基因核苷酸和氨基酸序列水平上的差异,为有效控制狂犬病疫情提供初步的科学依据.方法 以反转录-半套式聚合酶链反应(RT-heminested-PCR)扩增2006年12月分离自河南省信阳市的9株狂犬病毒街毒株,经纯化、克隆、测序后获得9条糖蛋白基因全长序列,采用生物信息学软件构建基因系统发育树,对糖蛋白基因序列和氨基酸序列进行分析.结果 9株狂犬病毒糖蛋白在核苷酸及氨基酸序列水平上彼此的同源性分别为97.6%～98.9%和99.2%～99.8%;9株病毒与CTN疫苗的同源性最高,其核苷酸及氨基酸同源性分别为85.6%～93.0%和91.9%～92.9%;9株病毒与其他疫苗株相比,其核苷酸及氨基酸同源性分别为80.4%～83.3%和87.7%～92.5%;与已知的基因1型狂犬病毒比较,9株病毒糖蛋白氨基酸序列发生了若干位点的氨基酸取代.结论 9株河南省狂犬病毒街毒株均属基因1型,CTN疫苗株可能为目前我国河南省所流行的狂犬病提供较好的保护效果.     

狂犬病毒核蛋白基因的克隆及表达

目的获得狂犬病毒CVS株核蛋白(N)基因并在大肠杆菌中表达,为进一步研发狂犬血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增狂犬病毒CVS株核蛋白测序、并定向克隆入原核表达载体pET-28a,构建原核重组表达质粒pET-28a-N,转化大肠杆菌E.coliBL21,并经IPTG诱导在大肠杆菌中表达CVS株核蛋白。结果与结论扩增的CVS株N基因与发表的CVS株N基因序列完全一致,并在大肠杆菌中得到了高效表达,且表达产物具有免疫反应性,为进一步研发狂犬血清学检测试剂盒提供了抗原。     

狂犬病毒分子生物学及遗传变异性研究进展

狂犬病毒属于弹状病毒科（Ｒｈａｂｄ－ｄｏｖｉｒｉｄａｅ）狂犬病毒属（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ），是可以引起人和多种动物致死性中枢神经系统感染，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等临床表现为特征的病原体。许多动物既是储存宿主又作为传播媒介在世界范围内维系并传播着...     

狂犬病毒疫苗株CTN-1八代次N和G基因序列测定及分析

目的测定八个代次CTN-1疫苗株核蛋白（N）和糖蛋白（G）基因序列，并与代表性疫苗株和街毒株进行比较。方法用RT-PCR反应扩增八代次CTN-1的N和G基因，获得cDNA，进行序列测定。结果八个代次CTN-1的N和G基因序列与其它疫苗株比较，核苷酸的同源性分别为82．7％～84．5％和86．6％～88．5％，氨基酸同源性分别为88．9％～92．5％和95．3％～98．2％；与在我国分离的街毒株相比，核苷酸的同源性分别为84．2％～95．0％和80．4％～94．3％，氨基酸同源性分别为92．1％～99．6％和88．7％～98．5％。CTN-1株八个代次之间的核苷酸序列几乎完全相同。结论CTN-1株在传代过程中N和G基因变异小，与中国流行的代表性街毒株的同源性高于其它疫苗株。     

云南省2006-2010年狂犬病病毒N和G基因分子结构特征分析

目的了解云南省狂犬病毒的流行情况以及街毒株N、G基因结构特征,为有效控制狂犬病疫情提供初步科学依据。方法对云南省2006-2010年10株狂犬病街毒株N、G基因进行全基因克隆、测序,并与已知国内外代表毒株核苷酸及推导氨基酸进行序列比对及系统发育分析。结果序列分析表明所研究的10个云南毒株与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ型代表毒株N、G基因核苷酸序列同源性分别为72.1%～78.5%、58.4%～71.0%,与基因Ⅰ型毒株序列同源性为85.2%～90.1%、82.7～99.6%,云南毒株之间核苷酸序列同源性为89.3%～99.2%、86.0～99.6%。云南10个毒株均为基因Ⅰ型和血清1型毒株,分为2个进化分支,除YNTC06与GXN119和HM88单独属于分支Ⅲ外,其余云南毒株均分布在分支Ⅰ上,且进一步分为3个小亚分支。遗传进化分析表明,各毒株氨基酸位点均存在不同程度的变异,其中YNTC06在360、369、375等多个NP抗原位点存在变异;云南毒株在GP330、333位毒力决定位点未发生变异,均为强毒株。结论云南狂犬病毒属于基因Ⅰ型,存在2个分支;云南狂犬病毒NP和GP存在特异性氨基酸变异位点,其基因结构及变异、亚组群划分与地理位置无相关性。     

