Fe3O4纳米化颗粒标记人羊膜间充质干细胞的合适条件

目的：Fe3O4纳米化颗粒是近来发现的活体示踪剂，由于其毒性可导致标记细胞死亡，寻找合适的浓度进行细胞标记已成为活体示踪的关键。实验以人羊膜间充质干细胞作为靶点，探讨Fe3O4纳米化颗粒标记的合适条件。方法；实验于2007—08在郑州大学完成。①细胞来源及颗粒：人羊膜间充质干细胞由郑州大学第一临床医学院神经外科杨波教授自健康产妇胎盘羊膜中提取，产妇对实验知情同意，实验经医院医学伦理委员会批准。Fe3O4纳米颗粒由美国Sigma公司生产，商品名：菲立磁，批号094k0788。转染剂多聚左旋赖氨酸购自大连宝生生物公司，批号033K4351。②实验方法：向人羊膜间充质干细胞加入含10％胎牛血清、20μg／L碱性成纤维生长因子的DMEM／F12培养基，置于37℃、体积分数为0．05的CO2饱和湿度培养箱中培养，待细胞达80％～90％融合时胰酶消化传代。取传至第3代的细胞，放入含DMEM/F12培养基的10mL培养瓶中，密度调整为1×10^9L^-1。设立3组：单纯Fe3O4组分为4个亚组，即向培养基中分别加入终浓度为20，30，40，80mg／L的Fe3O4纳米颗粒；Fe3O4＋多聚左旋赖氨酸组分为4个亚组，即向培养基中分别加入上述终浓度Fe3O4纳米颗粒后，再加入1．5mg／L多聚左旋赖氨酸；培养基对照组，仅加入DMEM／F12培养基。各组细胞标记12h后，均更换为DMEM／F12培养基培养3周。③实验评估：分别于标记后12h、36h、1周和3周，普鲁士蓝染色检测Fe3O4纳米颗粒进入细胞情况，锥虫蓝染色检测细胞活性。结果：①Fe3O4纳米颗粒标记人羊膜间充质干细胞的效果：终浓度为20mg／L的Fe3O4纳米颗粒细胞标记率为60％，终浓度为30，40，80mg／L的Fe3O4纳米颗粒细胞标记率均为100％。单纯Fe3O4组可见少量蓝染的Fe3O4纳米化颗粒分散于细胞浆内，Fe3O4＋多聚左旋赖氨酸组蓝染颗粒明显增多，部分聚     

