补肾益髓中药血清孵育骨髓间充质干细胞移植防治缺血性脑血管病的理论探讨

脑是肾精充骨生髓所化,是人体生命活动的主导。中医学认为补肾益髓法是治疗缺血性脑血管病(isehemic cere-bral vaseular disease,ICD)的重要法则,而骨髓间充质干细胞((bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植也起到重要作用。所以用补肾益髓中药联合BMSCs移植成为重塑ICD的重要途径之一。补肾益髓中药血清孵育BMSCs移植可增加缺血脑组织中生长因子和神经营养因子的表达,促进脑功能恢复,使中医未明的机理得以阐释,西医的局限得以系统整体,有利于医学的进步和发展,开拓新的治疗方法。     

健脾补肾、清肠化湿方对骨髓间充质干细胞增殖迁移的影响

目的观察健脾补肾、清肠化湿方对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖迁移的影响。方法贴壁筛选法体外分离培养BMSCs,制备细胞悬液,空白对照组不予任何药物干预,健脾补肾、清肠化湿方低、中、高剂量组(简称复方低、中、高剂量组)分别加入含有0.39、0.78、1.56μg/mL复方共同孵育。采用CCK-8法检测BMSCs增殖能力;采用Transwell法检测BMSCs迁移趋化能力。另设复方各剂量组联合细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)激酶抑制剂U0126作为对照,采用Western blot法检测ERK和环磷腺苷效应元件结合蛋白(CAMP responsive element-binding protein,CREB)蛋白磷酸化水平。结果与空白对照组比较,复方低、中、高剂量组均能促进BMSCs增殖和BMSCs迁移数目增多(P0.05),且复方中、高剂量组促BMSCs增殖作用优于复方低剂量组(P0.05)。与空白对照组比较,复方各剂量组ERK和CREB蛋白磷酸化水平升高(P0.05),且能被U0126抑制(P0.01);与复方低剂量组比较,复方中、高剂量组ERK磷酸化水平升高(P0.05)。结论健脾补肾、清肠化湿方能促进BMSCs的增殖迁移,其机制可能与ERK/CREB信号通路有关。     

补肾活血中药对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

目的观察补肾活血中药含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养,建立大鼠骨髓间充质干细胞培养体系;收集补肾活血中药的含药血清,用10%含药血清代替10%的血清,绘制生长曲线,观察补肾活血中药含药血清促进骨髓间充质干细胞体外增殖的作用。结果所培养的大鼠骨髓细胞在表型表达和细胞形态上具备MSC特征,补肾活血中药含药血清组增长速度比空白对照组明显加快,并与剂量呈正比。结论补肾活血中药含药血清能促进干细胞在体外增殖。     

基于“髓系骨病”理论探索Osterix阳性骨髓间充质干细胞维持骨稳态的作用

目的:探索Osterix阳性骨髓间充质干细胞维持骨稳态的作用。方法:Osterix-CreERT2小鼠(Osterix基因靶标小鼠)与Rosa26-tdTomato小鼠(番茄红荧光报告小鼠)交配获得子代Osterix-CreERT2/Rosa26-tdTomato小鼠,Osterix-CreERT2小鼠与Rosa26-DTA小鼠(白喉毒素A片段报告小鼠)交配获得子代Rosa26-DTA小鼠和Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠。选取3只子代Osterix-CreERT2/Rosa26-tdTomato小鼠纳入示踪组,6只子代Rosa26-DTA小鼠纳入空白组,6只子代Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠纳入Osterix阳性细胞剔除组。各组小鼠均于1月龄时按0.1 mg·g^-1体质量腹腔注射他莫昔芬,每天1次,连续注射5 d,以诱导白喉毒素表达,特异性剔除Osterix阳性细胞。他莫昔芬干预结束后2周,脱颈处死示踪组小鼠,切取左侧股骨,通过免疫荧光染色观察Osterix阳性细胞在小鼠股骨中的分布情况。他莫昔芬干预结束后6个月...     

