首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到19条相似文献,搜索用时 93 毫秒
1.
目的:构建携带亚麻苦甙水解酶(lis)基因的重组真核表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,导入SGC-7901细胞中表达。方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该基因全长定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。用电穿孔法转染体外培养的SGC-7901细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达。用PCR检测lis转录水平的表达,用Western blot法验证lis蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-N1-lis重组质粒构建正确,重组质粒载体在SGC-7901细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有lis和EGFP的双重活性。结论:通过基因克隆方法成功地构建了pEGFP-N1-lis重组质粒载体,并且在SGC-790细胞中稳定表达。  相似文献   

2.
目的:构建带有flag标签的人akt1及豆蔻酰化akt1真核表达载体,并检测其在真核细胞中的表达及对细胞周期的影响.方法:应用RT-PCR的方法从人牙髓组织mRNA中扩增出akt1和myr-akt1基因,并在其C-末端带上含24bp的flag标签,克隆到pMD-18T载体并测序,再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测flag-akt1及flag-myr-akt1在细胞中的表达,同时流式细胞术观察细胞周期.结果:测序证实从人牙髓组织mRNA中扩增出的flag-akt1及flag-myr-akt1融合基因的序列以及读框全部正确;脂质体法转染COS-7后检测到预期目的蛋白的表达.流式细胞术的结果显示当AKT1过度表达以及过度活化时对COS-7细胞周期未产生明显影响.结论:成功构建了C-末端带flag标签的akt1及豆蔻酰化akt1真核表达载体,并使其在真核细胞COS-7中表达.但是AKT1对细胞周期的调控有待进一步研究.  相似文献   

3.
【目的】克隆人的钠/碘同向转运体(hNIS)基因可编码序列,并研究其在非甲状腺肿瘤细胞内的功能表达。【方法】利用逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR)从毒性弥漫性甲状腺肿(又称Graves病)病人的甲状腺组织中扩增得到NIS的可编码区基因,并克隆到T载体,测序后亚克隆到腺病毒载体穿梭质粒pDC316载体上,获得重组真核表达质粒载体pDC316-MCMV/hNIS。采用脂质体转染的方法,把pDC316-MCMV/hNIS重组质粒(实验组)或pDC316空质粒(对照组)分别导人到胰腺癌细胞株CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞和卵巢癌细胞株SK-OV-3细胞,转染后48h采用RT-PCR方法检测转染细胞内的hNISmRNA水平,转染后第2、3、4天分别检测肿瘤细胞对^125I的吸收功能。【结果】序列分析结果证实克隆片段与文献报道的hNIS基因eDNA序列完全一致。实验组转染后48h,在CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞及SK-OV-3细胞内均能检测到hNISmRNA高水平表达,对照组基本无hNISmRNA表达。转染后第3天细胞吸碘达到高峰,实验组CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞和SK-OV-3细胞对^125I的吸收量分别比对照组高24倍、17倍和13倍。【结论】从Graves病人的甲状腺组织中克隆的hNIS基因转染肿瘤细胞后,能使肿瘤细胞发挥高水平吸碘功能,为进一步运用放射性核素体内靶向治疗非甲状腺肿瘤奠定了基础。  相似文献   

4.
贾萌 《中原医刊》2011,(18):50-53
目的 构建AFP启动子介导的HSV/TK重组真核表达载体,并研究其荷瘤效应。方法PCR扩增AFP基因启动子、HSV—TK基因,将上述片断插入EGFP—N1载体的多克隆位点,从而构建甲胎蛋白启动子调控下HSV—TK基因重组表达载体pEGFP—AFP—TK。将其注射移植性H22肝癌模型C57BL/6J小鼠,并设转染空质粒pcDNA3.1组,观察两组的抗肿瘤效应。结果肝癌特异性真核表达载体pEGFP—AFP—TK构建成功,该真核表达载体免疫荷瘤小鼠后,pEGFP—AFP—TK组肿瘤细胞生长受到抑制,且该组生存期长于pcDNA3.1组(P〈0.05)。结论在受试动物体内可有效的诱导特异性抗肿瘤免疫应答。  相似文献   