量子点标记神经生长因子纳米化颗粒修饰羊膜间充质干细胞移植治疗大鼠实验性脑损伤

目的:量子点是由Ⅱ-Ⅵ族元素或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米颗粒,因三维上受到量子限制而表现出独特的光学特征,其标记的神经生长因子纳米化颗粒由于是纳米级,易通过细胞生物膜.实验观察负载此纳米颗粒的羊膜间充质干细胞移植治疗大鼠脑损伤的效果.方法:实验于2007-01/10在郑州大学完成.①材料:SPF级健康成年Wistar大鼠40只,按体质量编号分为4组:神经生长因子细胞组、常规细胞组、损伤模型组、培养基对照组,10只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.羊膜间充质干细胞来自健康产妇胎盘羊膜,产妇对实验知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准.量子点神经生长因子纳米粒由兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室协助构建.②实验方法;向羊膜间充质干细胞中加入含10%胎牛血清、20 μg/L碱性成纤维生长因子的DMEM/F12培养基,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,待细胞达80%～90%融合时胰酶消化传代.取传至第3代细胞,分别加入终浓度为20,40,60 μg/L的量子点标记神经生长因子纳米粒进行修饰处理72 h,并设立空白对照和空载量子点对照.4组大鼠均采用Feeney自由落体法建立脑损伤模型,神经生长因子细胞组于大鼠损伤部位注入经40 mg/L量子点标记神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞悬液10 μL(约4.0×108 个细胞),常规细胞组注入等量单纯量子点标记的羊膜间充质干细胞悬液,培养基对照组注入等量DMEM/F12细胞培养基,损伤模型组不给予移植操作.③实验评估:经量子点标记的神经生长因子纳米粒修饰后,MTT法检测细胞活性,荧光显微镜观察量子点在细胞内的分布,免疫细胞化学鉴定细胞分化.细胞移植后对各组大鼠运动及感觉功能进行评分,免疫组织化学染色及荧光显微镜观察量子点荧光化羊膜间充质干细胞在脑内存活分化和迁移情况.结果:①细胞生长率:培养72 h后与空白对照和空载量子点对照细胞比较,20,40,60 μg/L量子点标记的神经生长因子纳米粒组细胞生长率均呈增长趋势,40 μg/L时细胞无明显生长抑制,达60 μg/L时增长有所减慢.②体外量子点分布:荧光显微镜连续观察羊膜间充质干细胞.约6 h后开始摄入量子点标记的神经生长因子纳米粒,随着时间延长摄入量逐渐增加,于32 h荧光强度达高峰.③体外免疫细胞化学鉴定:经量子点神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞表达神经元烯醇化酶和神经丝蛋白,向神经元方向分化,但不表达胶质纤维酸性蛋白.④神经行为学检测结果:细胞移植后24h,各组神经行为学各项指标评分均基本相似(P＞0.05);移植后10,20 d,损伤模型组与培养基对照组无明显变化,神经生长因子细胞组、常规细胞组运动及感觉功能各项评分均显著降低(P＜0.05),且神经生长因子细胞组下降幅度明显强于常规细胞组(P＜0.05).⑤免疫组织化学和荧光检测结果:经量子点神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞在脑组织损伤区存活,并向周围迁移.结论:量子点是一种较好的细胞示踪剂,负载其标记的神经生长因子纳米化颗粒的羊膜间充质干细胞移植能够改善脑损伤大鼠神经功能.     

超顺磁性氧化铁纳米颗粒体外标记兔骨髓间充质干细胞的安全性以及MRI成像特征

背景：传统的干细胞标记方法常需要病理组织学等侵袭性手段检测,无法动态观察整个实验过程,也不适合临床研究。目的：观察超顺磁性氧化铁纳米颗粒体外标记对兔骨髓间充质干细胞生物学特性的影响以及标记兔骨髓间充质干细胞的体外MRI成像特征。方法：采用红细胞裂解贴壁法培养扩增兔骨髓间充质干细胞。采用不同浓度超顺磁性氧化铁纳米颗粒（100,50,25,12.5mg/L）联合多聚赖氨酸（0.75mg/L）标记兔骨髓间充质干细胞。对标记兔骨髓间充质干细胞进行MRI检测,观察其成像特征。结果与结论：25mg/L的超顺磁性氧化铁纳米颗粒联合0.75mg/L多聚赖氨酸标记兔骨髓间充质干细胞具有较好的安全性和有效性。此浓度对细胞的生长活性没有影响,不影响骨髓间充质干细胞的成骨成脂分化能力。MRI扫描在T2^＊WI序列上能明显有效地显像超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记的兔骨髓间充质干细胞。     

