人白细胞介素17基因的克隆及序列测定

应用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，参照国外发表的白细胞介素１７（ｈＩＬ－１７）ｃＤＮＡ全基因序列，利用自行设计合成的１对引物，从ＰＨＡ活化的正常人外周血单个核细胞中，扩增出ｈＩＬ＿１７ｃＤＮＡ基因，并定向插入ＰＵＣ１８载体，构建了ｈＩＬ－１７基因重组体，经ＤＮＡ序列测定，确认为ｈＩＬ－１７基因，这为是一步研究ｈＩＬ－１７的生物学功能提供可靠的物质基础。     

白细胞介素17 在狼疮性肾炎小鼠中的表达及抗白细胞介素17抗体的干预作用

 目的:探讨白细胞介素17（IL-17）在狼疮性肾炎(LN）小鼠中的表达及抗IL-17抗体的干预作用。方法:11周龄的雌性MRL/lpr小鼠36只随机分为实验组和干预组,另有同龄雌性昆明小鼠18只为对照组。干预组每只小鼠腹腔注射抗小鼠IL-17多克隆抗体20 μg,每2周1次,至实验观察点结束。各组分别于第1次给药后的24 h、14 d及28 d处死6只小鼠。光镜下观察肾脏病理情况,ELISA法检测小鼠血清IL-17的含量,免疫组化法检测肾组织IL-17的表达水平。结果:MRL/lpr小鼠肾小球系膜细胞及基质弥漫增生,肾小管上皮细胞颗粒及空泡变性,灶状萎缩,肾间质淋巴及单核细胞浸润伴纤维化;而干预组肾脏病理改变较实验组为轻。MRL/lpr小鼠的血清IL-17含量在实验组各时点均显著高于对照组（P<0.05）,而在干预组各时点均显著低于实验组（P<0.05）。IL-17在实验组小鼠肾小管上皮细胞中的表达明显增强,在各时点均显著高于对照组（P<0.05）;在干预组,IL-17在各时点的表达均显著低于实验组（P<0.05）。结论:IL-17在MRL/lpr小鼠血清与肾组织中的表达显著增加,而抗IL-17抗体可通过抑制IL-17的表达而抑制LN的炎症免疫反应,减轻肾脏病理损害。     

人白细胞介素4的原核表达、复性、纯化及生物学活性鉴定

用PCR方法从pORF-hIL4质粒中扩增重组人白细胞介素4(hIL-4)的基因,构建PQE60原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达。对表达的目的蛋白的可溶性进行鉴定,发现hIL-4基因表达产物在大肠杆菌中主要以不溶性包涵体形式存在,经过超声波破细菌、包涵体提取、洗涤处理后,用5mol/L盐酸胍变性溶解包涵体沉淀,上清稀释复性后透析,再经镍亲和层析进行纯化。纯化后的hIL-4进行TF-1细胞体外增生实验检测其生物学活性后,可用于人外周血树突状细胞的体外诱导培养。     

白细胞介素17

白细胞介素17是近两年来发现的新的细胞因子,人白细胞介素17由活化的CD_4~+T细胞产生,并以一种类似于促炎症性的方式作用于其它细胞和组织。本文着重介绍白细胞介素17的发现过程及其核酸蛋白质结构特征,并简明扼要地阐述其已知的生物学活性。     

白细胞介素17

白细胞介素１７（ＩＬ－１７）是一种源于Ｔ细胞的细胞因子，有着广泛的生物学活性和参与机体免疫调节等作用，可通过复杂的作用机理调节细胞的生长，分化和增殖，诱导活性物质产生，本文综述了ＩＬ－１７的命名，克隆测序，表达，组织分布，生化特性及生物学活性，发现ＩＬ－１７还可以诱导ＩＬ－６，ＩＬ－８的产生和增强ＩＣＡＭ－１的表面表达能力，这可能表明ＩＬ－１７在炎下形成和参与机体免疫调节与防御系统中起一定的作用，     

