高血压大鼠全脑缺血再灌注后神经细胞DNA损伤修复的研究

目的 从DNA损伤和修复的角度探讨局灶性脑缺血再灌注后神经元凋亡的机制.方法 运用双肾双夹法建立肾血管性高血压大鼠模型,采用四血管法制备高血压大鼠全脑缺血再灌注模型,免疫组化法检测再灌注过程中鼠脑DNA损伤修复,蛋白XRCC1、TUNEL法检测凋亡.结果 与假手术组相比,脑缺血再灌注3h在缺血区皮质和海马CA1区XRCC1表达出现显著减低,这种减低一直持续到缺血再灌注24h(P＜0.05);再灌注24h缺血区皮质和海马CA1区神经细胞发生了凋亡,神经细胞XRCC1的表达强度与凋亡呈负相关.结论 脑缺血再灌注早期神经细胞XRCC1表达的减少可能导致机体对此时出现的DNA单链断裂修复的能力下降,造成了再灌注后期发生了凋亡.     

大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后Caspase-1的表达

目的研究Caspase-1在大鼠脑缺血／再灌注损伤中的作用。方法用Longa法制备大鼠大脑中动脉缺血（2h）／再灌注模型，HE染色观察梗死灶的形成，分别用TUNEL染色及免疫组化技术检测鼠脑缺血中心区及半暗带凋亡细胞与Caspase-1的表达。结果在缺血中心区Caspase-1及凋亡细胞主要见于缺血再灌注损伤早期；在缺血半暗带凋亡细胞与Caspase-1于缺血再灌注损伤早期表达不明显，于缺血再灌注24-48h则明显表达。结论细胞凋亡机制参与了缺血后迟发性神经元死亡，Caspase-1参与了其损伤过程。     

葛根素对大鼠全脑缺血再灌注后学习记忆障碍保护作用及其机制的研究

目的 探讨葛根素对大鼠全脑缺血再灌注后学习记忆能力的影响及其机制。方法 采用四血管阻断法建立SD大鼠全脑缺血再灌注损伤模型，暗回避反应法测定学习记忆能力，并应用免疫组织化学法、原位末端标记法，检测大鼠全脑缺血再灌注海马CA，区的bcl-2阳性细胞数、凋亡细胞数的动态变化。结果 (1)与再灌注组相比，葛根素组大鼠潜伏期明显延长；(2)脑缺血再灌注后，海马CA1区bcl-2蛋白的表达随再灌注时间不同而变化，缺血20min后再灌注24h达高峰，葛根素组bcl2蛋白的表达于相应的时间点明显增多；(3)脑缺血再灌注后海马CA1区神经元凋亡损伤在再灌注72h损伤最重，葛根素组可减少相应时点神经细胞凋亡数。结论 葛根素对全脑缺血再灌注后大鼠学习记忆能力具有明显的改善作用，其作用机制可能与通过上调bcl-2基因表达从而抑制或延迟脑缺血再灌注后细胞凋亡有关。     

鼠脑缺血神经元DNA单链断裂和双链断裂的比较性研究

目的　研究类缺血再灌注不同时间点神经元 DNA单链和双链断裂的损伤情况。判断早期 DNA损伤形式并讨论其意义。方法　以培养的皮质神经元类缺血再灌注模型 ,采用 TUNEL法和 Klenow法对缺血再灌注各时间点培养的神经元进行检测 ,并应用图像分析仪对 Klenow法检测结果进行平均灰度检测。结果　TUNEL法检测发现 ,未经缺血处理的对照组神经元阳性细胞比率为 ( 1 0 .5± 1 .2 9) % ,随缺血时间延长 ,其阳性细胞比率明显增加 ,在 6h时阳性细胞数达高峰 [( 86.5± 4.72 ) % ];Klenow法检测发现 ,未经缺血处理的对照组神经元平均灰度为 72 .4± 1 .0 0 ,在 2 h达高峰为 1 3 5 .5± 1 .3 1 ,之后又逐渐降低。结论　在培养的皮质神经元缺血再灌注模型中发现 ,DNA早期损伤以 DNA单链断裂为主 ,大约在再灌注 2 h达高峰 ,再灌注 6h则为 DNA双链断裂的高峰     