5.
 【目的】克隆人的钠/碘同向转运体(hNIS)基因可编码序列,并研究其在非甲状腺肿瘤细胞内的功能表达。【方法】利用逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR)从毒性弥漫性甲状腺肿(又称Graves病)病人的甲状腺组织中扩增得到NIS的可编码区基因,并克隆到T载体,测序后亚克隆到腺病毒载体穿梭质粒pDC316载体上,获得重组真核表达质粒载体pDC316-MCMV/hNIS。采用脂质体转染的方法,把pDC316-MCMV/hNIS重组质粒(实验组)或pDC316空质粒(对照组)分别导人到胰腺癌细胞株CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞和卵巢癌细胞株SK-OV-3细胞,转染后48h采用RT-PCR方法检测转染细胞内的hNISmRNA水平,转染后第2、3、4天分别检测肿瘤细胞对^125I的吸收功能。【结果】序列分析结果证实克隆片段与文献报道的hNIS基因eDNA序列完全一致。实验组转染后48h,在CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞及SK-OV-3细胞内均能检测到hNISmRNA高水平表达,对照组基本无hNISmRNA表达。转染后第3天细胞吸碘达到高峰,实验组CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞和SK-OV-3细胞对^125I的吸收量分别比对照组高24倍、17倍和13倍。【结论】从Graves病人的甲状腺组织中克隆的hNIS基因转染肿瘤细胞后,能使肿瘤细胞发挥高水平吸碘功能,为进一步运用放射性核素体内靶向治疗非甲状腺肿瘤奠定了基础。  相似文献   

6.
目的:构建含有Arf6-T27N基因的重组真核表达载体,并检测Arf6-T27N蛋白在MDA-MB-231人乳腺癌细胞中的表达情况,以期为深入研究Arf6在乳腺癌细胞迁移中的作用机制奠定基础?方法:从含Arf6-T27N基因的真核表达质粒pXS-Arf6-T27N中扩增出Arf6-T27N基因,插入pEGFP-N1载体中构建成pEGFP-N1/Arf6-T27N,利用脂质体将其转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞?用新霉素筛选稳定表达的细胞系,Western blot确定重组蛋白表达,并用Boyden chamber小室实验检测转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞迁移能力的改变?结果:限制性内切酶鉴定和核酸定列测定证实成功构建了含Arf6-T27N的重组真核表达载体pEGFP-N1/Arf6-T27N?以重组质粒稳定转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞,能检测到Arf6-T27N蛋白的表达,且Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞的迁移?结论:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/Arf6-T27N,稳定转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞可检测到其蛋白水平的稳定表达,重组质粒介导的Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231细胞的迁移?  相似文献   

7.
目的:构建携带融合型自杀基因Fcy::Fur的荧光真核表达质粒pEGFP-N1-Fcy::Fur,并观察其在卵巢癌细胞中的表达.方法:应用基因重组技术,将pORF-Fcy::Fur中的Fcy::Fur目的基因亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-N1,以酶切1和测序鉴定重组质粒的正确性.应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入SKOV3细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)瞬时表达情况,用Western blot方法检测Fcy::Fur表达.结果:酶切和测序鉴定证实插入片段正确.细胞转染24 h后,荧光显微镜下观察到GFP表达.60%转染细胞发出绿色荧光.Western-blot检测到Fcy::Fur表达.结论:成功构建pEGFP-N1-Fcy::Fur荧光真核表达质粒,并可在卵巢癌细胞中有效表达,为卵巢癌基因治疗提供实验基础.  相似文献   

8.
目的:构建pcDNA3/GDNF真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达.方法:将GDNF逆转录聚合酶链式反应产物克隆至pcDNA3真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性.结果:酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3/GDNF表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的GDNF蛋白.结论:以脂质体介导  相似文献   

9.
目的 构建人肝细胞核因子-1α(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)真核表达载体,在体外表达并检测.方法 提取HepG2总RNA,用RT-PCR方法制备HNF1α cDNA,进行T-A 克隆.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切测序正确的重组质粒,回收HNF1α cDNA片段,将其亚克隆于pcDNA3.1( )载体的多克隆位点内.将构建好的真核表达质粒用脂质体法转染HepG2细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测HNF1α的表达. 结果正确构建了pcDNA3.1( )-HNF1α重组载体,并且在转染该质粒的HepG2细胞中检测出了HNF1α的高表达. 结论成功地构建了人HNF1α真核表达载体,其可以在体外表达.  相似文献   