不同保存时间人羊膜来源的间充质干细胞增殖能力比较

背景:以往利用羊膜提取间充质干细胞的研究多将注意力放在新鲜的羊膜标本上,由于地域和时间的限制,对羊膜进行保存是必须面对的实际问题.目的:实验拟比较从不同保存时间人羊膜标本中分离培养的羊膜间充质干细胞的增殖能力.设计、时间及地点:体外进行的细胞对照观察,于2007～01/2008-02在郑州大学医学院和生物工程系完成.材料:正常剖宫产的健康产妇志愿捐献的羊膜12份,孕38周,检测乙肝5项、HCV、HIV、梅毒等其他相关传染性指标均呈阴性.方法:无菌条件下将每份新鲜完整的羊膜平均分成3组,即新鲜1 h组、4℃放置24～36 h组、4℃放置48～60 h组.将3组标本剪碎,胰蛋白酶,胶原酶联合消化,过滤后收集单细胞悬液,以2×108 L-1密度接种,加入含胎牛血清和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基,贴壁法纯化扩增细胞.主要观察指标:倒置昆微镜下观察细胞形态,绘制生长曲线.取第3代细胞进行免疫组织化学检测和流式细胞仪鉴定.结果:①3组标本消化后都含有多种单个细胞成分,呈圆形、菱形、短梭形、多角形,细胞折光性良好,此外还有多个上皮细胞聚集所成的细胞团.接种后1～3 d各组细胞均为潜伏期;4～7 d新鲜1 h组与4℃放置24～36 h组进入对数生长期,细胞增殖活跃,细胞数目旱指数级递增,4℃放置48～60 h组仍处于潜伏期;7 d后前两组细胞已铺满瓶底,4℃放置48～60 h组刚开始指数级递增.②各组细胞神经元烯醇化酶、神经丝蛋白、巢蛋白均呈阳性表达,胶质纤维酸性蛋白呈阴性.各组细胞CD29,CD44均呈阳性表达.结论:保存时间在60h内的人羊膜都可以分离出具有增殖能力的间充质干细胞,但36h内的羊膜标本所分离的间充质干细胞具有较快的增殖能力.     

成人骨髓间充质干细胞的鉴定与体外BrdU标记

背景:目前尚未发现骨髓间充质干细胞独有的标志分子,给其鉴定带来一定困难.BrdU标记不存在放射性污染,有研究认为在不受到紫外线照射的条件下,BrdU标记后对细胞功能无损害.目的:探讨成人骨髓间充质干细胞体外鉴定和标记的方法,并观察其生物学特性.设计、时间及地点:细胞观察,于2007-06/12在解放军兰州军区兰州总医院完成.材料:成人骨髓来自5例健康志愿者.BrdU为美国Sigma公司产品.方法:采集成人骨髓10mL,密度梯度法分离单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,调整细胞密度为2×108L-1进行扩增培养.取第3代骨髓间充质干细胞,加入成骨诱导培养基,行碱性磷酸酶染色;加入成脂诱导培养基,行油红O染色;加入终浓度为5,10,15μmol/L BrdU溶液,孵育12,24,48,72,96h后行免疫细胞化学染色.主要观察指标:倒置光学显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪鉴定细胞表型,成骨及成脂诱导分化结果.BrdU阳性标记率及标记后细胞生长情况.结果:[1]体外培养的成人骨髓间充质干细胞形态均一,为梭形或纺锤形的成纤维细胞样外观;表达CD44和CD71,不表达CD34和HLA-DR;可定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞.[2]大部分骨髓间充质干细胞标记后核抗BrdU染色阳性,随着标记浓度的升高和标记时间的延长,BrdU阳性率逐渐增高,终浓度10μmol/L BrdU标记72h后阳性率达90%以上,且连续传9代均可检测到BrdU阳性细胞.第3代骨髓间充质干细胞90%处于G0/G1期,BrdU标记后88.62%处于G0/G1期,标记前后细胞生长周期无明显变化.结论:通过形态学特征、表面标记和多向分化潜能可以鉴定体外分离培养的细胞为成人骨髓间充质干细胞;BrdU标记可用于成人骨髓间充质干细胞移植入体内后存活、生长和分化的动态示踪观察;BrdU最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72h.     