中国12株狂犬病街毒株G基因序列测定与分析

目的了解中国狂犬病毒的流行情况以及街毒株与中国人用、兽用狂犬病疫苗株在G基因核苷酸和氨基酸水平的差异,为有效控制狂犬病疫情提供初步科学依据。方法对12株街毒株G基因进行了全基因测序,与其它36株中国狂犬病街毒株,以及中国的疫苗株和其它国家毒株的G基因序列进行了综合分析。结果序列分析表明来源于中国的50株狂犬病毒均为基因Ⅰ型狂犬病毒;其中具有代表性的6株病毒与我国现在使用的各种疫苗株在G基因的核苷酸和氨基酸水平上均存在不同程度的差异,与我国人用疫苗株CTN同源性较高;进化分析表明,我国主要流行狂犬病毒与泰国、印度尼西亚、马来西亚等东南亚狂犬病毒株处于同一分支。中国毒株之间G基因核苷酸同源性分别≥82.3%;氨基酸同源性分别≥92.1%;中国街毒株与疫苗株相比较核苷酸的同源性为79.3%～94.2%,氨基酸的同源性为87.8%～97.9%。结论我国的狂犬病毒为基因Ⅰ型狂犬病毒,可以明确分为6个进化群。无论在核苷酸还是氨基酸水平上,中国多数街毒株与疫苗株CTN之间的同源性要高于与其它疫苗株。     

新疆羊狂犬病病毒的鉴定及N基因序列分析

目的 诊断疑似羊狂犬病病例并分析其病原分子N基因遗传进化关系.方法 采集新疆阿勒泰地区疑似狂犬病羊脑组织,以狂犬病病毒特异性目的基因（N基因）RT-PCR扩增和序列测定进行病毒鉴定;以DNAStar-Lasergene.v7.1软件拼接测定序列,应用BLAST软件分析N基因的遗传进化关系.结果 显示本研究鉴定的狂犬病毒阳性并获得了病毒全基因序列,建立了其N基因的遗传进化关系树,确定疑似的羊狂犬病病毒与狂犬病病毒基因I型俄罗斯C群的遗传关系较近.结论 应用RT-PCR方法对羊源狂犬病进行实验室诊断,获得该病原全基因序列,明确了新疆狂犬病病原和流行地域分布,为羊狂犬病毒分子流行病学研究奠定基础.     

2007年深圳市Yamagata系B型流感病毒基因特性的分析

目的分析2007年深圳市Yamagata系B型流感病毒血凝素(HA)基因的特性。方法将2007年深圳市分离到的Yamagata系B型流感毒株进行血凝素HA片段核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,用SIMMONIC软件和Mega软件对其进行分析。结果2007年在深圳市流行的Yamagata系B型流感病毒根据197-199位氨基酸的差异可以划分为A、B、C3个分支。分支C在197位上有糖基化位点的增加,而分支A、B则未在该区域呈现出糖基化位点的特征性结构。此外与今年的国内代表株B/Fujianxinluo/54/06相比,除了40号位点上的氨基酸变异为共同存在外,其余大多数的氨基酸点变异是散发存在的。部分的变异位点处在HA1区的抗原表位,可能会导致病毒的抗原性改变。结论2007年在深圳市流行的Yamagata系B型流感病毒与B/Fujianxinluo/54/06相比基因特性已发生变化,并呈现出多样性的变化趋势。     

我国各地区动物狂犬病街毒的检测及分析

目的 检测我国不同地区动物中狂犬病毒带毒率并分析糖蛋白编码基因序列.方法 El.ISA、免疫荧光法分别检测586份采集自中国不同地区的犬、猫,蝙蝠和野鼠脑标本和16份犬唾液中狂犬病街毒,阳性标本乳鼠颅内接种.并测序.结果 ELISA、免疫荧光法均在犬脑中分离到10株狂犬病街毒,其中贵州省113份犬脑中分离到2株病毒,湖南省62份犬脑中分离到2株病毒,武汉市70份犬脑中分离到2株病毒,江苏省85份犬脑中分离到4株病毒,沈阳市69份犬脑中未分离到狂犬病毒;79份猫脑、100份蝙蝠脑及8份鼠脑中未检出狂犬病街毒,16份犬唾液标本未检出狂犬病毒.在贵州省和武汉市,冬季采集的112份犬脑末检出狂犬病毒.春夏季采集的40份犬脑中,4份阳性.分离的10株狂犬病毒阳性株颅内接种乳鼠后.均发病死亡.所有分离株均属狂犬病毒基因1型,可分为4个亚组.结论 同一地区的狂犬病毒分离株以及相邻省份的狂犬病毒分离株的同源性十分接近,动物样本采集时间与狂犬病毒阳检率有关.     

两株犬源狂犬病病毒街毒株全基因组序列测定与分析

目的对2株犬源狂犬病病毒街毒株全基因组测序,了解国内狂犬病病毒的流行和变异情况。方法采用乳鼠脑内接种方法分离2株天津地区狂犬病病毒街毒株,RT-PCR扩增病毒DNA覆盖全基因组12个相互重叠的基因片段,PCR产物平端克隆后进行全基因组核苷酸序列测定,然后对其分子变异和进化特点进行分析。进行两分离株的序列相似性、氨基酸同源性、主要功能位点的变异比较和种系发生分析。结果 TJD04和TJD05两株狂犬病病毒全基因组长均为11 924 nts,全基因组序列的组成和结构均符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征。病毒基因组由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,氨基酸编码长度未发生变异,5个编码蛋白序列较少发生变化,仅有个别主要功能位点发生变异,且大部分变异均属于无意义沉默突变。多序列相似性比较和种系发生分析显示,两株病毒均属于基因1型,N基因与全基因进化树保持一致,与中国犬源狂犬病病毒BD06同源性最高(99.6%),进化关系近,并具有较为独特的中国地域特点。结论两天津株狂犬病毒可能是自然界中固有的狂犬病病毒街毒株。