基于补肾法探讨骨髓间充质干细胞治疗卵巢早衰的作用

卵巢早衰作为临床常见妇科疾病之一，其发病率高、治愈困难，严重影响女性身心及生殖健康。现代医学治疗以激素替代为主，但激素不良反应较大，因此越来越多的临床医生开始关注骨髓间充质干细胞为靶点的治疗方法。中医学认为本病的主要病机为肾虚，治疗以补肾为主，通过梳理补肾法及骨髓间充质干细胞在卵巢早衰中的治疗作用，发现补肾法与骨髓间充质干细胞增殖及多向分化有异曲同工之处，具有临床应用价值。     

补肾化瘀生新方对不同代次骨髓间充质干细胞增殖、凋亡影响的研究

目的:探讨补肾化瘀生新方对不同代次骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、凋亡的影响。方法:对BMSCs进行提取纯化、分选及培养,第3代细胞随机分为正常组,加入杜氏培养液(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM);补肾化瘀生新组,加入补肾化瘀生新含药血清;生理盐水组,加入生理盐水含药血清。MTT法检测各组不同时间点和不同代次BMSCs细胞活性、生长曲线和群体倍增时间;比色法检测β-半乳糖苷酶活性变化。流式细胞术检测不同时间点和不同代次羧基荧光素乙酰乙酸(Carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester,CFDA-SE)标记、BMSCs增殖率和细胞周期变化;实时荧光PCR技术检测不同代次BMSCs端粒酶活性表达情况。结果:与正常组比较,生理盐水组β-半乳糖苷酶活性、24 h、48 h、72 h时间点不同代次BMSCs增殖率和群体倍增时间、端粒酶活性、不同代次G0/G1期差异无统计学意义(P 0.05);与生理盐水组比较,补肾化瘀生新组不同代β-半乳糖苷酶活性、端粒酶活性降低,24 h、48 h、72 h时间点不同代次BMSCs增殖率、群体倍增时间、不同代次G0/G1期升高(P 0.05)。结论:补肾化瘀生新方延缓细胞衰老作用可能与降低β-半乳糖苷酶活性、激活端粒酶活性、提高BMSCs增殖分化能力有关。     

养心通脉有效部位方对大鼠骨髓间充质干细胞作用蛋白组学的生物信息学分析

目的：对养心通脉有效部位方（apr-YTF）应用于骨髓间充质干细胞（BMSCs）的作用蛋白组学蛋白进行生物信息学分析。方法：根据核素标记相对和绝对定量（iTRAQ）蛋白组学技术确定的apr-YTF对BMSCs作用靶点的差异蛋白,通过DAVID数据库搜索软件结合GO数据库搜索,进行注释和富集度分析,KEGG数据库进行信号转导通路分析;VISANT数据库检索蛋白质相互作用。结果：差异蛋白主要参与102种生物学过程、35种细胞组分、6种分子途径,差异蛋白主要参与3条信号转导通路,这些蛋白在3条信号转导通路上相互发生作用。结论：处于差异蛋白功能交互网中交叉点位置的Presenilin-1、Presenilin-2通过Notch信号通路,Syntaxin-4蛋白通过可溶性N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的融合蛋白附着蛋白（SNARE）信号通路,丝裂原活化蛋白激酶12（MAPK12）通过MAPK信号通路在apr-YTF诱导BMSCs向心肌分化过程中发挥重要作用,养心通脉有效部位方对骨髓间充质干细胞的作用是在多位点、多环节、多种生物学进程中发挥作用的,蛋白质组学生物信息学技术可以站在“整体观”的角度对中医药的作用机制作出预测,结合分子生物学验证是一条很好的中医药现代化途径。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导分化