人脐带间充质干细胞向胰岛样细胞的分化

目的:前期实验采用药物诱导的方法将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞,将人脐带间充质干细胞与大鼠胰岛细胞共同培养及移植入糖尿病大鼠体内,观察其在胰岛细胞生长的微环境及在体环境中向胰岛样细胞分化的潜能.方法:实验于2006-10/2007-09在汕头大学医学院生殖遗传实验室完成,属于广东省科技厅重点实验室.[1]实验材料:SD大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供.对动物处置符合动物伦理学标准.脐带取自汕大附二妇产科健康足月妊娠剖宫产的胎儿,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.[2]实验方法:分离培养人脐带间充质干细胞,并采用酶消法分离大鼠胰岛细胞.将人脐带间充质干细胞与大鼠胰岛细胞以半透膜相隔共同培养,在共培养的第3,7,14天采用放射免疫法检测胰岛素水平,RT-PCR方法检测PDX-1基因的表达,以单独培养的脐带间充质干细胞为对照.经尾静脉将人脐带间充质干细胞移植入糖尿病模型大鼠体内,采用半定量RT-PCR方法检测人insulin基因表达.结果:[1]共培养条件下的人脐带间充质干细胞由长梭形逐渐变圆,并聚集成团.[2]放射免疫法结果表明,共培养组人脐带间充质干细胞随葡萄糖浓度的增高而分泌的胰岛素量也增加,与对照组相比差异显著(P<0.05).[3]未经共培养诱导的人脐带间充质干细胞不表达PDX-1,共培养3d的人脐带间充质干细胞表达PDX-1,共培养7d的人脐带间充质干细胞仍表达PDX-1,共培养14d的人脐带间充质干细胞未表达PDX-1.[4]未经移植人脐带间充质干细胞的大鼠胰腺不表达人insulin基因,而移植人脐带间充质干细胞的大鼠胰腺在第60天时能够检测出人insulin基因.结论:人脐带间充质干细胞具有在体内外的微环境中向胰岛样细胞分化的潜能.     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced-green fluorescent protein,EGFP)标记的人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor, hIGF-1)真核表达载体,转染至兔骨髓间充质干细胞,为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞.方法:实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成.根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T18载体,测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞,通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达.结果:成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达.结论:新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法,经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择.     

携载阿霉素磁性纳米Fe3O4颗粒的制备及逆转多药耐药的实验研究

为了建立一种磁性纳米Fe3O4颗粒携载聚合阿霉素的制备方法,探讨载药纳米颗粒对K562及其耐药株K562/A02的作用,用机械吸附聚合法在4℃、37℃下以不同药球比聚合24、48小时合成载药纳米颗粒,用噻唑蓝比色法检测细胞与载药纳米颗粒悬液孵育48小时后的生存率,并计算细胞抑制率。结果表明：随着磁性纳米Fe3O4颗粒浓度增加,两种细胞抑制率均提高,聚合在4℃、48小时时的细胞抑制率分别高于37℃、24小时的细胞抑制率。结论：磁性纳米Fe3O4颗粒可通过机械吸附法携载阿霉素,聚合具有温度、时间依赖特性;载药纳米颗粒有逆转多药耐药作用。     

人脐静脉间充质干细胞体外诱导分化为神经元的可行性

目的:探讨来源于人脐静脉内皮及内皮下层间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性,分析体外分离纯化、原代及传代培养的最佳条件,为神经组织修复选择理想的种子细胞来源.方法:实验于2006-04/12在辽宁医学院解剖学实验室完成.①对象:取正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条,由辽宁医学院附属第一医院提供,产妇及其家属均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:无菌条件下用1 g/LⅠ型胶原酶消化脐静脉内皮及内皮下层,收集的细胞按5×107 L-1,1×108 L-1,5×108 L-1,1×109 L-1,3×109 L-1密度接种进行原代培养,待细胞80%融合时胰酶消化传代.取第2代细胞,诱导组经含有3 μmo/Lβ-巯基乙醇、20%胎牛血清的DMEM预诱导液处理后,换成含10 g/L二甲基亚砜、100 mmol/L丁化羟基茴香醚的无血清DMEM诱导液进行诱导.未诱导组将诱导液更换为无血清DMEM.③实验评估:记录原代培养过程中不同接种密度细胞贴壁所需时间.免疫细胞化学检测诱导前细胞表面抗原血管性血友病因子、CD166的表达及诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白的表达,倒置相差显微镜下计数阳性细胞分化率.结果:①不同接种密度细胞贴壁所需的原代培养时间比较:5×107 L-1组仅有1孔细胞贴壁呈克隆样生长,但培养至28 d时仍不能传代,其余培养孔均无细胞贴壁生长.与1×108 L-1组比较,5×108 L-1,1×109 L-1,3×109 L-1组细胞贴壁生长的原代培养时间均明显缩短(P < 0.05),且后3组比较差异无显著性意义(P > 0.05).②贴壁细胞表面抗原检测:CD166呈阳性,血管性血友病因子呈阴性.③诱导分化:诱导组脐静脉间充质干细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达,不表达胶质纤维酸性蛋白.巢蛋白阳性细胞率为(9.5±1.2)%,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率为(15.6±2.6)%.未诱导组以上3种标志均不表达.结论:①在体外可以成功分离培养获得人脐静脉内皮及内皮下层的间充质干细胞,其原代培养细胞的种植密度以5×108 L-1～ 1×109 L-1为佳.②细胞传2代后性质相对均一,基本无造血细胞和内皮细胞污染,达到纯化目的,具有间充质干细胞特点.③在化学诱导剂β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基茴香醚联合作用下,其可以向神经元样细胞分化.     