10.
目的:构建人核心蛋白聚糖(DCN)真核表达载体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。 方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体pcDNA3分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体。 结果:PCR获得与预期大小一致的、约1 000 bp的特异性DNA片段,PCR产物与表达载体经双酶切后连接,构建重组载体pcDNA-dec,经双酶切鉴定及测序证实,人DCN基因cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论:成功构建人DCN真核表达载体pcDNA-dec。  相似文献   

11.
目的:构建真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1并稳定转染人宫颈癌细胞系Siha细胞,检测MKRN1表达情况及对细胞增殖和凋亡的影响.方法:用RT-PCR技术从人胚肾细胞株HEK293细胞中获得MKRN1的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-N1中;构建的重组质粒经脂质体介导转染Siha细胞;Western Blot鉴定MKRN1在Siha细胞中的稳定表达.结果:RT-PCR成功地扩增出一条约1477 bp的片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western Blot证明人MKRN1能以融合蛋白的形式在Si-ha细胞中稳定表达.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1,获得了稳定表达人MKRN1基因的Siha细胞克隆,为进一步研究人MKRN1的功能及其与细胞增殖及凋亡的关系提供了实验基础和重要的细胞模型.  相似文献   

12.
目的 构建pEGFP-N1-hSyntenin基因真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞CHG-5中的表达.方法 采用RT-PCR技术从人脑肿瘤组织中扩增hSyntenin,并将PCR产物双酶切后定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1-hSyntenin重组质粒.经过菌落PCR、双酶切及测序验证后,采用脂质体转染技术将pEGFP-N1-hSyntenin融合基因转染CHG-5细胞表达,G418筛选建立稳定表达hSyntenin的CHG-hS细胞系.采用荧光检测和免疫印迹技术分析hSyntenin在稳定转染的CHG-5细胞系中的表达.结果 菌落PCR鉴定出1个阳性克隆,阳性克隆经双酶切鉴定得到分别与载体和目的 片段大小一致的4.7 kb和897 bp的两条片段,测序证实目的 基因hSyntenin正确连接到pEGFP-N1的多克隆位点;pEGFP-N1-hSyntenin重组体稳定转染CHG-5细胞后,细胞荧光检测结果显示hSyntenin在CHG-5细胞质发出绿色荧光,免疫印迹检测可见32×103处的阳性条带.结论 成功构建pEGFP-N1-hSyntenin重组质粒,并在人脑胶质瘤细胞CHG-5中获得稳定表达.  相似文献   

13.
目的构建VEGF基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。方法根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组(MHCC97-200)、阴性对照组(MHCC97-NEGA)和空白对照组(MHCC97-空白)中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性。结果测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。  相似文献   

14.
目的:构建真核表达重组质粒pEGFP-N1-PLZF,并了解其在大鼠精原细胞中的融合蛋白表达情况.方法:参考分子克隆技术,采用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中扩增早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF),将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,并用双酶切、测序进行鉴定;将重组质粒用脂质体转染的方法导入精原细胞中,观察有无荧光的表达及用Western blot检测蛋白表达情况.结果:实验从大鼠睾丸组织中获取了编码plzf基因的全序列cDNA,产生了2 kb的目的插入片段,与pEGFP-N1载体连接后经酶切电泳鉴定及DNA测序证实序列正确;重组质粒转染精原细胞24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,并用Western 1blot:检测到106 kD目的蛋白的表达.结论:新构建的重组质粒pEGFP-N1-PLZF通过鉴定,结构正确.转染到精原细胞后能在其中表达,发挥功能,为后续研究奠定了基础,对研究PLZF调控精原细胞增殖和分化机制具有重要的意义.  相似文献   

15.

目的  构建含大鼠ASIC2a全长互补脱氧核糖核酸(cDNA)的绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-ASIC2a并转染至HEK293细胞,观察其表达和分布情况。方法  设计、合成ASIC2a基因引物,利用聚合酶链反应(PCR)技术,以现有质粒pcDNA3.1-ASIC2a为模板扩增出含有限制性内切酶(Xho Ⅰ与EcoRⅠ)酶切位点的ASIC2a基因片段与载体pEGFP-N1酶切后连接形成重组质粒pEGFP-N1-ASIC2a,并瞬时转染至HEK293细胞中,利用细胞膜片钳方法观察其表达电流的情况。为进一步明确其亚细胞定位,将质粒EGFP-N1-ASIC2a、pDsRed-Monomer-Mem和pDsRed2-ER共同转染至HEK293细胞中。结果  PCR扩增得到正确的ASIC2a基因片段,酶切鉴定和测序证实获得重组质粒pEGFP-N1-ASIC2a,并将其瞬转至HEK293细胞后,成功记录到ASIC2a同聚体电流。然后利用共转染的方法观察到,pEGFP-N1-ASIC2a主要在HEK293细胞内质网表达,细胞膜表达较少。结论  重组绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-ASIC2a构建成功,且在HEK293细胞中主要表达于内质网,为下一步研究ASIC2a的功能,特别是为ASIC2a在缺血性神经元损伤中的作用及其机制的研究奠定基础。