目的:分离培养兔骨髓间充质干细胞并成骨诱导分化。方法:从兔骨髓中分离培养原代MSCs并进行传代培养,绘制生长曲线。取第3代细胞进行成骨诱导分化,进行Vonkossa染色,碱性磷酸酶染色,碱性磷酸酶(ALP)活性测定,总蛋白检测,提取细胞总RNA及RT-PCR法检测Collagen I,osteocalcin及osteopontin基因表达情况。结果:MSCs贴壁生长,呈放射样、爆花样或漩涡样,可传20代以上。未经成骨诱导的MSCs不发生矿化沉积,而经成骨诱导分化后,细胞可发生显著的矿质沉积。未经成骨诱导的MSCs可微量表达CollagenI,但不表达osteocalcin和osteopontin,而经成骨诱导分化后,细胞表达CollagenI增强,并出现osteocalcin和osteopontin等成骨标志物的表达。结论:本实验成功分离培养MSCs并成骨诱导分化。     

补肾法诱导骨髓间充质干细胞定向成骨分化的研究进展

中医学认为:肾主骨,生髓。骨的生成,发育,强弱,盛衰均与肾有密切关系。众多研究表明补肾法能诱导骨髓间质干细胞定向成骨分化,骨髓间质干细胞是多能细胞,通过诱导可分化成为骨、软骨、脂肪、肌腱,这是用现代科学技术更完善地阐释补肾法的理论依据,对防治骨质疏松症,骨坏死,骨缺损等也有重大价值。     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定

目的：建立成年小鼠骨髓间充质干细胞（MSC）的分离和培养方法，并对其表面标志进行鉴定，为其应用提供实验依据。方法：应用体外细胞培养技术将小鼠MSC自股骨、胫骨中分离、纯化和培养，倒置显微镜观察其生长过程，流式细胞仪检测MSC表面抗体的表达。结果：使用全骨髓贴壁分离方法分离、扩增的MSC贴壁后形态较均一，生长良好，细胞表达CD29，CD44，但CD34和CD45表达阴性。结论：可以用全骨髓贴壁法从小鼠骨髓分离培养出MSC，在体外进行有效扩增，为以小鼠为模型研究MSC在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的运用提供实验基础。     

健脾补肾方含药血清对体外培养的兔骨髓间充质干细胞定向分化的影响

目的:观察健脾补肾方含药血清对体外培养的兔骨髓间充质干细胞(rMSCs)定向分化的影响,揭示本方临床应用防治激素性股骨头坏死的药理机制。方法:以健脾补肾方含药血清作用于体外培养的rMSCs,通过对碱性磷酸酶(ALP)活性的的动态检测结果和四环素荧光标记的矿化结节的出现数量作为分析各组诱导液能否诱导rMSCs分化为成骨细胞以及促进骨向分化强度的指标。结果:rMSCs培养的第12天,健脾补肾组ALP活性高于空白对照组(P0.05);从第8天之后,健脾补肾加成骨组ALP活性高于成骨组(P0.05);更换相应培养液22d后,其余3组形成的钙结节数量明显多于空白对照组(P0.01);健脾补肾加成骨组钙结节数量多于成骨组(P0.05)。结论:健脾补肾方含药血清可以促进rMSCs的骨向分化,且与经典的成骨诱导剂合用具有协同作用。这可能揭示了临床应用该方防治激素性股骨头坏死(SINFH)的细胞学机制。     

补肾生血药对顺铂损伤的小鼠骨髓间充质干细胞的影响

目的：观察补肾生血药对顺铂损伤的骨髓间充质干细胞（BMSC）的影响,探讨补肾生血改善化疗后骨髓抑制的机制。方法：将50只SD雄性大鼠随机分为空白对照组、补肾生血药组,每组25只,分别制备补肾生血血清和空白血清,原代培养BALB/c小鼠BMSC,随机分组,CCK-8法确定顺铂和补肾生血血清干预浓度。干预48 h后,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期,酶联免疫吸附试验法检测培养液中造血调控因子含量。结果：干预48 h后,骨髓细胞凋亡率明显增高（P<0.01）,补肾生血血清组G1期细胞比例显著降低（P<0.05）,S期细胞比例显著增加（P<0.05）,增殖期细胞比例明显增加（P<0.05）。补肾生血血清组骨髓细胞凋亡率明显降低（P<0.001）,G1期细胞比例显著降低（P<0.05）,增殖期细胞比例显著增加（P<0.05）,IL-3含量明显升高（P<0.01）,TNF-α、TGF-β、IFN-γ含量显著降低（均P<0.05）。结论：补肾生血药能减轻顺铂造成的BMSC凋亡,促进细胞进入增殖期,促进造血生长因子分泌,减少造血抑制因子分泌,提示该药对化疗后骨髓抑制具有一定的改善作用。     