体外全骨髓法培养人骨髓间充质干细胞的生物学性状

目的:现阶段多以动物为材料培养观察骨髓间充质干细胞的生长特性,对人骨髓间充质干细胞培养和生长特性的研究相对较少.为此实验培养人骨髓间充质干细胞,拟建立稳定的培养方法.方法:实验于2007-03/09在泸州医学院中心实验室省级重点实验室完成.①实验材料:6个月以上流产胎儿由泸州地区妇产医院提供,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.②实验方法:应用全骨髓培养法培养人骨髓间充质干细胞,采用差速贴擘对细胞进行纯化.③实验评估:倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,应用MTT法间接测定骨髓间充质干细胞活性.结果:①培养4 h,见骨髓间充质干细胞已开始贴壁,胞体由圆形变为不规则形或三角型,培养第2-4天,见间充质干细胞胞体向两端伸出二三个粗短突起,此时细胞形态渐变为梭型,呈成纤维细胞样生长,并聚集成集落;随着细胞的生长,贴壁细胞逐渐表现为脊梁状、旋涡状生长,细胞突起增长、增粗,并可发出更细的分支,突起间可相互交织成网.培养7 d时,见细胞铺满瓶壁面积的70%～80%,细胞排列紧密,此时骨髓间充质干细胞铺成单层.苏木精-伊红染色见细胞多为长梭型,有突起及分支,胞体较大,核一个,较大,呈椭圆,着色浅,可见多个的核仁,胞质浅红色.②骨髓间充质干细胞表面标志CD44免疫组织化学榆测,可见胞膜出现棕黄色阳性反应.③MTT法分别检测结果显示,2～6代细胞于酶标仪490 nm波长处吸光度值无明显差异,但均高于七八代细胞.结论:利用全骨髓培养法成功地培养出人胎儿骨髓间充质干干细胞,且第3～6代细胞纯度高、活性好.     

Fe3O4纳米粒子的细胞相容性

背景:无论是作为化疗药物载体还是作为肿瘤热疗介质,Fe3O4纳米粒子与肿瘤细胞微观结构的作用都有待于深入研究。目的:分析Fe3O4纳米粒子的细胞相容性,探讨其在骨肉瘤化疗中作为药物载体的应用和存在的问题。方法:参照GB/T16886.5-2003(医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验)的评价标准和要求,偶联十六烷基三甲基溴化铵、聚乙二醇、油酸钠Fe3O4纳米粒子胶体溶液,分别与大鼠原发骨肉瘤细胞和人成纤维细胞共培养的方式对其进行细胞毒性测试。结果及结论:偶联油酸钠Fe3O4纳米粒子细胞相容性良好,参照GB/T16886.5-2003标准属于安全范围。偶联十六烷基三甲基溴化铵Fe3O4纳米粒子细胞相容性差,不适宜作为化疗药物载体进入人体。偶联聚乙二醇Fe3O4纳米粒子有一定的细胞相容性,作为磁靶向热化疗载体还需研究。     

