应用基因芯片技术研究青少年特发性脊柱侧弯发病机制

[目的]应用基因芯片技术研究青少年特发性脊柱侧弯(AIS)来源的骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)成脂分化过程中差异表达基因,探究AIS的发病机制。[方法]分离培养AIS患儿及正常对照者BM-MSCs培养至第五代(P5),成脂诱导2周后利用基因芯片技术筛选差异表达基因,并利用RT-PCR技术验证芯片结果。[结果]在AIS及正常来源的BM-MSC成脂分化中共新发现229个基因存在显著差异表达。这些差异表达基因具有细胞粘附、转录调节及信号转导等多种功能。共新发现6条具有显著统计学意义的相关分子通路。[结论]AIS患儿BM-MSCs在成脂分化过程中的基因表达模式与正常对照相比存在明显差异。本研究新发现的差异表达基因及通路可能与AIS的发病相关,对其病因学研究具有重要意义,值得深入研究。     

Thrsp蛋白在青少年特发性脊柱侧弯患者MSCs成脂分化过程中的差异性表达和作用

[目的]比较青少年特发性脊柱侧凸(AIS)患者与正常人骨髓间充质干细胞的成脂分化过程中基因表达的差异。[方法]收集本院脊柱侧弯中心2011年12月~2012年12月收治的AIS患者20例的骨髓血,同时采集10例年龄段性别接近的志愿者骨髓血作为对照组。采用密度梯度离心法提取MSC细胞,培养至P3流式细胞仪定性。诱导成脂分化14 d后提取全RNA进行Affymetrix 3'IVT表达谱芯片检测。对主要检查结果进行RT-PCR验证,并且对结果中特异性高表达的Thrsp蛋白的表达情况进行Western blot检验。[结果]受试者骨髓血均成功采集分离,密度梯度离心分离MSCs并培养至P3,流式细胞仪验证其性质,成脂分化培养14 d后苏木红染色定性为脂肪细胞,提取全RNA电泳条带清晰,表达谱芯片检测结果显示AIS患者MSC在成脂分化过程中有111条基因表达上调,189条基因表达下调。Western blot检验结果显示Thrsp蛋白在脂肪细胞中高度表达。[结论]AIS来源MSCs成脂分化相关差异表达的300条基因可能参与了AIS的发生和发展,Thrsp基因可能是导致MSCs分化差异性的关键因素。     

应用高密度寡核苷酸(Oligo)基因芯片筛选胶质瘤相关基因

目的应用高密度寡核苷酸（Oligo）基因芯片技术筛选胶质瘤相关基因。方法抽提5例胶质瘤和10例正常脑组织的总RNA并逆转录为cDNA，其中Cy5、Cy3的dNTP分别掺人胶质瘤和正常脑组织的cDNA，混合后杂交含22000个人类基因人类高密度Oligo基因芯片，经过洗片和扫描，获得荧光信号图像并用计算机分析，随机抽取3种差异表达基因用PCR验证它们胶质瘤和正常脑组织中的差异表达。结果从22000条基因中筛选出差异表达基因242条，其中123条表达上调，119条表达下调，包括细胞周期蛋白、细胞凋亡、细胞骨架和运动蛋白等相关基因。结论基因芯片技术的胶质瘤基因表达谱分析能够高通量筛选胶质瘤相关基因，并高效对基因功能进行研究，有助于认识肿瘤发病机制。     

基因芯片法筛选膝骨关节炎滑膜相关差异表达基因

目的应用基因芯片技术筛选骨关节炎(OA)滑膜组织和正常滑膜组织的差异表达基因。方法体外分离OA与正常滑膜组织,经原代培养生长至四代的成纤维样滑膜细胞(FLS)用于实验。分别提取OA和正常FLS总RNA,反转录成cDNA,并以两种荧光Cy5和Cy3标记后作为探针,与覆盖21 073条人类基因的Agilent Human 1A表达谱芯片进行杂交,扫描芯片荧光信号图像后用基因图像分析软件进行数字化处理和分析。结果共筛选出显著表达的差异基因1403条,其中668种基因表达水平上调,735种基因表达水平下调。结论 OA发病是多基因共同作用的结果,OA与正常FLS差异表达的1403种基因可能参与了OA的发生和发展。对这些基因的进一步研究有望加深认识OA发病机制,找到新的疾病相关关键分子。     