小鼠白细胞介素3活性检测影响因素的初步研究

<正> 白细胞介素3(Interleukin 3,IL_3)是近年来发现的淋巴因子之一。关于小鼠白细胞介素3活性检测目前有四种方法:(1)20-α羟基类固醇脱氢酶法;(2)鼠骨髓细胞集落形成试验;(3)鼠骨髓细胞H_3-TdR掺入法;(4)IL_3生长依赖株32D增殖~3H-TdR掺入法。这些检测方法以32D依赖株~3H-TdR     

白细胞介素17在大鼠哮喘模型肺组织的表达及意义

白细胞介素17(IL-17)是由激活的T淋巴细胞产生的细胞因子，研究证实该细胞因子能增强气道上皮细胞内细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达。支气管哮喘不仅气道粘膜存在大量T淋巴细胞浸润，气道内炎性细胞包括中性粒细胞及嗜酸细胞聚集也增多，而ICAM-1在炎性细胞气道聚集中发挥重要作用。     

人白细胞介素18的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化人白细胞介素18（hIL-18)，制备兔抗人白细胞介素18多克隆抗体，方法：用RT－PCR扩增出hIL-18的cDNA克隆到原核表达载体pJW2中，转化大肠杆菌JM101中诱导表达并纯化。用纯化的人白细胞介素18免疫新西兰兔制备多克隆抗体，结果：克隆得到序列正确的IL-18 cDNA，与载体连接后转化入大肠杆菌JM101中诱导表达并成功纯化，并用纯化的人白细胞介素18成功制备了兔抗人白细胞介素18多克隆抗体。结论：制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

人白细胞介素33基因的克隆表达及其生物学活性的研究

目的:克隆人白细胞介素33(human interleukin-33,hIL-33)基因,构建高效稳定的大肠杆菌表达菌株,并对纯化的蛋白进行生物活性的初步测定.方法:采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术从人成纤维细胞总RNA中反转录并扩增得到人的成熟肽IL-33基因;采用基因克隆技术,构建PQE30-IL33重组质粒;采用Ni2+-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白;应用ELISA方法检测纯化蛋白诱导产生的IL-4和IL-5.结果:SDS-PAGE分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的25%,Western印迹法证实重组蛋白为特异性蛋白,纯化后纯度达到95%以上.表达的重组蛋白IL-33促进人外周血单个核细胞产生IL-4和IL-5,浓度分别达到(106±2.6)pg/ml和(1 220±10.4)pg/ml,而未刺激对照组的浓度只有(32.2±2.3)pg/ml和(67.3±2.5)pg/ml.结论:成功构建出hIL-33的原核表达载体,诱导产生蛋白能诱导IL-4和IL-5细胞因子的产生.     

Cloning, expression and immunoassay detection of ferret IFN-gamma

Ferrets (Mustela putorius furo) develop symptoms upon influenza infection that resemble those of humans, including sneezing, body temperature variation and weight loss. Highly pathogenic strains of influenza A, such as H5N1, have the capacity to cause severe illness or death in ferrets. The use of ferrets as a model of influenza infection is currently limited by a lack of species-specific immunological reagents. Interferon gamma (IFN-gamma) plays a key role in the development of innate and adaptive immunity and the regulation of Th1-type immune responses. Here we describe the cloning of the full-length cDNA for ferret IFN-gamma. Multiple sequence alignment of the predicted amino acid sequence with those of other species indicates that the predicted ferret protein shares the highest identity with Eurasian badger IFN-gamma. We raised two hybridoma clones expressing monoclonal antibodies against recombinant ferret IFN-gamma capable of detecting IFN-gamma protein derived from mitogen-stimulated ferret PBMCs by immunoblotting, ELISA and ELISPOT assay. Finally, an ELISA utilizing the ferret-specific antibodies detected elevated levels of IFN-gamma in serum samples from H3N2 influenza A-infected ferrets.     