大鼠全脑缺血再灌注后额叶神经细胞凋亡与P^53蛋白表达的实验

目的 探讨大鼠全脑缺血再灌注后不同时间对额叶神经细胞凋亡及P^53蛋白表达的影响。方法 采用改良的Pulsineli 4-血管阻断(4-VO)方法建立SD大鼠急性全脑缺血模型，随机分为3组：正常组（n=7)；假手术组（n=49)；手术组（n=49)。缺血15min，分别于再灌注1、6、12、24、48、72h和7d断头取脑，采用TUNEL方法检测神经细胞凋亡，SP免疫组化方法观察额叶P^53蛋白的表达。结果 全脑缺血再灌注24h，可见少量TUNEL阳性细胞，再灌注48h可见较多TUNEL阳性细胞，72h出现大量TUNEL阳性细胞，7d明显减少。免疫组化染色：缺血组于再灌注24h可见少量P^53蛋白表达，48h达高峰，72h有所下降，7d明显下降，这种表达主要在细胞核内。结论 急性全脑缺血再灌注后的迟发性神经元坏死是以凋亡的方式发生的，全脑缺血再灌注后，额叶P^53蛋白表达增加，神经细胞凋亡和P^53蛋白的表达在一定时间内呈正相关。     

一氧化氮合酶在脑缺血再灌注中的双重作用

目的 探讨短暂脑缺血再灌注后大鼠脑内3型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的表达及作用，为脑缺血治疗提供理论依据。方法 采用免疫组织化学方法，用3型NOS的多克隆抗体检测大鼠局灶性脑缺血2h再灌注15min及22h NOS在脑内的表达情况。结果 大鼠脑缺血2h再灌注15min，在脑缺血边缘区的血管壁及神经细胞出现内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)上调表达；脑缺血2h再灌注22h，在脑梗死区内表达神经元型一氧化氮合酶(neuronal mitric oxide synthase，nNOS)的神经细胞减少，并出现表达诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的胶质细胞，同时梗死边缘区血管及神经细胞出现eNOS及iNOS的上调表达。结论 在短暂脑缺血再灌注早期，缺血区周围可能有eNOS相关的保护机制；亚急性期eNOS及iNOS的保护及损伤机制并存；因此，在短暂脑缺血早期恢复灌注后予选择性iNOS抑制剂及促进eNOS活性有可能减少迟发性神经损伤。     

动员自体骨髓干细胞对大鼠脑缺血／再灌注损伤及细胞凋亡的影响

目的 探讨应用G-CSF动员自体骨髓干细胞对大鼠脑缺血／再灌注损伤及细胞凋亡的影响。方法 应用线栓法制备大鼠局灶性大脑中动脉栓塞／再灌注(MCAO／R)模型，应用粒细胞集落刺激因子(G-GSF)刺激自体骨髓干细胞分裂增殖，并用5-溴脱氧尿核苷(Brdu)标记。观察大鼠神经病学评分，HE染色和免疫组化检测脑缺血区病理改变及CD34和Brdu阳性细胞，原位末端标记法(TUNEL法)观察细胞凋亡。结果 模型动员组大鼠脑缺血／再灌注后24h，大量炎症细胞浸润。再灌注后48h，缺血区可见CD34和Brdu阳性细胞；72h后CD34阳性细胞消失，而Brdu阳性细胞持续存在；模型未动员组缺血区无CD34和很少Brdu阳性细胞表达。48h缺血区新生毛细血管密度明显高于对照组。再灌注后24h细胞凋亡显著，1周时达高峰；与模型非动员组比较，模型动员组48h后细胞凋亡改善明显。结论 自体骨髓干细胞经G-CSF动员后可向大鼠脑缺血区趋化并可分化为神经元前体细胞，显著促进脑缺血区血管再生，降低脑神经功能评分，降低细胞凋亡率。     

垂体腺苷酸环化酶激活肽对大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血皮层p-JNK表达及神经细胞凋亡的影响