骨折后外周血间充质干细胞浓度变化的实验研究

[目的]观察骨折后不同时间点外周血间充质干细胞(MSCs)浓度变化,并比较其与骨髓间充质干细胞生物学特性的异同.[方法]根据不同处理条件将SD大鼠分为:对照组和骨折组(骨折后1、3、7d共3组),每组20只.分别于骨折后1、3、7d抽取外周血,密度梯度离心法分离培养外周血MSCs,计数成纤维细胞集落形成单位(CFU-Fs)数.流式细胞仪检测细胞表面标记(CD44、CD90、CD34、CD45).成骨、成脂诱导,碱性磷酸酶、茜素红和油红染色检测其分化特性.[结果]原代外周血MSCs呈集落生长,骨折组集落数明显多于对照组,其中以骨折后3d组形成的集落数最多,具有显著差异(27.25±11.52 CFU-Fs/cuhure vs 2.80±3.96 CFU-Fs/culture,P＜0.01).外周血MSCs高表达CD44、CD90,低表达CD34、CD45,不同的是CD34小部分呈阳性(＜20％).与对照组骨髓MSCs的诱导结果相同,外周血MSCs成骨诱导后28 d出现钙结节,茜素红染色阳性;成脂诱导后21 d有大量脂滴出现,油红染色阳性.[结论]外周血体外密度梯度离心法分离培养的细胞具有多潜能分化的MSCs表面标记且可以向成骨、成脂分化.骨折后外周循环中MSCs数量明显增多,呈一定的时序性变化,可能参与骨折修复.     

人嗅鞘细胞与骨髓间充质干细胞体外共培养的实验研究

[目的]通过体外共培养观察人嗅鞘细胞(OECs)对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖分化的影响.[方法]取5个月以上引产胎儿嗅球及骨髓,分离培养及鉴定OECs及MSCs,携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的腺相关病毒转染标记OECs,双苯亚甲胺荧光染料标记MSCs,将两种细胞按1∶1比例进行共培养,MSCs单独培养组为阴性对照组,免疫细胞化学方法检测MSCs表达巢蛋白(nestin)、神经元特异性核蛋白(NeuN)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)情况.[结果]MOI值为1×106时OECs表达GFP阳性率为84.89％,对细胞生长活性无明显影响.共培养时两种细胞生长良好,共培养7d未见形态学改变,经复方丹参注射液诱导后部分MSCs呈现神经元样改变,表达nestin、NSE、NeuN、NF-M、GFAP特异性标志,且共培养组的分化率明显高于单独MSCs培养组,有显著性差异.[结论]OECs可通过分泌可溶性物质及细胞之间的相互作用启动MSCs分化程序,提高MSCs向神经细胞分化率.     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺样细胞过程中microRNA表达谱差异的分析

目的:利用微小RNA (microRNA)表达谱基因芯片检测新技术,寻找人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为汗腺样细胞(SGLCs)过程中的关键microRNAs及其介导的分子信号通路.方法:通过间接培养方法诱导MSCs分化为SGLCs后,利用microRNA基因芯片检测,分析MSCs诱导前后以及MSCs、SGLC与正常成人汗腺细胞(SGCs)之间microRNA差异表达谱,筛选出其中发生极其显著改变的microRNAs,通过microRNA靶点预测软件,进一步筛选出其中直接靶向与汗腺发育、干细胞分化相关基因的microRNAs及其靶基因.结果:microRNA表达谱的差异比对结果显示,SGLCs与MSCs相比,19个microRNAs上调,49个microRNAs下调;SGCs与MSCs相比,120个microRNAs上调,59个microRNAs下调.取SGLCs与MSCs差异表达谱和SGCs与MSCs差异表达谱的交集,发现37个microRNAs在以上两个差异表达谱中均出现,其中12个microRNAs上调,25个microRNAs下调,它们可直接靶向与汗腺发育和干细胞分化相关的CEA等多个细胞因子,并参与EDA/EDAR、NF-κB、Wnt、ERK等多个相关信号通路的调节.结论:通过生物信息学靶点分析,成功寻找到在MSCs分化为SGLCs的过程中,靶向汗腺发育和干细胞分化相关细胞因子和信号通路的关键microRNAs.     