人骨髓间质干细胞PKH 26荧光标记技术

目的 建立一种PKH26体外荧光标记人骨髓间质干细胞（MSCs）的方法。方法 培养人骨髓间质干细胞，按PKH26标记程序进行标记后培养，采用激光共聚焦显微镜、流式细胞分析，观察标记后人MSCs生长状态、荧光强度变化和传代培养效果。应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）等方法观察标记细胞的生物学功能。结果 标记后MSCs呈红色荧光，标记率达100％，体外连续传代培养7代后，荧光标记细胞荧光强度逐渐减弱，荧光标记细胞百分比逐渐减低。PKH26标记MSCs的生长形态、生长活力、nucleostemin、三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因表达及体外诱导分化能力等生物学特性不发生改变。结论 PKH26荧光标记人MSCs是一种有效、实用的方法，该方法对MSCs转归、可塑性及MSCs移植治疗研究具有重要的价值。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及BrdU标记鉴定

背景:骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的细胞及基因治疗的靶细胞.目的:拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记骨髓间充质干细胞的方法.设计、时间和地点:开放性实验,于2008-03/05在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的住院患者,无血液系统疾病和家族遗传病史,由南昌大学第一附属医院提供.方法:密度梯度离心和贴壁培养相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用BrdU标记.主要观察指标:相差显微镜下观察人骨髓间充质干细胞的形态变化;流式细胞仪检测入骨髓间充质干细胞的表面标记以及细胞周期:绘制人骨髓间充质干细胞生长曲线;透射电镜观察人骨髓间充质干细胞的超微结构.结果:密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的人骨髓间充质干细胞.流式细胞仪检测入骨髓间充质干细胞CD90,CD29,CD44,CD34,CD45阳性细胞表达分别为98.48%,98.74%,97.41%.0.36%,0.64%.人骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形.透射电镜可见人骨髓间充质干细胞胞质丰富,粗面内质网发达,大量蛋白分泌物.免疫组织化学检测BrdU标记48 h后人骨髓间充质干细胞标记率80%.结论:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养相结合,以获得纯度较高和活性骨髓间充质干细胞,是简便可行的方法:BrdU是一种简单、有效的标记骨髓间充质干细胞的方法.     

微球培养人脂肪间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化

目的:观察微球培养的人脂肪间充质干细胞在特定诱导条件下向软骨细胞的分化情况,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法:实验于2006-03/08在湘雅医院中心实验室完成。①实验材料:皮下脂肪组织来源于股骨颈骨折手术患者6例,对本实验均知情同意。②实验方法:取皮下脂肪,分离培养脂肪间充质干细胞,胰酶消化,取传至第6代的细胞,密度调整为1×1010L-1进行接种培养,细胞贴附后加入软骨细胞诱导剂(含10μg/L转化生长因子β1、37.5mg/L维生素C、6.25mg/L胰岛素、6.25mg/L转铁蛋白、10-7mol/L地塞米松、1%新生牛血清的高糖DMEM),倒置显微镜下观察细胞团的变化。③实验评估:诱导14d后,将细胞吹散,细胞爬片,免疫组化染色检测Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺兰染色观察细胞内异染情况,RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖aggrecan mRNA的表达。结果:①脂肪间充质干细胞向软骨细胞诱导后的形态:诱导3d后,细胞团向内呈放射状聚集。②诱导后Ⅱ型胶原的表达及细胞内异染情况:诱导14d后,Ⅱ型胶原在胞浆、胞膜及细胞外基质中均有表达,呈棕黄色;甲苯胺兰染色显示胞浆内呈蓝色异染。③诱导前后Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan mRNA的表达:诱导前脂肪间充质干细胞无Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan mRNA表达,而诱导14d后二者均有较高表达。结论:在微球状态下可成功诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化。     

人胎盘源与人骨髓源间充质干细胞的生物学性状比较

背景:人骨髓源间充质干细胞具有很好的临床应用价值,但数量和取材都有限,而人胎盘源间充质干细胞则相反,目前已成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞.目的:比较人胎盘源间充质干细胞和人骨髓源间充质干细胞体外分离培养、扩增及生物学性状的差异.方法:采用胶原酶消化法分离人胎盘组织,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别加入体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM 培养液,待细胞汇合至90%后消化传代.分别取第3代的人胎盘和骨髓间充质干细胞,按1×106 浓度接种,当细胞达70%~80%融合时,换成成脂细胞诱导分化培养液,诱导16 d.结果与结论:胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞均成贴壁生长、形态均一的成纤维样细胞梭形外观,但后者体积略小.两种细胞均高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD106.二者均可分化为脂肪细胞.可见,从胎盘和骨髓中培养出的间充质干细胞在细胞形态、生长特性等方面基本相似,在体外均可有效扩增并成脂肪分化,均可作为组织工程的另一成体干细胞来源,而胎盘源间充质干细胞具有更好的应用前景.     