间充质干细胞对糖尿病病变模型大鼠血视网膜屏障的影响研究

目的：通过临床观察,对来源于脂肪的间充质干细胞影响糖尿病视网膜病变情况进行分析,并评价其对模型大鼠血视网膜屏障的干预效果,同时进一步研究脂肪来源的间充质干细胞在视网膜中的分化情况.方法：利用STZ腹腔注射干预下诱导构建DR大鼠模型,采用尾静脉注射来源于脂肪的间充质干细胞从而实现对模型进一步的干预,安排专人负责监测血糖变化情况.使用伊凡斯蓝灌注法对模型大鼠血视网膜屏障功能进行评价,利用免疫荧光法详细观察来源于脂肪的间充质干细胞在视网膜中的分化情况.结果：实施干预措施之后,大鼠血糖数值出现明显降低,视网膜中的来源于脂肪的间充质干细胞可对视网膜光感受器细胞以及胶质细胞中的独特成分进行感应.结论：来源于脂肪的间充质干细胞能够在DR的视网膜中明显地对向光感受器以及胶质细胞方向进行分化,可以有效改善模型大鼠血视网膜屏障功能,对于修复模型大鼠血视网膜屏障损伤起着十分积极的作用.实施干预之后,糖尿病动物模型血糖水平出现明显下降.     

补肾强筋胶囊含药血清对骨关节炎滑膜细胞、软骨细胞PGE2、NGF基因表达的影响

目的:观察补肾强筋胶囊含药血清对骨关节炎滑膜细胞、软骨细胞PGE2、NGF、COX-2、MMP13基因表达的影响.方法:选取拟行全膝关节置换手术的膝关节骨性关节炎,术中取病变滑膜、软骨进行原代细胞培养,用IL-1 β刺激复制骨关节炎细胞模型,用补肾强筋胶囊含药血清干预后,RT-qPCR检测PGE2、NGF、COX-2、...     

通冠胶囊影响动脉粥样硬化兔血管内皮功能的超声研究

目的：观察通冠胶囊对动脉粥样硬化（AS）兔血管内皮功能的影响,探讨通冠胶囊抗动脉粥样硬化的作用和可能机制。方法：健康雄性新西兰白兔36只,按随机数字表法分为空白对照组、高脂对照组、阿托伐他汀组、通冠胶囊大、中、小剂量组,每组6只,空白对照组喂基本饲料,其余各组采用免疫性内皮损伤合并高脂饲料诱导建立As兔模型,高脂对照组喂高脂饲料,阿托伐他汀组在高脂对照组的基础上加喂阿托伐他汀5mg／kg／d;通冠胶囊小、中、大剂量组在高脂对照组基础上分别加喂通冠胶囊3mg／kg／d、9mg／kg／d及15mg／kg／d,实验周期为6周,各组动物分别于2、6周末行内皮功能超声检测血管内皮舒张功能（FMD）、血管内皮非依赖性舒张功能（NMD）及血脂检测。结果：6周末,通冠胶囊大剂量组、阿托伐他汀组与高脂对照组之间FMD、NMD比较,差异均有显著性意义（P〈0.05）;通冠胶囊大剂量组NMD、FMD与阿托伐他汀组比较,差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：通冠胶囊能显著改善动脉粥样硬化兔血管内皮功能,其具有不依赖阿托伐他汀的独立的改善血管内皮功能的作用,而且在改善NMD方面,通冠胶囊优于阿托伐他汀,     