目的研究活化的c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的表达和垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）的影响、抑制细胞凋亡的机制。方法制成局灶性脑缺血再灌注损伤模型。72只大鼠随机分成假手术组、缺血再灌注对照组、PACAP治疗组。缺血开始时治疗组静脉注射PACAP 2．5μg。再灌注后各时间点处死取脑,进行HE染色、p-JNK免疫组化染色和TUNEL法检测神经元凋亡。结果不同时间点PACAP组神经细胞缺血性损伤较缺血再灌注对照组减轻。缺血再灌注对照组p-JNK分别在2、48h成2次表达高峰,凋亡细胞较多;PACAP组再灌注后pJNK表达下降,凋亡细胞减少。结论PACAP对局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用,可抑制细胞凋亡．部分依赖于其可下调p—JNK表达。     

超负荷血糖对脑缺血再灌注损伤大鼠脑细胞凋亡的研究

目的:探讨超负荷血糖对脑缺血再灌注损伤大鼠脑细胞凋亡及凋亡相关蛋白bax、bcl 2表达的影响。方法:用Wistar大鼠腹内注射链脲佐菌素,建立超负荷糖尿病大鼠模型,之后做大脑中动脉脑缺血再灌注模型。然后对大鼠进行脑梗死体积计算并且采用免疫组织化学方法检测超负荷血糖大鼠和正常大鼠脑缺血3h再灌注2 4hbax、bcl 2的表达,同时采用TUNEL法原位标记DNA片段,检测TUNEL阳性细胞的变化,并与假手术正常对照组比较。结果:超负荷血糖组梗死面积明显大于非超负荷血糖组;同时,前者bax的表达明显高于后者而bcl 2的表达则相反;糖尿病脑缺血再灌注损伤组TUNEL阳性细胞数明显高于非糖尿病脑缺血再灌注损伤和假手术对照组。结论:超负荷血糖加重了大鼠脑缺血再灌注损伤,超负荷血糖诱发的bax、bcl 2的表达异常促进了脑细胞的凋亡,可能是其加重脑缺血再灌注损伤的机制之一。     

重组人生长激素对脑缺血/再灌注损伤细胞凋亡及Nestin表达的影响

目的观察重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)对脑缺血/再灌注(ischemia-reperfu-sion,I/R)损伤后神经元细胞凋亡及Nestin表达的影响。方法54只SD雄性大鼠随机分成3组:假手术组、对照组(脑缺血/再灌注+生理盐水组)、治疗组(脑缺血/再灌注+重组人生长激素),每组18只。应用线栓法制作大鼠脑缺血/再灌注损伤模型,大脑中动脉缺血2h,分别在再灌注7d、14d、21d后处死,采用TUNEL法,免疫组织化学法检测顶叶皮质内7d、14d、21d的神经元凋亡和巢蛋白(Nestin)的表达。结果应用重组人生长激素干预后顶叶皮质在7d、14d、21d神经元凋亡数较大鼠对照组明显减少,Nestin的表达显著增加。结论rhGH的神经保护作用可能与抑制缺血神经元细胞凋亡和上调Nestin的表达有关。     

Enzymology of DNA replication and repair in the brain

A number of enzymes thought to be involved in DNA replication have been identified in the brain. These include single-stranded DNA-binding proteins, topoisomerases I and II, DNA polymerase , a protein that binds Ap₄A and might be classified as a DNA polymerase accessory protein, RNase H, DNA polymerase β, DNA ligase, an endo- and an exonuclease of unknown function, DNA methyl transferase and poly(ADPR) synthase.

In contrast, little is known about the enzymology of DNA repair in brain. The few enzymes identified comprise uracil-DNA glycosylase, DNA polymerase β, DNA polymerase (which in neurons is present only at immature stages), DNA ligase, poly(ADPR) synthase, and O⁶-alkylguanine-DNA alkyltransferase. In addition, an exonuclease acting on depurinated single-stranded DNA (tentatively listed here as 3′→5′ exonuclease), an endonuclease of unknown function as well as ill-defined acid and alkaline deoxyribonucleases also occur in brain.     

