蛙皮活性提取物的抗炎作用和体外抗菌活性研究

从美国沼泽绿蛙的皮中分离、提取得到蛙皮活性提取物,体外抗菌试验表明,该活性提取物对金黄色葡萄球菌等有抑制作用。另外,小鼠分别ｐｏ０．２２ｇ／ｋｇ和０．４５ｇ／ｋｇ活性提取物,能明显降低致炎剂导致的小鼠耳肿胀率,分别比空白组降低１８．３％和３１．６％;能明显抑制小鼠血管通透性,Ａ５９０ｎｍ吸收值分别比空白组降低２３．４％和２４．３％。     

家蝇幼虫天蚕素基因的克隆与序列分析

目的对家蝇幼虫天蚕素基因进行克隆和序列分析。方法根据Genbank公布的家蝇成虫天蚕素Cecropin基因序列设计一对引物，以家蝇幼虫cDNA库液为模板，PCR扩增该基因的编码区序列。结果家蝇幼虫天蚕素cDNA目的基因的长度为229bp，与成虫防御素基因一致性为96％；最大的ORF位于20bp～211bp，含192bp。编码63个氨基酸。结论初步预测了该基因编码蛋白的化学性质和二级结构，为该基因的重组表达研究打下基础。     

人抗菌肽FALL-39基因定点突变体的构建及其大肠杆菌表达产物的抗菌活性研究

目的：构建人抗菌肽FALL-39定点突变子及研究其抗菌活性。方法：采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM)，设计两对引物，引入一个突变点，通过重叠延伸法两次PCR扩增，使FALL-39第32位密码子由AAT突变为AAG，将扩增片段克隆入PGEXλ1T质粒中，转化大肠杆菌JM109，并用IPTG诱导，表达的FALL-39-lys32经纯化后与FALL-39进行抗菌活性比较。结果：DNA测序结果表明在预期位点发生突变，突变后的FALL-39-lys32蛋白对大肠杆菌ML-35p的抗菌活性明显增强，其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别由FALL-39蛋白的18．75和37．50μg／ml降低为FALL-39-Lys-32的10．94和21．88μg／ml，对绿脓杆菌ATCC27853的MIC和MBC值分别为FALL-39蛋白的31．25和37．50μg／ml降低为FALL-39-Lys-32的18．75和31．25μg／ml。两种蛋白均在含Medium E的LB培养基中表现出较高活性，在LB培养基中抗菌活性最低，但在同一种培养基中FALL-39-Lys-32蛋白抗菌活性要高于FALL-39蛋白。结论：用两步PCR定点突变技术获得一个FALL-39-Lys-32突变子，其表达分子的抗菌活性明显增强，提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性。     

新型天蚕素A-马盖宁杂合肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀菌作用的机制研究

目的研究天蚕素A-马盖宁杂合肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)杀菌作用的作用机制。方法采用微量稀释法测定杂合肽对MRSA的最低抑菌浓度(MIC)。通过透射电子显微镜观察该杂合肽作用于MRSA后细菌细胞膜的变化,采用原子吸收光谱仪检测待测菌液与杂合肽相互作用后细菌细胞外K+的浓度变化,用流式细胞仪分析杂合肽作用于MRSA后细菌细胞膜完整性的变化。结果杂合肽对MRSA的MIC是64μg/mL。通过超微结构图像观察到细菌细胞膜破坏,杂合肽作用后细胞外钾离子浓度的升高,杂合肽引起碘化丙啶(PI)流入细胞质内,PI着染阳性细胞的比率增高。结论天蚕素A-马盖宁杂合肽可能是通过破坏MRSA细胞膜,使细胞外钾离子浓度的升高同时导致PI进入胞质,细胞内部成分被破坏,从而起到杀菌作用。     