壮骨冲剂对去卵巢大鼠骨密度、骨钙素的影响

目的：探讨壮骨冲剂对去卵巢大鼠骨密度、骨代谢指标的影响,为预防、治疗绝经后骨质疏松症提供实验依据。方法：将40只6月龄SD雌性大鼠采用假手术和摘除卵巢手术建立骨质疏松模型,按一定剂量给用药组灌服壮骨冲剂,西药组灌服尼尔雌醇,假手术组、模型组灌服等量生理盐水。3个月后处死大鼠,眼球取血,测定血清骨钙素水平。同时取大鼠双侧股骨用于测定BMD。结果：壮骨冲剂可减缓大鼠摘除卵巢后骨量的丢失,使去卵巢大鼠血清骨钙素（BGP）水平升高（P〈0．05）。结论：壮骨冲剂通过对钙调激素分泌释放的调节,使骨量的丢失减少,对绝经后的骨质疏松起到防治的作用。     

补肾益精法中药复方对硬皮病小鼠皮肤纤维化的影响

目的:研究补肾益精法中药复方对硬皮病小鼠皮肤纤维化表型的影响。方法:使用博来霉素诱导建立硬皮病小鼠模型,分别采用补肾益精法中药复方(中药复方组)、生理盐水(模型组)处理硬皮病模型小鼠,共3周,并设正常对照组。HE染色观察皮肤病理改变;使用实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,测定各组小鼠I型胶原α2(COLⅠα2)基因表达情况。结果:成功建立硬皮病小鼠模型,皮肤病理HE染色显示,中药复方组小鼠皮肤纤维化有不同程度改善。模型组小鼠COLⅠα2基因表达较正常对照组高(P<0.01);经补肾益精法处理后,中药复方组小鼠COLⅠα2基因表达减少,与正常对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。结论:补肾益精法中药复方可改善硬皮病模型小鼠皮肤纤维化程度。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性研究

目的:进一步研究兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分离和培养方法及其生物学特性,为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。方法:通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养兔MSCs。测定其接种贴壁率,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,利用甲基噻唑基四唑(methyl thiazdyl tetrazolium,MTT)法测定MSCs生长曲线,并应用流式细胞术测定细胞表面标记物。结果:MSCs接种12h后贴壁率为95%以上,细胞倍增时间约为30.8h,平均传代时间约5～7d;培养的MSCs阳性表达CD29、CD44、CD105,阴性表达CD34。结论:在适宜的实验条件下,体外培养的MSCs能够稳定生存增殖并保持多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

参芎补肾胶囊治疗血管性痴呆患者的疗效及对其生活质量的影响

目的观察参芎补肾胶囊的临床疗效,并探讨其作用机制。方法轻度血管性痴呆(vascular de-mentia,VaD)患者70例,按5∶2的比例随机分为治疗组50例与对照组20例。按双盲法给药,治疗组给予参芎补肾胶囊口服;对照组给予吡拉西坦片口服,疗程两个月。观察其对患者认知能力、日常生活能力、中医证候和生活质量的影响。结果据简易智能状态量表(The Mini-Mental State Examination,MMSE)测评认知能力疗效,总有效率治疗组74.46%,对照组68.42%,两组比较差异无统计学意义(P0.05);日常生活能力(activity daily living,ADL)疗效,总有效率治疗组80.85%,对照组78.95%,两组比较差异无统计学意义(P0.05);中医证候疗效,总有效率治疗组85.11%,对照组63.16%,治疗组优于对照组(P0.05)。采用世界卫生组织发布的普适性生活质量量表——健康状况调查问卷(The Mos 36 item Short Form Health Survey,SF36)进行测评,显示参芎补肾治疗组对患者生活质量各维度积分及总积分均有较好的改善作用,治疗后优于治疗前(P0.01,P0.05);在生理功能(physical function,PF)、生理职能(role physical,RP)、活力(vital-ity,VT)诸维度及总积分方面,治疗组均较对照组改善明显(P0.05)。结论参芎补肾胶囊对轻度VaD患者疗效肯定,具有较好的改善患者生活质量的作用;采用SF36对评定轻度VaD患者的生活质量具有一定的意义和可行性。