重组人aFGF的克隆、表达及活性测定

目的：为了研究酸性成纤维细胞生长因子（aFGF)的临床应用价值,将其开发为多肽类药物。方法：以RT－PCR从人肺成纤维细胞钓取人aFGF全编码区cDNA,使用Pichia分泌型酵母表达系统表达重组人aFGF,重组蛋白经肝素亲和层析纯化后,以NIH3T3成纤维细胞增殖实验、鸡胚尿囊膜法血管生成实验及小鼠创伤愈合实验检测活性。结果：重组人aFGF蛋白在酵母系统中得到较高量表达（12mg/L,并能够促进NIH3T3增殖、促进血管增生、促进伤口愈合,而且这种活性能被受体（FG－FR）的细胞外段拮抗。结论：重组人aFGF在酵母系统中实现高效表达,并具有很好的生物学活性。     

λ轻链抗原的克隆与表达

应用分子生物学方法克隆、表达λ轻链基因、探索有效制备高纯度轻链抗原技术。方法：应用已有pComb3抗－HBsFab表达载体,用限制性双酶切去除Fab中的H链基因,合成互补于两酶点粒端的短核苷酸链,并加以多聚组氨酸编码基因,通过复性,连接酶连接构建λ轻链表达载体。结果：重构建载体的单酶切、电泳表明分子的大小为4．4kb,已切除H链基因;阳性株经IPTG诱导表达上清的免疫转印结果显示为抗轻链血清反应带,电泳位置与轻链的分子量吻合,成单一区带;直接ELISA结果表明,正确连接的克隆表达上清与抗Polyhis血清发生反应,结论：用生物工程技术克隆表达λ轻链具有简便,实用的特点,更易获得高纯度产品,是可以替代常规轻链抗原提纯的理想方法。     

Cloning, expression, and catalytic activity of Helicobacter hepaticus urease

Helicobacter hepaticus causes disease in the liver and lower intestinal tract of mice. It is strongly urease positive, although it does not live in an acidic environment. The H. hepaticus urease gene cluster was expressed in Escherichia coli with and without coexpression of the Helicobacter pylori nickel transporter NixA. As for H. pylori, it was difficult to obtain enzymatic activity from recombinant H. hepaticus urease; special conditions including NiCl2 supplementation were required. The H. hepaticus urease cluster contains a homolog of each gene in the H. pylori urease cluster, including the urea transporter gene ureI. Downstream genes were homologs of the nik nickel transport operon of E. coli. Nongastric H. hepaticus produces urease similar to that of H. pylori.     

土拨鼠白细胞介素15的克隆、表达和活性分析

目的对土拨鼠白细胞介素15（woodchuck interleukin 15，wIL-15）分子进行克隆、表达并鉴定其活性，为进一步研究IL-15在嗜肝病毒感染中的作用以及评价IL-15用于治疗慢性HBV感染奠定基础。方法用IL-15的保守引物将wIL-15基因克隆、测序并进行分析，构建wIL-15的原核表达质粒，在大肠杆菌中表达，分离纯化后用淋巴细胞增殖试验检测其生物学活性。结果wIL-15的完整编码序列为489nt（与其他哺乳动物IL-15编码序列的同源性高达78％～87％），编码162AA长度的前体蛋白（与其他哺乳动物IL-15蛋白的同源性高达70％～80％），其信号肽为N端的48AA，成熟蛋白由114AA组成。土拨鼠IL-15与灵长动物IL-15的同源性高于啮齿动物。带有His-tag的成熟蛋白，可以在大肠杆菌中表达，分离纯化后，可以刺激Con A活化的小鼠脾细胞和土拨鼠PBMC增殖（其SI值可高达10以上），并存在明显的剂量依赖性。结论（1）wIL-15与其他哺乳动物IL-15高度同源，并且与灵长类动物的IL-15更接近。（2）wIL-15可以在大肠杆菌中表达，并在纯化后能刺激小鼠和土拨鼠淋巴细胞增殖，表现出较好的生物学活性。     