Characterization of DNA and RNA in circulating immunocomplexes in multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and normal controls

The total levels of DNA and RNA in serum immunocomplexes from multiple sclerosis (MS) patients and healthy control persons were compared. Furthermore, the levels of single-stranded DNA (ss DNA) and double-stranded DNA (ds DNA) in serum immunocomplexes from MS patients, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patients and controls were studied. The mean values of DNA and RNA were found to be elevated (P less than 0.01) in MS compared to the control means. Furthermore, the RNA/DNA ratio and the ratio ss DNA/ds DNA were decreased in MS. In contrast the ss:ds DNA ratio in ALS was increased. In ALS, however, the sum of ss DNA and ds DNA was lower (P less than 0.05) than the control mean value.     

DNA微阵列对DMD基因缺失检测的分析

目的:制备简易DNA微阵列检测DMD基因常见外显子缺失,作为一项新技术的方法学摸索,为开发更完善的DMD基因诊断芯片作准备。方法:应用分子克隆的方法扩增DMD基因18个常见易缺失外显子片段,以此作为探针制备出简易DNA微阵列,对DMD患者和健康对照的基因进行检测分析。结果:应用简易DNA微阵列检测出4例DMD患者具有不同程度的外显子缺失,其结果与PCR验证相符。对照满意。结论:DNA微阵列技术适用于DMD基因缺失检测,具有简便、高通量、灵敏等特点。     

电刺激小脑顶核对大鼠脑缺血/再灌注后氧化性DNA损伤的保护作用

目的预电刺激小脑顶核对大鼠脑缺血/再灌注后DNA氧化性损伤的保护作用, 以了解电刺激小脑顶核对实验性脑缺血及再灌注后神经保护的分子机制.方法健康雄性Wistar大鼠106只, 体重(250±30)g, 随机分为4组: (1) 单纯造模组; (2) 预刺激组; (3) 毁损小脑顶核组; (4) 假手术组.毁损小脑顶核组大鼠用鹅膏氨酸毁损两侧小脑顶核, 预刺激组、毁损小脑顶核组大鼠均以电刺激器刺激左侧小脑顶核, 前3组大鼠用线栓法成功制作可复流的MCAO模型2 h后再灌注.在再灌注后6、24、48 h将大鼠断头取脑, 取第3片提取DNA或RNA.DNA样品经酶解后上高效液相-电化学检测器检测8-ohdG.RNA样品通过RT-PCR的方法探测rOOG1 mRNA的表达.结果 (1) 大鼠脑缺血/再灌注后缺血区8-ohdG堆积.预刺激组再灌注各时点的8-ohdG含量均较单纯造模组及毁损小脑顶核组减少(P＜0.01); (2) 单纯造模组及毁损小脑顶核组脑缺血/再灌注后rOGG1的转录水平相似, 再灌注后6 h其rOGG1 mRNA几乎检测不到, 随时间的延长其转录水平有所增加, 但仍较假手术组及预刺激组低(P＜0.01).预刺激组再灌注后6 h其rOGG1 mRNA的表达量与假手术组无显著性差异, 但再灌注后24及48 h其rOGG1 mRNA的表达量均较假手术组增加(P＜0.01).结论 (1) 大鼠脑缺血/再灌注后脑缺血区存在DNA氧化性损伤; (2) 预电刺激小脑顶核减少缺血区神经元凋亡可能与DNA修复酶活性上调有关.     

Mitochondrial DNA copy number,damage, repair and degradation in depressive disorder

Abstract

Objectives: We aimed to explore mitochondrial DNA (mtDNA) copy number, damage, repair and degradation in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with depression and to compare the results with healthy subjects.

Methods: Total genomic DNA was isolated from PBMCs of 25 depressed and 60 healthy subjects before, immediately after, and 3?h after the exposure to H₂O₂. Evaluation of mtDNA copy number was performed using real-time PCR and 2-ΔCt methods. Semi-long run real-time PCR was used to estimate the number of mtDNA lesions.