重组多功能抗凝多肽的表达及活性测定

目的 探讨多功能抗凝多肽基因的克隆、表达的可行性及其活性的测定。方法 设计一个具有双重抗凝功能的重组多肽分子结构,它由谷胱甘肽-S-转移酶(GST)作为载体蛋白与重组抗凝多肽融合而成。编码重组抗凝多肽的DNA序列是根据氨基酸序列逆向翻译后经人工合成,并插入表达质粒pGEX-5X-3中,与其中的编码GST序列的3‘端融合。采用大肠杆菌DH5α进行原核表达。应用亲和层析的方法得到纯化的融合蛋白。重组抗凝多肽含有31个氨基酸,由3个功能部分组成：(1)Lys-Gly-Asp(KGD)氨基酸序列,可抑制血小板GpⅡb／Ⅲα受体与纤维蛋白原的结合;(2)纤维蛋白单肽A的7-16残基(FBA^7-16),是凝血酶的抑制剂。(3)水蛭素C末端的12肽,可直接抑制凝血酶。结果 纯化的融合蛋白能抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集(100μmol／L时其活性为对照组的20．7％);随浓度增加而显著延长部分凝血活酶时间(80μmol／L时凝血活酶时间为74．7s)和凝血酶时间(80μmol／L时为102．3s)并抑制凝血酶的蛋白酶分解活性(100μmol／L时活性为对照的11％)。同时,也发现GST也有抗血小板作用,但其作用要明显弱于融合蛋白。结论 通过基因重组的方法设计一具复合抗凝功能的多肽是可行的。     

人内皮生长抑素基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

目的 获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的人重组内皮生长抑素（endostatin)蛋白，以研究其在治疗肿瘤及血管性疾病中的潜在应用价值。方法 从人的胎盘中分离总RNA经反转录聚合酶链反应（RT－PCR），得到endostatin的全基因，并将其与质粒pUCm-T重组，测序证明获及的人内皮生长抑素基因的序列与先前报道一致后，用限制性内切酶将其切下与表达载体pET-11a重组，转化受体菌BL－21（DE3)中，用IPTG诱导以包涵体形式表达，经层析纯化，鸡绒毛尿囊膜血管（CAM）检测活性。结果 经SDS－PAGE检测，重组人内皮生长抑制蛋白的分子量为20KD，表达量约占蛋白总量的40％。纯化后的内皮生长抑素对鸡的绒毛尿囊膜血管的生长有明显的抑制作用。结论 得到了具有生物活性的重组人内皮生长抑素蛋白，为下一步的临床肿瘤及血管性疾病的治疗奠定了基础。     

大肠杆菌分泌表达重组水蛭素Ⅲ的新方法研究

目的:在已有的分泌表达载体pTASH基础之上构建一种更为高效的新型大肠杆菌分泌表达载体,并检验其分泌表达水平是否提高。方法:提取原始质粒pTASH作为模板,用PCR扩增重组水蛭素基因表达盒片段以后,再插入到原表达载体pTASH的BamHⅠ位点上,从而产生含有两个串联的水蛭素基因表达盒单元的质粒p(TASH)2,转入大肠杆菌进行摇瓶表达。结果:双表达盒菌种p(TASH)2进行摇瓶水平的培养,其上清液抗凝血酶活性可达3 500 ATU.ml-1。结论:与单表达盒质粒pTASH的表达水平(2 000 ATU.ml-1)相比,双表达盒质粒p(TASH)2的摇瓶表达水平显著提高。     

融合防御素基因BH的真核表达产物体外抗菌活性研究

目的:为了探索新型融合防御素基因BH抗菌活性。方法:将壳聚糖包裹好的VR-BH转染HEK293细胞,转染24小时,48小时和72小时提取转染后总RNA,同时收集细胞上清,然后采用体外96孔板抑菌法,将融合防御素基因BH的真核表达产物加入到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液中,然后通过酶标仪检测菌液OD595。结果:表明大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液加入融合防御素基因BH的24小时、48小时和72小时三个时间段的真核表达产物后,其菌液中的细菌含量较对照组均显著降低。结论:本实验结果表明融合防御素基因BH的真核表达产物对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有较显著的抑菌作用,为探索防御素基因BH作为抗菌生物制剂替代传统抗生素奠定一定的基础。     