携带mIL-12基因逆转录病毒载体的构建与表达

目的：构建携带小鼠IL-12（ mouse IL-12, mIL-12）基因逆转录病毒表达载体pLXmIL-12SN并检测其在B16F10细胞中的表达。 方法： 应用限制性内切酶从载体pGCp35-IRES-p40SN中酶切p35-IRES-p40（mIL-12基因片段）及将逆转录病毒载体pLXSN切开，通过连接酶连接，通过序列测定确定p35-IRES-p40基因片段正向插入载体pLXSN中的重组子，将阳性重组子转染B16F10细胞并通过RT-PCR方法检测mIL-12基因在B16F10细胞中表达。 结果： 成功地构建表达载体pLXmIL-12SN并可在mRNA水平检测到mIL-12基因在B16F10细胞中表达。 结论： 载体pLXmIL-12SN的构建成功及可在B16F10细胞中表达，为mIL-12基因治疗眼部疾病的研究奠定了基础和提供了借鉴。     

人新型干扰素K的基因克隆、表达、纯化及其抗病毒活性的初步研究

目的制备人干扰素κ(hIFN-κ)并初步研究其生物学活性.方法克隆hIFN-κ的cDNA并根据大肠埃希菌的密码子偏好性人工合成了hIFN-κ基因,在大肠埃希菌DH5α中高效表达、纯化后测定了rhIFN-κ的多种生物学活性,包括抗病毒活性、抗细胞增殖活性、种属特异性以及NK细胞调节活性.结果成功地获得了高纯度的rhIFN-κ,纯度在90%以上.利用WISH-VSV系统检测rhIFN-κ的抗病毒活力为2.0×106 IU/mg.与rhIFN-α2b的比较发现,rhIFN-κ无论在抗病毒活性、细胞生长抑制,还是在促NK细胞活性方面均弱于前者.结论rhIFN-κ在不同种属来源细胞上的抗病毒活性因种属来源而异,不同的病毒对rhIFN-κ的敏感性是不同的.     

小鼠蛋白激酶CK2β亚基的克隆、表达及活性测定

通过反转录PCR从NIH 3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA；构建其表达质粒并经测序证明其编码小鼠蛋白激酶CK2β亚基，但与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异，与大鼠、猪、兔和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列则一致。将其在表达菌BL21(DE3)中诱导表达，出现一26kDa分子量蛋白过度表达，表达蛋白占菌体总蛋白的31．7％，但大多数以不溶形式存在。Western blot鉴定表明：过度表达产物能与抗人CK2β亚基抗体发生特异性免疫反应。当CK2α和β亚基以1：1摩尔比混合时，构成性的CK2全酶显示出最大活性，直接表明CK2β亚基对CK2α有激活作用。这些结果有力地证明了克隆表达的重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2β亚基。     

人新型干扰素κ的基因克隆、表达、纯化及其抗病毒活性的初步研究

目的制备人干扰素κ(hIFNκ)并初步研究其生物学活性。方法克隆hIFNκ的cDNA并根据大肠埃希菌的密码子偏好性人工合成了hIFNκ基因,在大肠埃希菌DH5α中高效表达、纯化后测定了rhIFNκ的多种生物学活性,包括抗病毒活性、抗细胞增殖活性、种属特异性以及NK细胞调节活性。结果成功地获得了高纯度的rhIFNκ,纯度在90%以上。利用WISHVSV系统检测rhIFNκ的抗病毒活力为2.0×106IU/mg。与rhIFNα2b的比较发现,rhIFNκ无论在抗病毒活性、细胞生长抑制,还是在促NK细胞活性方面均弱于前者。结论rhIFNκ在不同种属来源细胞上的抗病毒活性因种属来源而异,不同的病毒对rhIFNκ的敏感性是不同的。     

人内皮抑素克隆表达及对血管内皮细胞生长的抑制作用

目的　获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的重组人内皮抑素 (recombinanthumanen dostatin)。方法　从肝细胞中分离总RNA ,经反转录多聚酶链反应 (RT PCR)得到endostatin全基因。用原核细胞表达载体构建了pBV2 2 0 /endostatin重组质粒 ,经DNA测序确认后 ,将其转化大肠杆菌DH5α进行表达、初步纯化及活性测定。结果　经SDS PAGE分析 ,表达产物相对分子质量 (Mr)约 2 0× 10 3,薄层扫描显示表达产物可达细菌总蛋白的 30 %。结论　经生物学活性测定 ,表达蛋白能够抑制碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对牛毛细血管内皮细胞 (BCEC)的增殖作用