pcDNA_(3.1)-OGP基因转染兔骨髓基质干细胞的表达及生物学效应的观察

[目的]观察成骨生长肽(osteogenic growth peptid,OGP)基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响.[方法]构建重组真核表达载体pcDNA_(3.1)-OGP,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞.通过G418筛选获得阳性克隆.用RT-PCR方法榆测OGP基因在骨髓基质干细胞内的表达.Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的检测观察转染pcDNA_(3.1)-OGP后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化情况.[结果]成功构建真核表达载体pcDNA_(3.1)-OGP,用RT-PCR方法及碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原检测证实OGP基因能在骨髓基质干细胞中表达并促进其向成骨细胞分化.[结论]经pcDNA_(3.1)-OGP转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达OGP,而且具有向成骨细胞系分化的特性.     

大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性和示踪标记

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,观察绿色荧光蛋白(GFP)基因通过慢病毒载体感染MSCs的表达.方法 采用原代贴壁法获得骨髓MSCs,观察细胞形态和生长变化,流式细胞仪鉴定细胞表面标志,体外诱导MSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化.采用含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因慢病毒载体感染培养的MSCs,比较细胞感染前后生物学特性.结果 原代贴壁筛选结合差异传代培养的MSCs表面标志阳性率分别为CD44 94.81%,CD90 99.53%,CD106 76.34%,MSCs在pH值稳定于7.2～7.4的环境可传20代.体外MSCs诱导分化后特异性染色显示脂质沉淀和骨结节,表达脂肪细胞和成骨细胞特异基因.慢病毒载体可有效感染大鼠MSCs,加入聚凝胺感染效率达到80%,EGFP在MSCs感染后1个月仍持续表达.结论 骨髓MSCs可长期培养,具有良好的多向分化能力.携带EGFP基因慢病毒载体能高效感染MSCs,EGFP可作为MSCs体内研究的示踪标记.     

氟烷肝毒性相关基因的鉴定

目的 鉴定氟烷肝毒性相关基因.方法 拟行肝血管瘤切除术的女性病人8例,随机分成2组(n=4):氧化亚氮复合麻醉组(C组)和氟烷复合麻醉组(H组).两组均于T8,9间隙行硬膜外穿刺,头向置管3.5 cm.C组麻醉诱导:吸入70%N2O,静脉注射琥珀酰胆碱2mg/kg后气管插管;麻醉维持:吸入70%N2O,硬膜外间断注射0.25%地卡因5 ml.H组麻醉诱导:吸入氟烷1.5 MAC及70%N2O后气管插管;麻醉维持:硬膜外间断注射0.125%地卡因5 ml,吸入氟烷1.5 MAC及70%N2O.两组术中静脉输注琥珀酰胆碱20～40μg·kg-1·min-1.切除血管瘤后,取血管瘤旁正常肝组织,抽提mRNA,并逆转录成cDNA,同时分别以Cy5-dUTP(H组)及Cy3-dUTP(C组)标记;将荧光标记的cDNA与基因芯片混合并杂交,然后扫描芯片,分析Cy5和Cy3荧光信号强度和比值,从组间及组内差异表达的基因中筛选氟烷肝毒性相关基因.结果 与C组比较,H组8 192条基因中差异表达的基因31条,主要包括肝脏代谢类基因、信号转导相关基因及应激相关基因等,其中13条高表达,18条低表达;与线粒体呼吸有关的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因及NADH脱氢酶基因低表达,Na+ -K+ -ATP酶基因低表达,而热休克蛋白70基因和血红素加氧酶-1基因高表达.结论 氟烷肝毒性相关基因包括肝脏代谢类基因、信号转导相关基因及应激相关基因.     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。     

Surgical correction of rupture of aneurysm of the sinus of Valsalva

Operations were performed on 48 patients with aneurysms of the thoracic aorta, one of them had a rupture of aneurysm of the noncoronary sinus followed by the formation of a fistula between the aorta and the right atrium. The fistula was ligated by an access through the right atrium with good nearest and long-term results.