恶性疟原虫杂合45肽抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的初步表达

将人工合成的恶性疟原虫杂合４５肽基因克隆到表达载体ｐＷＲ４５０－１中，获得了重组质粒ｐＷＲＡ。将ｐＷＲＡ先转化到ＬＢ５０００修饰后，再转化到ＳＬ３２６１，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲＡ）。ｐＷＲＡ在ＳＬ３２６１中以β－半乳糖膏苷酶－杂合多肽抗原Ａ融合蛋白质（ＧＺ－Ａ）形式表达，表达量约７．２％。从ＳＬ３２６１（ｐＷＲＡ）中纯化的ＧＺ－Ａ可与抗ＧＺ－Ａ抗体反应，滴度为１：３２．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示在ＧＺ－Ａ相应位置出现特异条带。上述结果初步说明ＳＬ３２６１表达的ＧＺ－Ａ具有抗原性。连续传代ＳＬ３２６１（ｐＷＲＡ）未见质粒丢失及明显的毒性，为恶性疟口服活疫苗的制备打下了基础。     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

纳豆激酶原的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的　构建纳豆激酶原基因克隆 ,实现其在大肠杆菌中的表达。方法　从纳豆芽胞杆菌中分离纯化基因组DNA ,作为模板通过PCR扩增纳豆激酶原基因。运用重组DNA技术 ,构建表达质粒pESX 1,转化大肠杆菌JF112 5 ,温度诱导表达目的蛋白。结果　琼脂糖凝胶电脉及核苷酸序列分析证实 pESX 1为含纳豆激酶原基因的阳性克隆。在大肠杆菌中表达纳豆激酶原 ,经自体加工产生具有纤溶活性的纳豆激酶。结论　成功地构建了纳豆激酶原基因克隆 ,实现了在大肠杆菌中的表达。     

大肠杆菌guaC基因的克隆及高效表达

以E.coli MC4100染色体DNA为模板使用PCR扩增技术克隆了鸟苷酸还原酶基因guaC，该基因全长1044bp，编码相对分子质量为37ku的蛋白质。将该基因直接克隆于PET—16b质粒的T7启动于下游，得到质粒pEXP1。转化E．coli BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明，鸟苷酸还原酶的活性为不含质粒的宿主菌的80-85倍。     

枯草芽孢杆菌ATCC21216腺苷磷酸化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增枯草芽孢杆菌ATCC21216(His-)编码腺苷磷酸化酶的基因deoD(0.7 kb),测序表明与枯草芽孢杆菌168的deoD同源性为98.7%。将此基因插入质粒pET28a( )(5.3 kb)中,重组质粒pETdeoD在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达,表达量占总蛋白的27%。以HPLC方法测定腺苷磷酸化酶的比酶活为每毫克蛋白0.151 U。     

葡萄糖供应速率对大肠杆菌表达及分泌人表皮生长因子的影响

采用一株大肠杆菌BL 21(DE 3)[pBLMVL 2EGF]生产人表皮生长因子(hEGF),其中hEGF表达由PL启动子控制并通过phoA信号肽分泌到胞外。实验结果表明:诱导阶段以恒定比供应速率流加葡萄糖时,流加速率对hEGF的表达和分泌有很大影响。当葡萄糖比供应速率为0.122g/(g.h)时,hEGF表达水平最低,分泌效率最差,只有37.5%;随着葡萄糖比供应速率的增加,胞外和胞内hEGF比生产速率明显增加,当葡萄糖比供应速率为0.196 g/(g.h)时,单位菌体产生的hEGF水平最高(121.6 m g/g),其中分泌至胞外的hEGF占42%。此外,诱导前补充有机氮源有利于提高诱导初始hEGF的生产速率。     

NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中克隆和表达NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因。方法：通过PCR方法克隆来源于Alcali-genes eutrophus菌的NADPH依赖性的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB，将其克隆在大肠杆菌表达质粒pET28a中，进行PCR和DNA序列测定验证，并通过IPTG诱导表达。结果：通过PCR和DNA核酸序列分析，证实获得的基因片段为phbB全编码序列，phbB被克隆在大肠杆菌表达质粒pET28a中，重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导获得表达。结论：获得了Al-caligenes eutrophus菌的NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因，将其克隆在pET28a中，经诱导获得PhbB的表达，为进一步研究PhbB的理化性质和酶动力学性质奠定了坚实的基础。     

人可溶性APO2L/TRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的利用基因工程技术原核表达人可溶性APO2L并复性纯化成具生物活性形式。方法用PCR方法扩增APO2LcDNA(密码子114～281)并克隆至表达载体,重组体转化大肠杆菌JF1125摇瓶发酵,筛选高表达克隆于发酵罐经温度诱导表达。经盐酸胍溶解,空气氧化法稀释复性,超滤,Q-SepharoseFF阴离子交换柱层析等方法纯化人可溶性APO2L。利用流式细胞术检测产物对细胞的诱导凋亡活性。结果表达产物约占菌体总蛋白质的20%并在菌体内形成了包涵体,SDS-     

透明颤菌血红蛋白基因在产TRAIL蛋白大肠杆菌中的克隆表达

为解决大肠杆菌高密度发酵生产TRA IL过程中的供氧矛盾,提高菌体的发酵密度,在大肠杆菌中引入透明颤菌血红蛋白基因(vgb)。聚合酶链反应(PCR)检验和CO差光谱法检验表明:vgb基因能够在C 600(pBV 220-TRA IL)中表达并受溶氧调控,重组菌CTV具有良好的遗传稳定性。3.7 L发酵罐实验表明:在同样的发酵条件下,含vgb基因的重组菌CTV的最高菌体密度为对照菌的1.64倍,达到50.6 g/L,乙酸积累为对照菌的55.6%,TRA IL蛋白产量提高了70%,达到2.8 g/L。     

人神经营养素-3成熟区基因在大肠杆菌内的表达

【目的】应用基因工程方法制备人神经营养素 3(hNT 3)蛋白 ,为探讨其对阿尔茨海默病等中枢神经退行性疾病的治疗作用提供材料。【方法】将通过序列分析确定的hNT 3成熟区基因重组至原核表达质粒pBV2 2 0中 ,构建了重组表达载体 pBV/mhNT 3 ,在大肠杆菌中表达后 ,SDS PAGE法测定表达蛋白的相对分子质量 ,鸡胚背根节培养法检测其生物学活性。【结果】pBV/mhNT 3可在大肠杆菌中表达出一相对分子质量为 15× 10 3 的新蛋白 ,与hNT 3蛋白相对分子量相符。表达蛋白主要以包涵体形式存在 ,经纯化复性后 ,可明显促进鸡胚背根节的生长。【结论】人神经营养素 3成熟区基因可在大肠杆菌内高效表达hNT 3。     

人胶质细胞源性神经营养因子(hGDNF)成熟肽基因的克隆及原核表达

目的分离人胶质细胞源性神经营养因子(hGDNF)成熟肽基因，并在E．coil中获得表达。方法以人的白细胞基因组DNA为模板，合成特异引物，采用PCR技术分离得到hGDNF成熟肽基因，并构建表达载体pET-21a( )-hGDNF，转化大肠杆菌BL21(DE3)，分别用IPTG和乳糖诱导表达，SDS-PAGE电泳检测hGDNF蛋白表达。结果PCR扩增出了400bp的DNA片段，构建的表达载体pET-21a( )-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现400bp左右的条带，测序结果正确，用IPTG或乳糖诱导转化菌均有15kd大小的目的条带，表达的目的蛋白占菌体总蛋白30％以上，以包涵体形式存在。结论克隆得到人GDNF成熟肽基因并在大肠杆菌中得到了高效表达。