人间充质干细胞成骨诱导培养后的细胞成分研究

目的了解构建组织工程化骨的人间充质干细胞(MSCs),在体外成骨诱导环境中培养2代后,成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞的比例。方法体外扩增培养人MSCs,然后在含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C等的培养液中诱导培养2代,进行成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞的鉴定。结果人MSCs体外成骨诱导培养2代后,碱性磷酸酶阳性细胞数65%,Ⅰ型胶原免疫组化阳性细胞数55%、骨钙素阳性细胞数52%,Ⅱ型胶原免疫组化染色为阴性,油红O法染色阳性细胞数2.5%。结论人MSCs体外成骨诱导培养2代后,可有约50%的成骨细胞,少量脂肪细胞形成,无成熟的软骨细胞出现。该结论可为利用间充质干细胞构建组织工程化骨提供理论参考。     

磁性/荧光量子点双功能纳米粒子双标记对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的：利用磁性/荧光量子点双功能纳米粒子双标记大鼠骨髓间充质干细胞（BM-SCs）,探讨其对BMSCs生物学特性的影响。方法：分离、纯化及培养大鼠BMSCs。制备二氧化硅（SiO2）包裹的含四氧化三铁（Fe3O4）和碲化镉（CdTe）荧光量子点的磁性及荧光双功能纳米粒子Fe3O4@CdTe@SiO2,利用铁浓度为25 mg/L的Fe3O4@CdTe@SiO2双标记BMSCs,未标记的BMSCs作为对照组。采用细胞计数（CCK-8）试剂盒检测BMSCs细胞毒性和增殖能力,台盼蓝拒染测细胞活力,成骨、成脂诱导检测细胞多向分化能力,评价双标记对BMSCs生物学特性的影响。荧光显微镜和普鲁士蓝染色观察诱导分化后Fe3O4@CdTe@SiO2双标记情况。结果：荧光显微镜下可见双标记组细胞内Fe3O4@CdTe@SiO2纳米粒子显示为红色荧光,荧光和磁性双标记率均达到90%以上。Fe3O4@CdTe@SiO2双标记后细胞存活率为（94±5）%。Fe3O4@CdTe@SiO2对BMSCs无明显细胞毒性,对BMSCs的成脂、成骨分化潜能无明显影响。结论：磁性/荧光量子点双功能纳米粒子（Fe3O4@CdTe@SiO2纳米粒子）双标记对大鼠BMSCs安全有效,对BMSCs的生物学特性无明显影响,有望为MRI和光学成像活体示踪BMSCs提供技术基础。     

DiO标记对人骨髓间充质干细胞生物学功能的影响

目的用细胞膜绿色荧光探针Di O标记人骨髓间充质干细胞(h BMMSCs),探讨其对h BMMSCs生物学功能的影响。方法采用Ficoll密度梯度离心法分离、培养h BMMSCs;流式细胞术检测Di O对h BMMSCs的标记效率;通过Transwell迁移实验、平板克隆实验、生长曲线分析、成脂及成骨诱导实验分别检测Di O对h BMMSCs迁移、增殖和多向分化能力的影响。结果Di O对h BMMSC的标记效率可达(99.5±0.4)%;Transwell迁移实验、平板克隆实验、生长曲线分析、成脂及成骨诱导实验结果表明,与未标记h BMMSCs相比,标记后的h BMMSCs迁移、增殖及成脂、成骨分化能力未见明显改变,差异均无统计学意义(P均0.05)。结论经Di O处理未见明显影响h BMMSCs的生物学功能,可做为安全、有效的h BMMSCs体外标记绿色荧光染料。