  相似文献   

16.
利荣乔  黄俏佳 《医学争鸣》2008,29(23):2127-2130
目的:构建人蛋白激酶B相瓦作用蛋白(AKTIP)基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体,观察其在GES-1细胞中的表达.方法:从健康人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增AKTIP cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,经酶切鉴定及DNA测序证实后,应用脂质体将AKTIP基因转染入人胃黏膜细胞株GES-1细胞中,通过Western Blot检测其在GES-1细胞中的表达情况.结果:重组载体经酶切鉴定和测序证实目的基因正确无误,Western Blot结果显示AKTIP基因在GES-1细胞具有良好的表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1/myc-His(-)A-AKTIP真核表达载体,并成功地在GES-1细胞中进行了表达,为进一步研究AKTIP的功能和结构奠定了基础.  相似文献   

17.
目的构建肺炎衣原体AR39株Cpn0308基因真核表达重组质粒,体外转染HeLa细胞并检测表达情况,为Cpn核酸疫苗的研制做准备。方法应用PCR技术从CpnAR39株基因组中扩增Cpn0308全长基因,重组入pcDNA3.1/HisA真核表达载体相应位点,进行酶切鉴定和序列分析后,运用脂质体介导重组质粒转染HeLa细胞,间接免疫荧光技术检测目的蛋白在真核细胞中表达情况。结果 PCR扩增得到393bp的特异性Cpn0308基因,筛选鉴定出pcDNA3.1/HisA-Cpn0308真核表达重组体,序列测定证实与GeneBank登录的CpnAR39株Cpn0308基因一致;间接免疫荧光法检测到重组质粒转染的HeLa细胞能够表达目的蛋白。结论成功构建pcDNA3.1/HisA-Cpn0308真核表达重组体,且该重组体能够在体外真核细胞中表达目的蛋白,为进一步研究CpnDNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。  相似文献   

18.
目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWP1(associated with protein kinase C related kinase 1,AWP1)表达载体,观察AWP1在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区,并将其重组于GFP表达载体pEGFP-C2中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导,转染293细胞。荧光显微镜观察AWP1在细胞内的表达和分布。结果 GFP-AWP1融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下,在不携带外源基因的空载体pEGFP-C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中;在重组质粒pEGFP-C2/AWP1转染的293细胞,绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP-AWP1融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。  相似文献   

19.
目的:以基因重组技术在真核细胞中表达人白细胞介素18(hIL-18)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)融合基因,并观察其生物学功能。方法:健康人单核细胞经RT~PCR扩增hIL-18后、T—A克隆。亚克隆至经NheⅠ、HindⅢ酶切的PCDNA3.1(+)/hTERT中,限制性内切酶验证后,挑选出含有目标基因的正确克隆。经限制性内切酶和DNA测序分析两个基因是否已经正确连接到真核表达载体中。将hTERT/hIL-18融合基因质粒脂质体介导转染3T3细胞中表达,经Western—blot验证目的基因表达产物,同时对转染细胞作免疫荧光染色。以ELISA检测转染细胞刺激KG-1细胞分泌了干扰素的能力,以流式细胞仪检测转染细胞抗MTX诱导凋亡的能力。结果:hTERT/hIL-18融合基因的真核表达载体PCDNA3.1(+)构建成功,经限制性内切酶验证和DNA测序及同源性对比分析,该基因片段与NCBI基因库hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均达到99.9%;而细胞转染后经Western—blot验证,hTERT/hIL-18融合蛋白的分子量约127kMr,与预期一致,荧光显微镜观察显示融合蛋白在细胞中弥散表达。此融合蛋白能刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素,并具有抗MTX诱导凋亡的生物学功能。结论:本实验构建的PCDNA3.1(+)/hTERT—hIL-18质粒能够在真核细胞中表达,并具有生物学功能,为进一步转染树突状细胞,研制肿瘤的治疗性疫苗提供基础。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号