Results: Baseline mtDNA copy number did not differ in cells of healthy and depressed subjects; however, it was negatively correlated with the severity of the episode. After a 10-min challenge with hydrogen peroxide (H₂O₂), depressed patients’ PBMCs exhibited slower changes of the copy number, indicating a lower efficiency of mtDNA degradation compared to controls. Moreover, a significantly higher number of mtDNA lesions was found in depressed patients at the baseline as well as at other experimental time points. mtDNA lesions were also elevated in depressed patient cells immediately after H₂O₂ exposure. Induction of oxidative stress had no significant influence on the cells of controls.

Conclusions: We are the first to show that impairment in repair and degradation of mtDNA may be involved in the pathophysiology of depression.     

Expression of the L11 neuropeptide gene in the Aplysia central nervous system

Neuron L11 in the abdominal ganglion of Aplysia californica is thought to be both cholinergic and peptidergic. In previous studies, we isolated a cDNA clone encoding the precursor for an L11 secreted protein(s) by differentially screening an abdominal ganglion cDNA library. We now report the isolation of genomic clones encoding the L11 cDNA sequences. Analysis of these clones reveals that the gene is present in a single copy per haploid genome. RNA blotting and cDNA cloning demonstrate that the L11 gene is expressed not only in the abdominal ganglion but in the head ganglia as well. To define the positions of cells expressing this gene and to follow their processes, we raised antibodies to synthetic peptides defined by the cDNA sequence. Histochemistry revealed about 100 neurons containing immunoreactive material. These cells arborize in the neuropil and are distributed throughout the central nervous system, representing about 0.5% of the Aplysia central neurons. In addition, cells in the abdominal ganglion send processes to the mantle floor at the base of the gill via the genital and branchial nerves. Our data suggest that this network of cells expresses the single L11 peptide gene.     

微卫星DNA vWA的多态性与精神分裂症的关联研究

目的　通过对微卫星DNAvWA多态性的分析 ,了解精神分裂症与vWA有关“等位基因”的关联情况。方法　对 32例精神分裂症患者和 12 3名随机人群采用PEProfilerplus系统进行PCR复合扩增 ,然后用ABI310型基因分析系统对扩增产物进行电泳和基因检测。结果　两组vWA“等位基因”频率符合Hardy Weinberg平衡定律 (P >0 0 5 ) ;精神分裂症组vWA 14的检出率为 17 2 % ,对照组的检出率为 33 3% ,两组有显著性差异 (P <0 0 5 ) ;精神分裂症组vWA 17的检出率为 31 2 % ,对照组检出率为 19 5 % ,两组有显著性差异 (P <0 0 5 ) ;其他各“等位基因”检出率两组无统计学显著差异 (P >0 0 5 )。结论　vWA“等位基因”vWA 14和vWA 17与精神分裂症的发病有关 ,在第 12号染色体上可能存在与精神分裂症相关的基因     

山东省双相情感障碍6号染色体基因扫描研究

目的 对双相情感障碍患者及正常对照者的6号染色体进行扫描,查找双相情感障碍的关联位点,进而定位易感基因.方法 在6号染色体上间隔10 cM(厘摩)遗传距离选择了20个微卫星遗传标记,对104例发病年龄≤20岁的双相情感障碍患者与1000例正常对照者组成的DNA混合样本分别进行了扫描.采用CLUMP软件进行统计学分析,逐一比较患者组与对照组等位基因频率的差异.结果 在D6S262位点发现患者组与对照组的等位基因频率差异有显著性意义(P<0.05).结论 山东省双相情感障碍患者与6号染色体上D6S262位点关联,基因突变或甲基化调控等致病因子可能位于其附近.     

DNA甲基化与胶质瘤

DNA甲基化在胶质瘤的发生、发展中起重要作用。多条重要通路相关基因启动子区域的CpG岛甲基化,其甲基化发生频率与胶质瘤的发生发展、组织类型和病理分级密切相关。某些基因的DNA甲基化可为胶质瘤的早期诊断提供分子生物学标志物,同时由于DNA甲基化具有可逆性,可以为胶质瘤基因治疗提供新的靶点,还可以用来评价预后。